CN110964817A - 基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法 - Google Patents

基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别是指基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax‑5a基因灵敏度的方法。所述功能化发夹探针序列如SEQ ID No.1所示，该功能化发夹探针包括G‑四链体片段和3’凹陷末端区域。包含功能化发夹探针的检测组合物，还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。本发明的发夹探针引入了G‑四链体序列；同时形成了3’凹陷末端，便于核酸外切酶Ⅲ的剪切，降低了背景信号的干扰；并且设计的发夹探针是能够识别目的基因的多功能实体；通过引物和DNA聚合酶的作用，实现了目标基因的循环利用，放大了检测信号，降低了检测下限，使得最低检测限达60.1 fM。

Description

基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测 Pax-5a基因灵敏度的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是指基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法。
背景技术
Pax-5是在造血系统中发现的唯一paired-box（PAX）家族成员，它可以分为Pax-5a，Pax-5b，Pax-5c，Pax-5d和Pax-5e。其中，Pax-5a是最重要的，Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5对于B细胞分化和发育非常重要，其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而，目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。
光谱法有荧光光谱法和紫外光谱法。由于其测试时操作简单，数据稳定性较为理想，所以运用范围较为广泛，也是核酸检测中不可或缺的手段。其中荧光光谱法需要额外标记荧光物质，过程繁琐，且存储环境较为严苛；而紫外光谱法则不需要进行繁琐的标记处理。
G-四链体是由四个鸟嘌呤（G）碱基首尾相连通过π-π堆积进一步形成的特殊类型的DNA二级结构。近年来，G-四链体受到科学家们越来越多的关注，并已被应用于抗癌治疗的研究。G-四链体与小分子结合后形成的G-四链体DNAzyme具有高稳定性和过氧化物酶模拟活性的优点，其广泛用于生物传感器的构建。例如，G4序列与氯化血红素结合可以催化双氧水氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺，能够产生被检测到的紫外吸收峰。
现有的检测Pax-5基因突变检测方法，种类比较少且灵敏度低。
发明内容
本发明提出一种基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，解决现有检测Pax-5基因突变检测方法，种类比较少且灵敏度低的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针，所述功能化发夹探针序列如SEQ ID No.1所示，该功能化发夹探针包括G-四链体片段和3’凹陷末端区域，其空间二级结构为：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
其中，区域Ⅰ为G-四链体序列，区域Ⅱ为目标基因结合序列。
包含功能化发夹探针的检测组合物，还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。
所述引物序列如SEQ ID No.2所示，DNA聚合酶为Klenow Fragment。
利用包含功能化发夹探针的组合物提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，步骤如下：
（1）将发夹探针、引物以及梯度浓度的Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育1小时后，再加入5 U DNA聚合酶、10 mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，37℃孵育2小时，然后加热使酶失活；
（2）经过步骤（1）处理的溶液冷却至室温，加入100 U核酸外切酶Ⅲ，37℃孵育1小时，然后加热使酶失活；
（3）经过步骤（2）处理的溶液冷却到室温时，加入氯化血红素溶液，37℃孵育35-40分钟；
（4）向经步骤（3）处理的溶液里加入HEPES缓冲液、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10-15分钟后，采用紫外可见分光光度计检测350-750 nm吸收峰的变化；
（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
（6）将以双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列分别作为目标物，检测灵敏度。
所述步骤（1）中发夹探针的浓度为1-10 μM、引物的浓度为1-10 μM、Pax-5a的标准溶液的梯度浓度为10 μM，1 μM，100nM，10 nM，1 nM，100pM，10pM，0 pM。
所述步骤（1）中发夹探针、引物、Pax-5a的标准溶液、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸的量分别为：2 μL、2 μL、1 μL、0.4 μL和1 μL。
所述步骤（2）中核酸外切酶Ⅲ的加入量为2μL。
所述步骤（3）中氯化血红素溶液的浓度为50 μM、加入量为2μL。
所述步骤（4）中HEPES缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.2，加入量为96 μL；双氧水的浓度为20mM，加入量为10 μL；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为10mM，加入量为10 μL。
提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，所述步骤（6）中双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列是分别对Pax-5a基因的两个、四个、六个或全部序列进行错配设计，Pax-5a基因序列如SEQ ID No.3所示。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的功能化发夹探针的G4序列能够被一定浓度核酸外切酶Ⅲ切割。目标基因Pax-5a打开HP后，通过DNA聚合酶和引物的作用，使其循环打开HP；然后，通过核酸外切酶Ⅲ的剪切作用，使得发夹探针中G4区域得以脱离。G4序列与氯化血红素结合形成的复合物可以催化双氧水氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺，产生被检测到的紫外吸收峰。当不存在Pax-5a时，核酸外切酶Ⅲ可以消化HP的非单链片段，包括双链茎和G4片段，使得3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化被抑制，因此检测到较低的光信号。紫外吸收峰值的变化与目标基因浓度在一定范围内存在线性相关关系。该方法基于核酸外切酶Ⅲ和G4功能化的发夹探针的传感系统机制，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。
2、本发明所设计的发夹探针引入了G-四链体序列；同时形成了3’凹陷末端，便于核酸外切酶Ⅲ的剪切，降低了背景信号的干扰；并且设计的发夹探针是能够识别目的基因的多功能实体；本发明中设计的发夹探针，制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存；通过引物和DNA聚合酶的作用，实现了目标基因的循环利用，放大了检测信号，降低了检测下限，使得最低检测限达60.1 fM。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于核酸外切酶Ⅲ和功能化的发夹探针高度灵敏检测Pax-5a基因方法的原理示意图。
图2为实施例1测得的验证实验方案可行性的紫外吸收光谱图。
图3为实施例1对标准样检测结果，A：实施例1紫外吸收峰变化与检测目标物浓度对应的紫外吸收光谱图；B：紫外吸收峰峰值变化与检测目标物浓度折线图，插图为紫外吸收峰峰值与检测目标物浓度对数的线性图。
图4为实施例1的选择性考察结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法：
（1）将2 μL浓度为10μM的发夹探针（HP），2 μL浓度为10μM的引物和1 μL浓度分别为10μM，1 μM，100 nM，10 nM，1 nM，100 pM，10 pM，0 pM的Pax-5a的标准水溶液在反应管中混合，补充CutSmart缓冲液(20 mMTris-HAc, 50 mMKAc, 10 mM MgAc2, 0.1 g/mL BSA, pH7.9)，37℃孵育1小时；然后将0.4 μL浓度为5 U/μL的Klenow Fragment，1 μL浓度为10 mM的dNTPs加入，37℃恒温孵育2小时，然后75℃加热20分钟以使酶失活；
（2）待步骤（1）中的溶液冷却到室温时，加入2μL浓度为4 U/μL核酸外切酶Ⅲ，37℃孵育1小时，然后75℃加热20分钟以使酶失活；
（3）待步骤（2）中的溶液冷却到室温时，将2μL浓度为50 μM的氯化血红素溶液加入，37℃孵育40分钟；
（4）在步骤（3）中的溶液里加入浓度为10 mM的HEPES缓冲液96 μL，浓度为20 mM的双氧水10 μL和浓度为10 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液10 μL，反应10分钟后，采用紫外可见分光光度计检测吸收峰的变化，测试波长范围为350 -750 nm。
（5）相同条件下，以双碱基错配序列（MT1）序列如序列如SEQ ID No.4所示，四碱基错配序列（MT2）序列如SEQ ID No.5所示，六碱基错配序列（MT3）序列如SEQ ID No.6所示和完全错配序列（Non）序列如SEQ ID No.7所示分别作为目标物，考察该方法的选择性。
图1是本发明所涉及的一种基于核酸外切酶Ⅲ和功能化的发夹探针高度灵敏检测白血病基因Pax-5a方法的原理示意图，目标基因Pax-5a打开HP后，通过DNA聚合酶和引物的作用，使其循环打开HP；然后，通过核酸外切酶Ⅲ的剪切作用，使得发夹探针中G4区域得以脱离。G4序列与氯化血红素结合形成的复合物可以催化双氧水氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺，产生被检测到的紫外吸收峰。当不存在Pax-5a时，核酸外切酶Ⅲ可以消化HP的非单链片段，包括双链茎和G4片段，使得3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化被抑制，因此检测到较低的光信号。紫外吸收峰值的变化与目标基因浓度在一定范围内存在线性相关关系。该方法基于核酸外切酶Ⅲ和G4功能化的发夹探针的传感系统机制，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。
图2是G-四链体/hemin复合物催化双氧水氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的紫外吸收光谱。图中曲线a为只含有hemin的空白对照组，曲线b为不含有目标基因的反应液测得的吸收曲线，曲线c为含有发夹的检测液测得的吸收曲线，曲线d为含有目标基因的反应液测得的吸收曲线。由图2可以看出，目标基因存在和不存在时的紫外吸收峰值差值明显，信噪比达到2.4倍，验证了本实验方案的可行性。
图3A是按照实施例1对标准样检测得的紫外吸收峰与检测目标物浓度对应的紫外可见光谱图。在2.5×10-13M至2.5×10-8M的目标基因浓度范围内，紫外吸收峰峰值与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，检测限低至60.1 fM（图3B）。
考虑到实用性的要求，考察该方法对特定目标物的特异性和选择性，选择以双碱基错配序列（MT1）序列如SEQ ID No.4所示，四碱基错配序列（MT2）序列如SEQ ID No.5所示，六碱基错配序列（MT3）序列如SEQ ID No.6所示和完全错配序列（Non）序列如SEQ IDNo.7所示作为干扰物对传感系统的影响。实验结果证实该传感系统对不同的干扰组分响应较低或基本没有响应，对特定目标物响应明显，说明其具有良好的选择性和特异性（图4）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 江西师范大学
<120> 基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法
<160> 7
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（56）
<400> 1
actgagtctc cccatgccag tctgggttag ggttagggtt agggagactg gcatgg 56
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（9）
<400> 2
aatgtagac 9
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> gene
<222> （1）…（27）
<400> 3
cacttggcat ggggagactc agtcgta 27
<210> 4
<211>27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（27）
<400> 4
cacttgacac ggggagactc agtcgta 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（27）
<400> 5
cacttgacac ggggatactc aatcgta 27
<210> 6
<211>23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（23）
<400> 6
cacttgacac ggtgatacgc aatcgta 27
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（31）
<400> 7
cgatatcgga tcatgctact catgcagcta g 31

Claims (10)

1.基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针，其特征在于：所述功能化发夹探针序列如SEQID No.1所示，该功能化发夹探针包括G-四链体片段和3’凹陷末端区域，其空间二级结构如：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，区域Ⅰ为G-四链体序列，区域Ⅱ为目标基因结合序列。
2.包含权利要求1所述的功能化发夹探针的检测组合物，其特征在于：还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。
3.根据权利要求2所述的包含功能化发夹探针的检测组合物，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID No.2所示，DNA聚合酶为Klenow Fragment。
4.利用权利要求2或3所述的包含功能化发夹探针的组合物提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将发夹探针、引物以及梯度浓度的Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育1小时后，再加入5 U DNA聚合酶、10 mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，37℃孵育2小时，然后加热使酶失活；
（2）经过步骤（1）处理的溶液冷却至室温，加入100 U核酸外切酶Ⅲ，37℃孵育1小时，然后加热使酶失活；
（3）经过步骤（2）处理的溶液冷却到室温时，加入氯化血红素溶液，37℃孵育35-40分钟；
（4）向经步骤（3）处理的溶液里加入HEPES缓冲液、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10-15分钟后，采用紫外可见分光光度计检测350-750 nm吸收峰的变化；
（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
（6）将以双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列分别作为目标物，检测灵敏度。
5.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（1）中发夹探针的浓度为1-10 μM、引物的浓度为1-10 μM、Pax-5a的标准溶液的梯度浓度为10 μM，1 μM，100nM，10 nM，1 nM，100pM，10pM，0 pM。
6.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（1）中发夹探针、引物、Pax-5a的标准溶液、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸的量分别为：2 μL、2 μL、1 μL、0.4 μL和1 μL。
7.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（2）中核酸外切酶Ⅲ的加入量为2μL。
8.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（3）中氯化血红素溶液的浓度为50 μM、加入量为2mL。
9.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（4）中HEPES缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.2，加入量为96 μL；双氧水的浓度为20mM，加入量为10 μL；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为10mM，加入量为10 μL。
10.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（6）中双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列是分别对Pax-5a基因的两个、四个、六个或全部序列进行错配设计。
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