CN111471743A

CN111471743A - 一种基于脲酶的microRNA检测试剂盒

Info

Publication number: CN111471743A
Application number: CN202010416742.8A
Authority: CN
Inventors: 林锋; 邓锐杰; 张婷; 曾珍; 朱云柯; 刘成武; 梅建东
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-07-31
Also published as: CN112501248B; CN112501248A

Abstract

本发明公开了一种microRNA let‑7a的检测试剂盒，属于分子检测领域。所述试剂盒包括分子识别试剂和信号转换试剂；所述分子识别试剂是一类嵌有银离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个胞嘧啶碱基C，在银离子的作用下相互配对；所述信号转换试剂由脲酶、尿素和苯酚红组成。当样品中存在let‑7a时，let‑7a与错配链竞争性结合底物链，置换出错配链，银离子游离出来，抑制脲酶活性，尿素‑苯酚红溶液体系始终保持黄色；若没有let‑7a，尿素‑苯酚红溶液体系呈红色。本发明的试剂盒具有良好的稳定性、灵敏度和便捷性。

Description

一种基于脲酶的microRNA检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测领域。

背景技术

癌症又称恶性肿瘤，是威胁世界健康的一个关键因素，是世界范围内由疾病引起死亡的一个主要原因。microRNAs是一种序列长度为18nt～24nt的小型非编RNA基因产物。microRNA通常通过与靶信使RNA(mRNAs)的3’端非翻译区相互作用来调节蛋白质水平，而且往往在癌症组织中的表达是异常的。

let-7族的microRNA能够下调RAS、HMGA2和MYC等致癌蛋白的表达，因而通常被认为是抑癌基因，在非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织中的表达远远低于正常组织中表达，常常被作为肺癌生物传感器的目标检测物。

成熟microRNA的长度较短，加之其具有序列同源性，序列差异只有一到两个碱基，因此，microRNA检测具有很大的挑战性。目前，microRNA的检测方法主要有实时荧光定量RT-PCR、定量即时聚合酶链锁反应qRT-PCR、Northern印迹分析和微阵列芯片技术。但是，这些检测所需的仪器设备价格昂贵、实验室条件要求严格，检测过程操作复杂、检测时间长，操作技术要求高，难以在一般条件的科研机构或者临床单位开展。近年来，恒温核酸扩增技术在microRNA检测领域逐渐发展起来。滚环扩增(RCA)、环介导恒温扩增(LAMP)以及指数扩增反应(EXPAR)等恒温扩增技术的发展使得microRNA的检测达到了较高的灵敏度，检测成本也降低了，但大多数恒温扩增技术反应时间较长，反应机理较为复杂，难以满足临床检测的需求。因此，开发操作简单、便携，能对样品进行实时现场分析，适用于临床应用和个体医疗的microRNA检测的研究热点。

DNA碱基与重金属离子间存在错配反应，其基本原理是：原本不配对的碱基X与X，在加入离子M后，会形成X-M-X的结构而形成化学键，互补配对。比较常见的配对方式包括T-Hg²⁺-T配对，以及C-Ag⁺-C配对。该原理经常用于检测重金属离子，例如：文献【A simple“molecular beacon”-based fluorescent sensing strategy for sensitive andselective detection of mercury(ii).Chemical Communications,2011,47(44):12158.】公开了一种汞离子检测方法，用到两种分子：茎环结构DNA分子甲和单链DNA分子乙；分子甲的茎部分2个末端分别修饰荧光基团和淬灭基团，正常情况下不会发出荧光。但当汞离子存在时，对前述两种分子的混合溶液进行加热变性，再降温复性，即可得到T-Hg²⁺-T碱基对，部分分子甲无法恢复成原来的发夹结构，其荧光基团和淬灭基团相互远离，荧光基团即可释放荧光。

目前，DNA碱基与重金属离子间的错配反应原理尚未见用于核酸分子的检测。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种全新的let-7a检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种microRNA let-7a的检测试剂盒，它包括分子识别试剂和信号转换试剂；

所述分子识别试剂是一类嵌有银离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个胞嘧啶碱基C，在银离子的作用下相互配对(即形成C-Ag⁺-C碱基对)；所述嵌有银离子的DNA双链分子中，银离子、底物链和错配链的终浓度物质的量之比为1：1：1；

所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，或在SEQ ID NO.1基础上向5’端延伸2～8个碱基；所述错配链序列如SEQ ID NO.6所示，或在SEQ ID NO.6基础上向3’端延伸2～8个碱基；错配链延伸的长度与底物链延伸的长度一致；

所述信号转换试剂包括：a)脲酶；b)尿素和苯酚红的混合溶液；

脲酶和尿素的摩尔浓度比例为1:(10⁷～2×10⁷)；苯酚红和尿素的摩尔浓度比为：1：(5×10²～3×10³)。

如前述的检测试剂盒，脲酶浓度为100mM；

和/或，每50μL尿素和苯酚红的混合溶液的配置方法为：取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

如前述的检测试剂盒，所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，错配链序列如SEQ IDNO.6所示；

或，所述底物链序列如SEQ ID NO.2所示，错配链序列如SEQ ID NO.7所示。

如前述的检测试剂盒，所述底物链序列如SEQ ID NO.3所示，错配链序列如SEQ IDNO.8所示。

如前述的检测试剂盒，所述底物链序列如SEQ ID NO.4所示，错配链序列如SEQ IDNO.9所示。

如前述的检测试剂盒，所述底物链序列如SEQ ID NO.5所示，错配链序列如SEQ IDNO.10所示。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒还包括let-7a标准品。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒中的试剂被固定到试纸上，试纸分为不同区域，尿素和苯酚红、分子识别试剂、脲酶分别位于3个不同区域；

所述试纸为滤纸，优选的，为水性微孔滤纸。

优选的，试纸以普鲁兰多糖为保护剂，以隔绝氧气。

一种非诊断目的的microRNA let-7a的检测方法，它是使用权利要求1～8任一所述试剂盒检测let-7a的方法。

如前述的方法，包括如下步骤：

1)分子识别试剂与样本在室温接触30～90min；

2)脲酶与步骤1)中分子识别试剂在室温接触40min；

3)尿素和苯酚红溶液与步骤2)中脲酶接触30min；

4)肉眼观察颜色变化，或测定560nm波长下的紫外吸收强度值；

步骤2)中，脲酶和银离子的摩尔浓度比例为1:(10～50)。

本发明的试剂盒工作原理是：分子识别试剂中，底物链和错配链通过Ag⁺错配形成C-Ag⁺-C碱基对，分子识别试剂与let-7a接触后，let-7a会与错配链竞争性结合底物链(无需加热变性再降温复性)，置换出错配链，打开C-Ag⁺-C碱基对，释放Ag⁺。Ag⁺会使脲酶活性降低，此时尿素得不到有效降解，含有尿素、苯酚红的混合溶液保持原有的黄色；当环境中没有let-7a，Ag⁺无法得到释放，脲酶活性正常，含有尿素、苯酚红的混合溶液的颜色会转为红色。

本发明的试剂盒是对DNA碱基与重金属离子间的错配反应原理的创新运用。其与现有技术的区别主要在于：现有技术中检测信号的产生依赖错配碱基从无到有；而本发明借助逆向思维，其检测信号的产生依赖错配碱基从有到无。

本发明的试剂盒具有如下有益效果：

1)灵敏度高。可检测浓度低至2.808pM的let-7a。

2)特异性好。可特异性识别错配2个碱基以上的目标分子。

3)检测方便。检测过程不需要加热，检测结果肉眼可见，且能将试剂固定到试纸上，进一步简化操作。

需要指出的是，本发明中“置换”、“置换反应”指由正确配对的碱基置换出错配碱基(C-Ag⁺-C)的过程，并非化学领域中定义的“置换反应是单质与化合物反应生成另外的单质和化合物的化学反应”。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是采用本发明提供的比色感器检测let-7a的原理示意图。

图2是实施例2绘制的标准曲线。

图3是实施例3中检测病人肺癌组织和癌旁组织中let-7a的结果。

图4是实施例4中比色传感器对不同的C-C错配数量的测试结果。

图5是实施例5中该比色传感器对let-7a的特异性选择性测试结果。

图6是试纸检测原理示意图。

图7是实施例6中检测病人肺癌组织和癌旁组织中let-7a的结果。

具体实施方式

实施例1制备双链DNA溶液

本实施例中，制备双链DNA溶液，该双链DNA在检测miRNA过程中起到分子识别的作用。

首先合成底物链和错配链，其序列如表1所示。

toehold结构，指双链DNA末端无法配对的单链部分。表1中，底物链/错配链序列的划线部分为toehold结构，链的序号均以toehold长度定义。具有相同序号的底物链和错配链各自成对，相互配合使用，例如序号3nt的底物链(sSub-3nt)与序号3nt的错配链(mSub-3nt)配合使用。

toehold紧靠未划线序列的碱基都是C，C与C无法互补配对，因此整个每对sSub和mSub的toehold区域无法进行碱基互补配对，除非加入了银离子。

表1 底物链(sSub)和错配链(mSub)的序列

合成双链DNA(分子识别试剂)的具体方法如下：

将5μL浓度为2μM的Ag⁺,5μL浓度为1μM的DNA底物链(sSub-5nt)，5μL浓度为1μM的DNA错配链(mSub-5nt)加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，置于PCR管中，保持总体积30μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，形成C-C结构(银离子作用下胞嘧啶配对)，底物链和错配链互补形成双链结构，该过程如图1中第一个箭头所示。

重复前述操作，制备得到若干份双链DNA溶液，每份30μL。

实施例2绘制标准曲线

本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下：

①取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液30μL，向其中加入10μL浓度为0nM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

②取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

③将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值；

④依次使用let-7a浓度分别为100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、200nM、500nM、1000nM的乙let-7a溶液代替步骤①中的使用的let-7a溶液,重复步骤①,②,③的操作,测定紫外吸收值，以let-7a溶液浓度为横坐标，以该let-7a溶液浓度下的紫外吸收为为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为y＝-0.064x+0.4907，LOD(最低检测限)＝2.808pM其中，y代表紫外吸收度，x代表let-7a浓度，标准曲线如图2所示。

小结：本实施例一方面得到了标准曲线；另一方面验证了本发明试剂盒灵敏度高，LOD为2.808pM。

实施例3临床检测

本实施例中，检测来自5位肺癌病人癌症组织和癌旁组织中let-7a的浓度，并分析其显著性差异，步骤如下：

(1)取5位的肺癌病人癌症组织和癌旁组织的，依次记作1#～5#，癌症组织记为C，癌旁组织记为A，提取1#～5#组织的总RNA，制成RNA水溶液。

(2)RNA水溶液的let-7a检测

①取实施例1中制备的含有C-C结构的双链DNA溶液两份(30μL)，依次向其中加入1#A和1#C样品溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

③将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该肺癌病人1#A和1#C组织let-7a的紫外吸收强度值；

④依次使用2#～5#肺癌病人的癌症组织和癌旁组织代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①,②,③的操作，得到2#～12#肺癌病人样品的紫外吸收光度值并记录；

⑤将1#～5#肺癌病人的癌症和癌旁组织总RNA溶液的紫外吸收光度值分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各病人癌症组织和癌旁组织中let-7a的浓度。

结果：如图3所示，其中有十个病人的癌症组织和癌旁组织中let-7a的含量具有显著性差异。由图中误差条(error bar)还可知晓，每次重复检测的结果差别很小，表明检测可重复性良好。

结论：本发明的方法或者其衍生的试剂盒可用于临床检测，得到可靠的检测结果。

实施例4双链DNA C-C错配数量对结果的影响

本实施例中，检测不同的C-C错配数量的紫外吸光度值

①将5μL浓度为2μM的Ag⁺,5μL浓度为1μM的DNA底物链，5μL浓度为1μM的DNA错配链加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，置于PCR管中，保持总体积30μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，底物链和错配链互补形成双链结构形成含有一个C-C结构的双链DNA溶液，底物链和错配链的序列如表1中sSub-5nt,mSub-5nt。

②取①中制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，依次向其中加入溶液10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

③取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

④将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录let-7a的紫外吸收强度值；

⑤依次使用sSub-C₂、sSub-C₃代替①中的mSub-5nt,mSub-C₂、mSub-C₃代替①中mSub-5nt,重复步骤①,②,③,④的操作，得到紫外吸收光度值并记录。sSub-C₂、sSub-C₃、mSub-C₂、mSub-C₃的序列如表2所示。

表2 C-C错配数为2或3的序列

名称	SEQ ID NO.	序列
			sSub-C<sub>2</sub>	11	<u>TGCAC</u>AACTATACAACCTACTACCTCA
sSub-C<sub>3</sub>	12	<u>CGCAC</u>AACTATACAACCTACTACCTCA
			mSub-C<sub>2</sub>	13	TAGGTTGTATAGTT<u>CTCCA</u>
mSub-C<sub>3</sub>	14	TAGGTTGTATAGTT<u>CTCCC</u>

注：划线部分为toehold。

结果：实验结果如图4所示，C-C错配数量越高，阳性对照和阴性对照之间的信号差别就越小。

结论：C-C错配数越低，检测信噪比越高；C-C错配数为1时，检测检测信噪比最高。

实施例5对靶分子的选择特异性

本实施例中，检测本发明方法对let-7a的选择特异性。

(1)用超纯水分别配制2μM的sSub-1nt、sSub-3nt、sSub-5nt、sSub-7nt、sSub-9nt、mSub-1nt、mSub-3nt、mSub-5nt、mSub-7nt、mSub-9nt的DNA溶液和2μM的let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g核酸溶液；并使用实施例1的方法将所有的sSub和mSub成对制备成双链DNA溶液。

③取10μL浓度为2.5mM苯酚红的溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

⑤依次使用let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和超纯水代替②中的let-7a,重复步骤②,③,④的操作，得到紫外吸收光度值并记录。

let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g的序列如表3所示。

表3 被检miRNA的序列

名称	SEQ ID NO.	序列
			let-7a	15	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
let-7b	16	UGAGGUAGUAGGUUGUgUgGUU
			let-7c	17	UGAGGUAGUAGGUUGUAUgGUU
let-7d	18	aGAGGUAGUAGGUUGcAUAGU
			let-7e	19	UGAGGUAGgAGGUUGUAUAGU
let-7f	20	UGAGGUAGUAGaUUGUAUAGUU
			let-7g	21	UGAGGUAGUAGuUUGUAcAGU

注：序列中小写字母为相对于let-7a突变的碱基。

结果：

如图5所示，在检测正确的miRNA样本(let-7a)时，随着toehold长度的增加，检测信号强度逐渐降低；其中，toehold长度在1～7nt时，检测信号强度都处于高位。对于不同toehold长度的双链DNA，均能够有效区分水和miRNA样本。

当用于辨别正确的miRNA样本(let-7a)与双碱基突变的错误miRNA样本(let-7b，let-7g)时，本发明仍具有较好的特异性。

当用于辨别正确的miRNA样本(let-7a)与单碱基突变的错误miRNA样本(let-7c，d，e，f)时，本发明的特异性明显降低，仅能区分let-7a与某些特定单碱基突变的miRNA，例如let-7d。

结论：

本发明对2碱基以上突变的miRNA样本能有效辨别，具有良好的特异性。

实施例6试纸的制备与检测

本实施例中，使用试纸检测取自12个肺癌病人癌症组织和癌旁组织中let-7a的浓度。

1.试纸的制备

(1)在滤纸上打孔，制作如图6所示的折纸。

(2)制备反应液。

①制备50μL浓度为400nM的Ag⁺溶液。

②将5μL浓度为4μM的Ag⁺,5μL浓度为4μM的DNA底物链，5μL浓度为4μM的DNA错配链加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，加水20μL置于PCR管中，保持总体积50μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，形成C-C结构，底物链和错配链互补形成双链结构。

③制备50μL浓度为12nM的脲酶溶液。

④取20μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，20μL浓度为5M的尿素水溶液，5g普鲁兰多糖室温下加入到10μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。当尿素-苯酚红混合溶液加入到试纸中时，普鲁兰多糖起到隔绝氧气，减缓氧化，延长试纸有效期限的作用。

(3)将反应液加到相应的孔中，制作检测试纸。

在②面相应的孔中分别加入4μL超纯水，4μL步骤①制得的Ag⁺溶液，剩余两个孔中分别加入4μL步骤②制得的含有C-C结构的DNA双链。在③面的四个孔中分别加入4μL步骤③制得的脲酶溶液。在④面的四个孔中分别加入4μL步骤④制得的尿素-苯酚红混合溶液，制成检测试纸。

制备过程如图6左栏所示。

2.检测(如图6右栏所示)

1)加水到试纸的①面和②面的孔里；

2)折叠试纸，使②面和③面上面的孔成对贴紧，室温静置30min；此步骤目的是混合DNA双链和脲酶；

3)加样到①面的其中两个孔里，将①面折叠到②③面上，室温静置30min；此步骤目的是将样本与DNA双链混合，如有let-7a存在，let-7a会将DNA双链中的错配链置换掉，C-C中嵌合的银离子会逃离双链结构，进而抑制脲酶活性；

4)折叠①②③面到④面，室温静置20min；此步骤引入尿素-苯酚红混合溶液，使其与脲酶接触；

5)观察颜色，黄色表示检测到let-7a，红色表示未检测到let-7a。

3.结果

实验结果如图7所示，3～5#病人癌旁组织检测到let-7a，其癌组织未检测到let-7a；1～2#病人癌旁组织和癌组织均未检测到let-7a。

4.结论

本发明方法中的试剂集成到试纸后，操作简便，结果可读性强。

实施例7置换反应条件测试

本实施例中，对比本专利let-7a置换条件与其他置换条件的置换效果。

A组：

①取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

②取30μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，30μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到90μL分子水中，得到尿素-苯酚红混合溶液150μL。

③取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与①混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值为0.108±0.002。

B组：

④取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置15min(本专利置换时间为30～90min)进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

⑤取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与④混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值0.638±0.011。

C组：

⑥取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL超纯水，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

⑦取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与④混合，室温下反应30min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录不加let-7a时反应混合液的紫外吸收强度值0.742±0.012。

对比A、C组的紫外吸收强度值，发现在本发明的置换条件(置换时间为30～90min)下，置换效果明显；而对比B、C组，在本发明的置换条件外，置换效果很差，几乎不发生置换；结合A、B、C三组，发现，在本发明探索出的置换条件可以得到理想的置换效果。

综上，本发明的miRNA检测方法具有较高的灵敏度、特异性和稳定性；无需借助可编程加热装置、荧光检测装置，检测过程方便快捷；可集成到试纸上，可进一步简化检测操作。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种基于脲酶的microRNA检测试剂盒

<130> GYKH1094-2020P019902CC20JS023

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caactataca acctactacc tca 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaactata caacctacta cctca 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcacaacta tacaacctac tacctca 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgcacaac tatacaacct actacctca 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgatacaca actatacaac ctactacctc a 31

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taggttgtat agttc 15

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taggttgtat agttctg 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taggttgtat agttctgca 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taggttgtat agttctgcat c 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taggttgtat agttctgcat cgt 23

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgcacaacta tacaacctac tacctca 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcacaacta tacaacctac tacctca 27

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taggttgtat agttctcca 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taggttgtat agttctccc 19

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 15

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 16

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 17

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 18

agagguagua gguugcauag u 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 19

ugagguagga gguuguauag u 21

<210> 20

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 20

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 21

ugagguagua guuuguacag u 21

Claims

1.一种microRNA let-7a的检测试剂盒，其特征在于：它包括分子识别试剂和信号转换试剂；

所述分子识别试剂是一类嵌有银离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个胞嘧啶碱基C，在银离子的作用下相互配对；银离子、底物链和错配链的终浓度物质的量之比为1：1：1；

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：

脲酶浓度为100mM；

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：

所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，错配链序列如SEQ ID NO.6所示；

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.3所示，错配链序列如SEQ ID NO.8所示。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.4所示，错配链序列如SEQ ID NO.9所示。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.5所示，错配链序列如SEQ ID NO.10所示。

7.如权利要求1～6任一所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括let-7a标准品。

8.如权利要求1～6任一所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的试剂被固定到试纸上，试纸分为不同区域，尿素和苯酚红、分子识别试剂、脲酶分别位于3个不同区域；

所述试纸为滤纸，优选的，为水性微孔滤纸；

优选的，试纸以普鲁兰多糖为保护剂，以隔绝氧气。

9.一种非诊断目的的microRNA let-7a的检测方法，其特征在于：它是使用权利要求1～8任一所述试剂盒检测let-7a的方法。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)分子识别试剂与样本在室温接触30～90min；

2)脲酶与步骤1)中分子识别试剂在室温接触40min；

3)尿素和苯酚红溶液与步骤2)中脲酶接触30min；

4)肉眼观察颜色变化，或测定560nm波长下的紫外吸收强度值；

步骤2)中，脲酶和银离子的摩尔浓度比例为1:(10～50)。