CN116083520A - 一种基于银与脲酶的靶分子检测系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子检测领域，涉及一种基于银与脲酶的靶分子检测系统及方法，先利用修饰有识别链1的基底捕获靶分子，或利用修饰有识别链2的银粒子捕获靶分子，然后根据捕获靶分子的基底能否再与识别链2结合捕获银粒子或根据捕获靶分子的银粒子能否再与基底上的识别链1结合判断基底是否捕获了银粒子；润洗掉游离的银粒子后，向基底加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子。本发明的检测方法具有较好的灵敏度、选择性、通用性、便捷性。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，涉及一种基于银与脲酶的靶分子检测系统及方法，基于固相界面和表面功能化技术，在靶分子存在时捕获或不捕获银粒子，加入过氧化氢后是否释放出大量Ag+抑制下游脲酶的催化反应，利用酸碱指示剂产生可检测的信号，灵敏度高，适用范围广，成本低。
背景技术
抗体、肽适体、核酸适配体是生物传感器常用的三类识别元件，被应用于生物学、食品、环境、安全等领域的检测以及医学领域的诊疗。可检测的靶分子包括细胞、微生物、蛋白质、多肽、核酸、有机小分子、金属离子等。基于这些识别元件建立高灵敏的检测方法，主要有如下几类：1.基于信号酶，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶以及具有这些酶活性的纳米材料；2.基于核酶、脱氧核酶、核酸酶(聚合酶，内切酶和外切酶)等；3.基于功能纳米材料进行控制释放信号分子等。然而目前生物传感器在某些方面仍存在一些不足需要改进。例如，成本高、灵敏度低、信噪比低、需要对酶进行化学修饰而导致酶活性降低等。
Ag+能够几乎定量地抑制脲酶的活性。目前利用银与脲酶作用建立的检测方法是基于碱基C与Ag+形成碱基错配封闭银离子。在靶分子作用下，调控释放或者结合Ag+。例如中国专利202011644377.2公开了一种可视化核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括分子识别试剂和信号转换试剂；所述分子识别试剂是嵌有金属离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个或多个C或者T碱基，在金属离子的作用下相互配对；所述信号转换试剂由脲酶、尿素和pH指示剂组成；当样品中存在靶标核酸时，靶标核酸序列与错配链竞争性结合底物链，置换出错配链，金属离子游离出来，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解；若无靶标核酸，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加，可通过pH指示剂表征。但现有技术存在以下缺点：(1)灵敏度低，难以满足实际样品检测需求；(2)适用范围小，不适用于很多基于核酸的检测，不适用于基于抗体、肽适体的检测；(3)易受待测样品中其它物质的干扰。
现有必要研发一种基于固相界面，适用于检测核酸或利用核酸检测其他靶分子的分析检测技术。
发明内容：
本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，提供一种新的基于银与脲酶的靶分子检测方法，基于固相界面和表面功能化技术，在靶分子存在时捕获或不捕获银粒子，加入过氧化氢后是否释放出大量Ag+抑制下游脲酶的催化反应，利用酸碱指示剂产生可检测的信号，灵敏度高，适用范围广，成本低。
为了实现上述目的，本发明还提供一种基于银与脲酶的靶分子检测方法，先利用修饰有识别链1的基底捕获靶分子，或利用修饰有识别链2的银粒子捕获靶分子，然后根据捕获靶分子的基底能否再与识别链2结合捕获银粒子或根据捕获靶分子的银粒子再与基底上的识别链1结合判断基底是否捕获了银粒子；润洗掉游离的银粒子后，向基底加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子。
根据设计的识别链1与识别链2与靶分子结合情况，具体检测方法分为以下3种情况：
(1)当设计识别链1和识别链2分别能与待测靶分子的两端结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链1的基底室温孵育；修饰有识别链1的基底用于捕获待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链2的银粒子，室温孵育，润洗去除未捕获的银粒子；修饰有识别链2的银粒子用于被靶分子捕获从而产生信号；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则有被捕获的银粒子，进而有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解；若无靶分子，则无银粒子被捕获，从而没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子；
(2)当设计识别链1能优先与靶分子结合且结合后两者都不与识别链2结合，而在无靶分子时识别链1能与识别链2结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链1的基底室温孵育；修饰有识别链1的基底用于捕获待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链2的银粒子，室温孵育，润洗去除未捕获的银粒子；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则识别链1捕获靶分子，由于识别链1被靶分子占据，从而识别链2未能与识别链1结合，因此没有被捕获的银粒子，没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加；若无靶分子，则有银粒子被捕获，有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子；
(3)当设计识别链2能优先与靶分子结合且结合后两者都不与识别链1结合，而在无靶分子时识别链2能与识别链1结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链2的银粒子室温孵育；修饰有识别链2的银粒子用于捕获待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链1的基底，室温孵育，润洗去除未捕获的银粒子；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则识别链2捕获靶分子，由于识别链2被靶分子占据，从而识别链1未能与识别链2结合，因此银粒子未能被基底捕获，没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加；若无靶分子，则有银粒子被捕获，有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子；
所述基底为磁珠或微孔板；所述磁珠为10nm-5μm直径大小的表面功能化的含铁磁珠或含钴或含镍或含稀土元素的磁珠；所述微孔板为中吸附或高吸附的微孔板。
所述识别链1的一端进行功能化修饰与基底表面的功能化修饰基团相结合，另一端与识别链2或靶分子结合。
所述识别链2的一端进行功能化修饰与银粒子结合，另一端与识别链1或靶分子结合。
所述识别链1进行功能化修饰为生物素修饰；所述基底表面的功能化修饰为链霉亲和素修饰。
所述识别链2进行功能化修饰为巯基修饰，通过Ag-S键结合银粒子。
所述银粒子为其中一个维度上尺寸在1nm至5μm的含银材料，包括银纳米球、银纳米片、银原子或银离子聚集体。
所述靶分子为核酸、适配体、抗体、肽适体。
所述识别链1为核酸或核酸适配体或抗体或肽适体；识别链2为核酸或核酸适配体或抗体或肽适体。
所述靶分子为核酸链HIV-1，序列如SEQ ID NO:3所示；所述识别链1和识别链2的序列如SEQ ID NO:1-2所示。
所述向润洗磁分离后的基底中加入过氧化氢、脲酶、尿素和酸碱指示剂后的溶液中，过氧化氢的终浓度为10-50mmol/L；脲酶的终浓度为0.1-10nmol/L；尿素的终浓度为10-200mmol/L；酸碱指示剂的终浓度为1-200μmol/L。所述酸碱指示剂，优选地，为苯酚红。
本发明还提供一种基于银与脲酶的靶分子检测系统，包括基底、分子识别试剂和信号转换试剂；所述基底为磁珠或微孔板；所述分子识别试剂包括识别链1和识别链2；所述信号转换试剂包括：a)银粒子；b)过氧化氢；(c)脲酶；d)尿素和酸碱指示剂的混合液；识别链1修饰在基底表面；识别链2修饰在银粒子表面；靶分子能与识别链1和识别链2中的至少一个结合。
本发明还提供利用所述方法检测靶分子的试剂盒。
所述靶分子为核酸链HIV-1时，本发明的检测方法的工作原理如下：
通过磁珠表面修饰的链霉亲和素与识别链1上的生物素作用，将识别链1(BioHI)修饰在磁珠表面上；通过Ag-S化学键，在银纳米球表面修饰上识别链2(P-AgS)；在离心管中，分别加入缓冲液、修饰有BioHI的链霉亲和素磁珠和待测样品，室温孵育1.5h后，当待测样品中存在靶分子链HIV-1时，样品中的靶分子核酸链HIV-1的部分序列与链霉亲和素磁珠上的BioHI基于碱基互补形成双链；然后加入修饰有P-AgS的银纳米球，室温孵育1.5h后，HIV-1的另一部分序列与P-AgS基于碱基互补形成双链，从而捕获银纳米球；在磁分离辅助下，润洗去除未捕获的银纳米球；向捕获银纳米球的磁珠中，加入双氧水氧化分解银纳米球，释放出大量Ag+；随后磁分离去除磁珠，保留含Ag+的上清液；将含Ag+的上清液加入至脲酶溶液中，反应10min后，脲酶的活性被抑制；随后加入尿素和苯酚红的混合液，此时尿素不能被脲酶有效分解，溶液呈近中性，溶液中苯酚红显示为原有的黄色；
当待测样品中没有靶分子HIV-1时，则修饰P-AgS的银纳米球不能被捕获；加入过氧化氢后，没有Ag+释放，脲酶活性高，尿素正常降解为氨和二氧化碳，溶液pH增大，苯酚红溶液颜色变为粉红色。苯酚红可以用其它酸碱指示剂替代。
本发明与现有技术相比，优点有：
(1)灵敏度高，检测限可以达到fmol/L级别的靶分子核酸链；
(2)适用范围广，不但适用于基于核酸的检测，也适用于基于抗体、肽适体等的检测；
(3)由于采用磁珠或孔板，实际样品中的潜在干扰物质可通过润洗去除，因此受干扰小，特异性高；
(4)所用的酶为脲酶，是从天然植物中提取，而非微生物表达，成本较低；
(5)检测体系保持恒温，不需要复杂的升降温过程；
(6)可兼容现有酶标仪等通用检测设备，检测通量高，仪器设备成本低。
综上，本发明创新运用了Ag+对脲酶活性的强烈抑制作用。本发明与现有技术的不同在于：现有技术利用靶分子核酸链与底物链结合释放出基于C-Ag+-C封闭的Ag+，释放的Ag+量较少，灵敏度较低，且易受样品基质的干扰；而本发明基于纳米材料制备和表面功能化技术，捕获银纳米颗粒，加入过氧化氢后能够释放出大量Ag+，灵敏度高，适用范围广，成本低。
附图说明：
图1为本发明涉及的实施例1检测方法的原理示意图。
图2为本发明涉及的实施例1中银纳米球修饰P-AgS前后的吸收光谱图。
图3为本发明涉及的实施例1中对不同浓度靶分子响应的吸收光谱图。
图4为本发明涉及的实施例1中不同浓度靶分子对应的558nm吸光度图示。
图5为本发明涉及的实施例2中对靶标核酸链碱基突变的响应实验结果图示。
图6为本发明涉及的实施例3基底为磁珠时检测方法的原理示意图。
图7为本发明涉及的实施例4基底为磁珠时检测方法的原理示意图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及基于银与脲酶的靶分子检测系统，包括基底、分子识别试剂和信号转换试剂；所述基底为磁珠或微孔板；所述分子识别试剂包括识别链1和识别链2，识别链1和识别链2分别能够与靶分子的两端连接；所述信号转换试剂包括：a)银粒子；b)过氧化氢；(c)脲酶；d)尿素和酸碱指示剂的混合液；识别链1修饰在基底表面，用于识别捕获靶分子，使靶分子通过识别链1与基底连接；识别链2修饰在银粒子表面，用于被靶分子捕获，使靶分子通过识别链2捕获银粒子；过氧化氢用于氧化分解被捕获的银粒子，释放出大量Ag+；当样品中存在靶分子时，靶分子的两端分别通过识别链1和识别链2与基底和银粒子连接，形成夹心型结构，捕获银粒子；加入过氧化氢氧化分解被捕获的银粒子，释放出大量Ag+，抑制脲酶分解尿素，溶液颜色不变；若无靶分子，溶液颜色发生改变。
本实施例所述靶分子为核酸链HIV-1，序列如SEQ ID NO:3所示。
所述识别链1(BioHI)、识别链2(P-AgS)的序列如SEQ ID NO:1-2所示。BioHI的3′端与HIV-1的3′端序列碱基能够互补，BioHI的5′端生物素能与磁珠上的链霉亲和素之间产生强结合作用。P-AgS的5′端与HIV-1的5′端序列碱基能够互补，P-AgS的3′端通过Ag-S键结合银粒子。
表1HIV-1、BioHI和P-AgS的核苷酸序列
| 序列名称 | 序列(5′→3′) |
| BioHI | biotin-AAA AAA AAA ATG CAT CCA GGT CAT GT(SEQ ID NO:1) |
| P-AgS | TAT TCC AAA TAT CTT CTA AAA AAA AAA AAA AA-SH(SEQ ID NO:2) |
| HIV-1 | AGA AGA TAT TTG GAA TAA CAT GAC CTG GAT GCA(SEQ ID NO:3) |
所述靶分子为核酸链HIV-1时，检测方法包括以下步骤：
(1)制备银纳米球：
将9mg AgNO3溶解在50mL水中，并在搅拌下煮沸；在剧烈搅拌下，将1mL摩尔浓度为39.2mmol/L的柠檬酸钠水溶液快速加入至沸腾的AgNO3溶液中，溶液颜色从无色变为黄色，最后变为棕色；将反应液保持沸腾1h后冷却至室温，得到银纳米球；该银纳米球的吸收光谱如图2所示；
(2)在银纳米球表面偶联识别链P-AgS：
将1.5μL摩尔浓度为100μmol/L的P-AgS核酸链与600μL摩尔浓度为0.11nmol/LAgNPs溶液混合，10min后，向该混合液中加入6μL摩尔浓度为500mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH＝3)；5min后，再次加入6μL柠檬酸缓冲液；室温孵育30min后，加入110μL摩尔浓度为200mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将溶液调至中性；5min后，14000rpm离心20min，去除上层溶液(过量的P-AgS)，然后将离心后的沉淀用浓度为10mmol/L的Tris–HCl缓冲液(pH7.4)润洗3次，得到修饰P-AgS的银纳米球，最后分散在600μL柠檬酸缓冲液中备用；该修饰P-AgS后的银纳米球(P-AgS-银纳米球)的吸收光谱如图2所示。从图2可以看出P-AgS-银纳米球分散到20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4,含140mmol NaCl,0.1％ BSA)中，其吸收光谱与银纳米球分散到2mmol/L柠檬酸钠的吸收光谱相似，表明P-AgS核酸链已修饰到银纳米球上，并且其能稳定分散到盐溶液中；
(3)在链霉亲和素磁珠表面偶联识别链BioHI：
所述链霉亲和素磁珠为表面修饰链霉亲和素的磁珠，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，购买的链霉亲和素磁珠在溶剂中的浓度为10mg/mL，使用前用灭菌水稀释到0.1mg/mL。
所述核酸链BioHI由生工生物工程(上海)股份有限公司和GENEWIZ公司合成。核酸链BioHI的3′端与HIV-1的3′端序列碱基能够互补，BioHI的5′端生物素能与磁珠上的链霉亲和素之间产生强结合作用；在链霉亲和素磁珠表面偶联识别链BioHI的具体方法为：
用SSC缓冲液(含NaCl和柠檬酸钠，NaCl的浓度为75mmol/L，柠檬酸钠的浓度为7.5mmol/L,pH7.0)和缓冲液A(含Tris-HCl、NaCl和Tween20，Tris-HCl的浓度为50mmol/LNaCl的浓度为2mol/L,Tween20的体积百分比浓度为0.1％,pH7.4)洗涤链霉亲和素磁珠两次；然后将链霉亲和素磁珠分散到缓冲液A中(分散后，链霉亲和素磁珠的浓度为0.1mg/mL)并与0.1nmol的BioHI混合；将上述混合物在37℃下孵育1h；随后用洗涤缓冲液(含Tris-HCl、NaCl和Tween20，Tris-HCl的浓度为20mmol/L,NaCl的浓度为140mmol/L,Tween20的体积百分比浓度为0.1％；pH7.4)洗涤磁珠两次，并在4℃的封闭液(购于生工生物工程股份有限公司；成分：1％聚合物分散于25mM Tris-HCl(pH7.4)、140mmol/L NaCl、3mmol/L KCl缓冲液中)中孵育2h，以封闭非特异性结合位点；用洗涤缓冲液洗涤磁珠两次，得到修饰有BioHI的链霉亲和素磁珠，最后将磁珠分散在缓冲液(含Tris-HCl、NaCl和牛血清白蛋白BSA，Tris-HCl的浓度为20mmol/L,NaCl的浓度为140mmol/L,BSA的质量百分比浓度为0.1％；pH7.4)中，得到磁珠分散液，备用；
(4)检测靶分子核酸链HIV-1：
具体步骤如下：
①分别将不同浓度的HIV-1水溶液(浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、20、50和100pmol/L)样品加入至磁珠分散液中(含Tris-HCl、NaCl和BSA，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为140mmol/L,BSA的质量浓度为0.1％；pH 7.4)，孵育1.5h后，HIV-1的部分序列与磁珠表面的BioHI部分序列杂交形成双链；润洗磁分离后，重新分散至200μL缓冲液(含Tris-HCl、NaCl和BSA，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为140mmol/L,BSA的质量百分比浓度为4％；pH 7.4)中；
②加入200μL表面偶联识别链P-AgS的银纳米球和100μL NaCl(浓度为0.6mol/L)溶液，孵育1.5h，靶分子HIV-1捕获表面偶联识别链P-AgS的银纳米球，即HIV-1的部分序列与银纳米球表面的P-AgS部分序列杂交形成双链，即最终形成了夹心型结构；经润洗磁分离去除未捕获的银纳米球，得到捕获银纳米球的磁珠；
③向捕获银纳米球的磁珠中，加入20μL浓度为20mmol/L的过氧化氢水溶液，反应20min后，银纳米球被过氧化氢氧化释放出Ag+；经磁分离得到含Ag+的上清液；将上述20μL含Ag+的上清液与脲酶水溶液(浓度为1nmol/L)混合，反应10min后，加入100μL尿素和苯酚红的混合溶液(尿素浓度为100mmol/L，苯酚红浓度为80μmol/L，pH5.8)，反应15min后，由于脲酶活性被抑制，尿素分解成氨和二氧化碳的量较少，溶液pH升高较小，溶液颜色显示偏黄色；测定该溶液在380～600nm内的吸收光谱，检测结果如图3所示，不同浓度靶分子在558nm的吸光度如图4所示。
如果样品中没有靶分子，则修饰P-AgS的银纳米球未被捕获。用溶液润洗后，银粒子都被洗掉了，溶液中不存在银纳米球了。所以在过氧化氢存在下，没有释放出银离子，从而无法抑制脲酶的活性，尿素正常降解为氨和二氧化碳，溶液pH上升，溶液颜色因酸碱指示剂苯酚红存在而呈粉红色。
从图3和图4可以看出，随着靶分子HIV-1浓度增大，溶液逐渐变为黄色，溶液在558nm的吸光度逐渐降低，在430nm的吸光度逐渐升高。靶分子的浓度与溶液在558nm的吸光度有依赖关系。检测限为10fmol/L。
结论，该发明检测方法在痕量靶分子存在时，即可引起较大的吸光度改变，检测限为10fmol/L，具有较高的灵敏度。当基底为微孔板时，以上步骤中无需进行磁分离。
实施例2：
本实施例对靶标核酸链HIV-1碱基多态性进行检测。该靶标核酸链碱基突变1、2、3个的序列为T-SNP1、T-SNP2和T-SNP3，各突变序列如表2所示，其中加粗碱基为突变碱基。
表2T-SNP1、T-SNP2和T-SNP3的核苷酸序列
| 序列名称 | 序列(5′→3′) |
| T-SNP1 | AGA AGT TAT TTG GAA TAA CAT GAC CTG GAT GCA |
| T-SNP2 | AGA AGT TAT ATG GAA TAA CAT GAC CTG GAT GCA |
| T-SNP3 | AGA AGT TAT ATG GAA TAA GAT GAC CTG GAT GCA |
检测的具体方法为以碱基突变序列分别代替HIV-1，样品浓度为100pmol/L。按照实施例1的方法进行检测。以水代替HIV-1作为空白组，结果如图5所示。与空白组对比，在HIV-1序列分别突变1和2个碱基时，由于探针序列(BioHI和P-AgS)较长，仍能产生较大的吸光度信号变化。在突变3个碱基时，无明显信号变化。
结论：本实施例对1个碱基以上的突变核酸链样本具有良好的区分能力，具有较好的特异性。
综上，本发明的核酸检测方法无需对蛋白酶分子进行化学修饰、无需程序升降温、可进行高通量检测、检测过程简便快捷，具有较高的灵敏度和特异性。
实施例3：
本实施例涉及一种基于银与脲酶的靶分子检测系统，包括基底、分子识别试剂和信号转换试剂；所述基底为磁珠或微孔板；所述分子识别试剂包括识别链1和识别链2；所述信号转换试剂包括：a)银粒子；b)过氧化氢；(c)脲酶；d)尿素和酸碱指示剂的混合液；识别链1修饰在基底表面，用于识别捕获靶分子，使靶分子通过识别链1与基底连接，也可以在无靶分子时结合识别链2；识别链2修饰在银粒子表面。
所述基于银与脲酶的靶分子检测系统的检测方法为：先将样品加入到修饰有识别链1的基底中，当样品中存在靶分子时，识别链1捕获靶分子，当再加入修饰识别链2的银粒子时，由于识别链1已与靶分子连接，则识别链2无法被识别链1捕获，即银粒子未被基底捕获；然后经润洗磁分离洗去未被捕获的银粒子；加入过氧化氢，无Ag+释放，经磁分离得到上清液。将该上清液加入脲酶溶液中，反应完后，再加入尿素和指示剂，脲酶分解尿素，溶液颜色发生改变；当样品中不存在靶分子时，识别链1没有被靶分子占据，加入的银粒子上修饰的识别链2被识别链1捕获，即基底通过识别链1和识别链2捕获了银粒子；经润洗磁分离洗去未被捕获的银粒子；加入过氧化氢氧化分解被捕获的银粒子，释放出大量Ag+，经磁分离得到上清液。将该上清液加入脲酶溶液中，上清液中的Ag+抑制脲酶分解尿素，溶液颜色不变。
本实施例检测方法中识别链1与靶分子的结合力比与识别链2的结合力要大，所以识别链1与靶分子结合后，难以与识别链2结合。靶分子越多，识别链1与识别链2结合的越少。当基底为微孔板时，以上步骤中无需进行磁分离。
实施例4：
本实施例涉及一种基于银与脲酶的靶分子检测系统，包括基底、分子识别试剂和信号转换试剂；所述基底为磁珠或微孔板；所述分子识别试剂包括识别链1和识别链2；所述信号转换试剂包括：a)银粒子；b)过氧化氢；(c)脲酶；d)尿素和酸碱指示剂的混合液；识别链1修饰在基底表面，用于捕获识别链2；识别链2修饰在银粒子表面，识别链2用于识别结合靶分子，以及在无靶分子时结合识别链1。
所述基于银与脲酶的靶分子检测系统的检测方法为：先将样品加入到修饰有识别链2的银粒子中，当存在靶分子时，识别链2捕获靶分子，再加入修饰有识别链1的基底，由于识别链2被靶分子占据，使得识别链1无法与识别链2连接，即基底无法捕获银粒子；经润洗磁分离洗去未被基底捕获的银粒子，保留基底；加入过氧化氢，无Ag+释放，经磁分离得到上清液，与脲酶溶液混合，随后再加入尿素和指示剂，脲酶分解尿素，溶液颜色发生改变；当样品中不存在靶分子时，识别链2未被靶分子占据，加入的基底上的识别链1与识别链2连接，即基底捕获了银粒子，经润洗磁分离洗去未被捕获的银粒子；加入过氧化氢氧化分解被捕获的银粒子，释放出大量Ag+，经磁分离得到含Ag+的上清液，与脲酶溶液混合，再加入尿素和指示剂，上清液中的Ag+抑制脲酶分解尿素，溶液颜色不变。
本实施例检测方法中识别链2与靶分子结合力比与识别链1的要大，所以识别链2与靶分子结合后，难以再与识别链1结合。靶分子的量越多，识别链2与识别链1结合的越少。当基底为微孔板时，以上步骤中无需进行磁分离。
Claims (10)
1.一种基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，先利用修饰有识别链1的基底捕获靶分子，或利用修饰有识别链2的银粒子捕获靶分子，然后根据捕获靶分子的基底能否再与识别链2结合捕获银粒子或根据捕获靶分子的银粒子能否再与基底上的识别链1结合判断基底是否捕获了银粒子；润洗掉游离的银粒子后，向基底加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后加入脲酶、尿素和酸碱指示剂混合溶液；通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子。
2.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，根据设计的识别链1与识别链2与靶分子结合情况，具体检测方法分为以下3种情况：
(1)当设计识别链1和识别链2分别能与待测靶分子的两端结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链1的基底室温孵育；修饰有识别链1的基底用于捕获待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链2的银粒子，室温孵育，润洗去除未捕获的银粒子；修饰有识别链2的银粒子用于被靶分子捕获从而产生信号；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后依次加入脲酶溶液、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则有被捕获的银粒子，进而有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解；若无靶分子，则无银粒子被捕获，从而没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子；
(2)当设计识别链1能优先与靶分子结合且结合后两者都不与识别链2结合，而在无靶分子时识别链1能与识别链2结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链1的基底室温孵育；修饰有识别链1的基底用于捕获待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链2的银粒子，室温孵育，润洗去除未捕获的银粒子；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后依次加入脲酶溶液、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则识别链1捕获靶分子，由于识别链1被靶分子占据，从而识别链2未能与识别链1结合，因此不能捕获银粒子，没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加；若无靶分子，则有银粒子被捕获，有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子；
(3)当设计识别链2能优先与靶分子结合且结合后两者都不与识别链1结合，而在无靶分子时识别链2能与识别链1结合时，靶分子检测方法为：
(a)将待测样品与修饰有识别链2的银粒子室温孵育；修饰有识别链2的银粒子用于结合待测靶分子；
(b)然后加入修饰有识别链1的基底，室温孵育，润洗去除未被基底捕获的银粒子；
(c)然后向润洗后的基底中加入过氧化氢，过氧化氢用于氧化分解银粒子，释放出大量Ag+；随后依次加入脲酶溶液、尿素和酸碱指示剂混合溶液；
(d)若样品中存在靶分子，则识别链2结合靶分子，由于识别链2被靶分子占据，从而识别链1未能与识别链2结合，因此银粒子未能被基底捕获，没有Ag+释放，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加；若无靶分子，则有银粒子被捕获，有Ag+释放，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解，可通过酸碱指示剂表征判断样品中是否含有靶分子。
3.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述基底为磁珠或微孔板；所述磁珠为10nm-5μm直径大小的表面功能化的含铁磁珠或含钴或含镍或含稀土元素的磁珠；所述微孔板为中吸附或高吸附的微孔板。
4.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述识别链1的一端通过链霉亲和素结合至基底表面，识别链1的另一端与识别链2或靶分子结合。
5.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述识别链2的一端与银粒子结合，识别链2的另一端与识别链1或靶分子结合。
6.根据权利要求5所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述识别链2通过Ag-S键结合银粒子。
7.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述银粒子为其中一个维度上尺寸在1nm至5μm的含银材料，包括银纳米球、银纳米片、银原子或银离子聚集体。
8.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，所述靶分子为核酸链HIV-1，序列如SEQ ID NO:3所示；所述识别链1和识别链2的序列如SEQ ID NO:1-2所示。
9.根据权利要求1所述的基于银与脲酶的靶分子检测方法，其特征在于，识别链1为核酸或核酸适配体或抗体或肽适体；识别链2为核酸或核酸适配体或抗体或肽适体。
10.一种基于银与脲酶的靶分子检测系统，包括基底、分子识别试剂和信号转换试剂；所述基底为磁珠或微孔板；所述分子识别试剂包括识别链1和识别链2；所述信号转换试剂包括：a)银粒子；b)过氧化氢；(c)脲酶；d)尿素和酸碱指示剂的混合液；识别链1结合在基底表面；识别链2结合在银粒子表面；靶分子能与识别链1和识别链2中的至少一个结合。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501248A (zh) * | 2020-05-15 | 2021-03-16 | 四川大学华西医院 | 一种可视化核酸检测试剂盒 |
-
2022
- 2022-11-22 CN CN202211462481.9A patent/CN116083520A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501248A (zh) * | 2020-05-15 | 2021-03-16 | 四川大学华西医院 | 一种可视化核酸检测试剂盒 |
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