JP2010540925A - カスケード酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

本発明は、カスケード酵素免疫測定法に関するもので、詳細には、分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下，ＭＭＰｓ）とカスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子（Ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下，ＳＰｓ）を用いた酵素免疫測定法に関するものである。本発明の抗原検出方法によって生体試料内抗原の検出感度を大きく向上させることができる。
【選択図】図３

Description

本発明は、カスケード酵素免疫測定法に関するものである。

免疫分析法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）というのは、試料の分析過程で抗体を用いる技術を意味する。初期には研究者等が、主にタンパク質の検出や定量のためにこの方法を用いたが、最近では、抗体技術の発展によって低分子化合物、炭水化物、脂質などの分析及び各種微生物の分析にも活用している。さまざまな免疫分析法の中で、現在最も多く使用されている方法であるサンドイッチ酵素免疫測定法は、検出しようとする一つの抗原に対して、認識部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）が異なる２種の抗体を使用する酵素免疫測定法で、検出しようとする抗原に対する高い選択性を示して診断用にも多く使用されている。

免疫分析時の検出感度を高めるための方法としては、ＤＮＡと核酸重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて生化学的に信号を増幅するＩＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）技術、ナノ粒子とＤＮＡを用いて信号を増幅し、化学的に信号を増幅するバイオバーコード免疫分析法（Ｂｉｏ−ｂａｒｃｏｄｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、カスケード反応（Ｃａｓｃａｄｅ）または前駆体酵素活性化体系（Ｃａｓｃａｄｅ ｏｒ Ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて生化学的に信号を増幅する方法（図１参照、米国登録特許４，４６３，０９０）などが開発された。前記ＩＰＣＲの場合、典型的な酵素免疫分析法に比べて検出感度を１００ないし１０，０００倍程度増加させたことが報告された。しかし、前記方法は、再現性と定量性が不足であるという短所が提議されていて、多クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体を使用する場合、抗原に対する選択性の減少によって実際の生体試料に適用するには多くの難しさが予想される（Ｂｒａｋｍａｎｎ Ｓ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２００４年，第４３巻，ｐ．５７３０−５７３４）。また、研究者等は、段々とさらに高い検出感度を求めている（Ｙｏｌｋｅｎ ＲＨ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７９年，第１０巻，ｐ．３１７−３２１）。

そこで、本発明者等は、酵素免疫測定法の検出感度を向上させようと、カスケード反応を開始することができるカスケード反応開始剤を抗原に特異的な抗体が固定された微細粒子に固定して用いることで、検出限度が大きく改善された酵素免疫測定法を開発した。

米国登録特許４，４６３，０９０

Ｂｒａｋｍａｎｎ Ｓ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２００４年，第４３巻，ｐ．５７３０−５７３４ Ｙｏｌｋｅｎ ＲＨ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７９年，第１０巻，ｐ．３１７−３２１

本発明の目的は、検出感度が向上した、抗原の検出方法を提供することである。

本発明の他の目的は、検出感度が向上した、抗原検出用キットを提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、
１）分析対象抗原特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、ＭＭＰｓ）で前記抗原を捕集する工程と、
２）工程１）の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
３）サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び、
４）形成信号の変化を測定する工程とを含む抗原の検出方法を提供する。

また、本発明は、分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子及びカスケード反応開始剤、前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質を含む抗原検出用キットを提供する。

本発明の抗原検出方法によって、生体試料内抗原の検出感度を大きく向上させることができる。

カスケード反応による抗原検出信号増幅過程を示した図である。 本発明のＰｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた方法による抗原検出信号増幅過程を示した図である。 本発明のＰｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた方法による抗原検出信号増幅過程を示した図である。 比色基質または蛍光基質を用いて、本発明のＰｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いる場合の抗原検出信号増幅結果を示した図である：ａ：比色基質、及び、ｂ：蛍光基質。 本発明のＰｏｌｙＡｂ−ＥＫ：ＡＦＰまたはＰｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫ：ＡＦＰを用いる場合の抗原検出信号増幅結果を示した図である：ａ：ＰｏｌｙＡｂ−ＥＫ、及び、ｂ：ＰｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫ。 本発明のＰｏｌｙＡｂ−ＥＫ：ＰＳＡを用いた場合の抗原検出信号増幅結果を示した図である。 本発明のＰｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫ：ＰＳＡを用いた場合の抗原検出信号増幅結果を示した図である。 同時に多様な抗原を検出することができる多重検出法の過程を示した図である。

以下、本発明で用いた用語を説明する。

「カスケード反応（Ｃａｓｃａｄｅ）」は、非活性型前駆体酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅまたはｚｙｍｏｇｅｎ）がカスケード反応開始剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）によって一つ以上のペプチド結合が分解されることによって活性化酵素になり、このように活性化になった酵素が多量の特定基質を分解する一連の増幅反応を意味する。このような二工程にわたった信号増幅によって信号の検出限度を増進させることができる。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は、１）分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、ＭＭＰｓ）で前記抗原を捕集する工程と、
２）工程１）の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子（Ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、ＳＰｓ）で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
３）サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び、
４）形成信号の変化を測定する工程とを含む抗原の検出方法を提供する。

本発明の実施例では、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；肝臓癌特異抗原）またはＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；前立腺特異抗原）に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子を用いてＡＦＰまたはＰＳＡを捕集した後、カスケード反応開始剤であるエンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子（ｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫ）を処理して、前記エンテロキナーゼによって活性型酵素トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）に変換される前駆体酵素トリプシノーゲン（ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ）及び前記トリプシンに特異的な信号形成用基質であるＬ−ＢＡｐＮＡを処理した後、トリプシンによるＬ−ＢＡｐＮＡの基質反応時に発生する形成信号の変化を測定した（図３、５及び７参照）。ここで、前記ＡＦＰまたはＰＳＡに特異的な二次抗体にエンテロキナーゼが直接連結されたもの（ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫ）を対照群に用いた（図２、５及び６参照）。その結果、ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた場合では５０〜１００ｐＭで抗原検出が可能で、ｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた場合では１〜１０ｐＭで抗原検出が可能だった。すなわち、Ｓｐを使用することで、最大１００倍程度の検出信号増幅効果を確認した。それで、本発明のカスケード反応開始剤であるエンテロキナーゼ及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子は、抗原検出限度を高めるのに用いることができる。

前記前駆体酵素は、カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される酵素はすべて使用することができ、トリプシノーゲンまたはキモトリブシノーゲンであることが好ましいが、これに制限されるのではない。前記トリプシノーゲンは、カスケード反応開始剤にエンテロキナーゼを用いて活性化して、トリプシンになることができ、キモトリブシノーゲンは、カスケード反応開始剤にトリプシンを用いて活性化してキモトリプシンになることができる。この外にも、可能なカスケード反応の例を表１に記載した。

前記形成信号は、前記活性型酵素が信号形成用基質の基質反応を触媒した結果生成されて、発色、放射線、蛍光、生物発光及び化学発光などの形態で形成され得る。前記信号形成用基質は、前記活性型酵素に特異的で前記活性型酵素による基質反応後に信号を形成することができるものはすべて使用することができる。前記活性型酵素トリプシンは、Ｌ−ＢＡｐＮＡ基質（Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン ｐ−ニトロアニリド，ハイドロクロライド）を信号形成用基質に用いて形成信号を生成することができる。本発明の実施例では、カスケード反応開始剤によって前駆体酵素から活性化になった酵素の基質に、比色基質または蛍光基質を用いた結果、同一な抗原検出結果を確認した（図４参照）。

工程４）の形成信号の変化測定は、当業界に一般的に知られていて、簡単に説明すると、基質が酵素の場合、酵素反応を通じた基質の反応などを確認し；蛍光物質の場合、蛍光強度を測定し；放射線物質の場合、放射線放出量を測定することで、抗原の検出を行なうことができる。

一方、本発明による方法は、各工程の反応を遂行した後、反応に参加しない残余物は、当業界で一般的な方法を用いて除去する工程を選択的にさらに含むことができ、本発明がこれに限定されるのではない。

本発明の実施態様では、いくつかの抗原を含んだ試料から前記抗原を検出するために各抗原に対する２次抗体及び抗原別に異なるカスケード反応開始剤が固定されたシリカナノ粒子を用いることで、いくつかの抗原を同時に検出することができる（図８参照）。

また、本発明は、分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子及びカスケード反応開始剤、前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質を含む抗原検出用キットを提供する。

前記キットは抗原、洗浄液、反応緩衝溶液及び遮断緩衝溶液を追加で含むことができる。

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。

＜実施例１＞単一クローン抗体の固定
＜１−１＞磁性微細粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、ＭＭＰｓ）に固定（ｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓ）
トシル−機能性ＭＭＰｓに単一クローンＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；前立腺特異抗原；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ１３４４、Ｒ＆Ｄ、米国）抗体または単一クローンＡＦＰ（Ａｌｐｈａ Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体（バデテックメド、韓国）を１次アミノ基を通じた共有結合で固定した。

具体的に、２０μｌ ＭＭＰｓ（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を０．２Ｍホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）で３回洗浄した後、２０μｌホウ酸緩衝溶液に再分散させて準備した。６６μｌ ０．２Ｍホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）、８４μｌ ３Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０μｌ ＭＭＰｓ及び８０μｌ 単一クローンＰＳＡ抗体溶液または単一クローンＡＦＰ抗体溶液（ホウ酸緩衝溶液に溶解した１．０μｇ／μｌ）を混ぜて結合溶液を準備した。撹拌器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）を用いて３７℃、２２０ｒｐｍで２４時間結合反応を遂行した。その結果、生成されたｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓを磁石で回収し、２５０μｌ遮断緩衝溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、０．０５％ツイーン−２０、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に入れて撹拌器を用いて３７℃、２２０ｒｐｍで２４時間パッシベーション（ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ；表面に保護膜をかける）した。以後、ｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓを１ｍｌ遮断緩衝溶液で３回洗浄した後、２００μｌ遮断緩衝溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に入れて４℃で保管した。

＜１−２＞ウェルプレートに固定（ｍｏｎｏＡｂ−ウェルプレート）
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化になったオリゴエチレングリコール表面を有したウェルプレート（ＮＵＮＣ、イギリス）の一ウェル当り１０μｇ／ｍｌの単一クローンＰＳＡ抗体または単一クローンＡＦＰ抗体をコーティングした。前記抗体が固定されたウェルプレートを３回洗浄した後、３００μｌの遮断溶液（０．２５Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５；Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を入れて遮断した。

単一クローン抗体１０μｇ／ｍｌ（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ８．０）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で１時間ゆっくり撹拌して固定させた。１時間反応後、ＰＢＳ−Ｔ（１×ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン−２０）で３回洗浄した。

＜実施例２＞多クローン性抗体の固定
＜２−１＞多クローン抗体とＥＫ混成体製造（ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫ）
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート；ＰＩＥＲＣＥ、米国）を用いて、多クローンＡＦＰ抗体（バデテックメド、韓国）にＥＫ（１１３３４１１５，Ｒｏｃｈｅ，スイス）をコンジュゲーションして多クローン抗体とＥＫ混成体を製造した。

まず、多クローンＰＳＡ抗体（Ｒ＆Ｄ，米国）または多クローンＡＦＰ抗体５００μｇに２０ｍＭ ＤＴＴを添加して室温で２０分間放置させることで抗体のＦｃ部分に存在するジスルフィド結合をチオール（ＳＨ）基で還元した。反応後に残っている過量のＤＴＴは、ＰＤ−１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ）を用いて除去した。また、ＥＫ５００μｇに５０当量のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（水中 ４．８ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で３０分間ゆっくり混合してＥＫ−ＳＭＣＣ誘導体を形成した。反応後に残っている過量のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、ＰＤ−１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ）を用いて除去した。併せて、チオール基を誘導した抗体と当量のＥＫ−ＳＭＣＣを混ぜて室温で再び１時間反応させることで、多クローン抗体とＥＫ混成体を製造した。製造された混成体は、Ｇｅｌ ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎを通じて精製し、混成体形成はウエスタンブロットで確認した。ＤＴＴとＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理時、１００ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．３（Ｓｉｇｍａ，米国）を反応緩衝液に用いた。

＜２−２＞多クローン性抗体とＥＫが固定されたシリカナノ粒子（Ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；以下、ＳＰｓ）の製造（ｐｏｌｙＡｂ−ＳＰｓ−ＥＫ）
アミンカップリング方法でＳＰｓに多クローン性ＰＳＡ抗体とＥＫを一緒に固定した。

具体的に、表面にカルボキシル酸基を含む５００ｎｍ ＳＰｓ（１００ｍｇ／ｍｌ；ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国）１５０μｌを３次蒸留水で３回洗浄した後、１５０μｌの３次蒸留水を入れて再分散した。０．４Ｍ ＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国］と０．１Ｍ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）の１：１混合液３００μｌに前記ＳＰｓを混ぜた後、２５℃で３０分間撹拌してＳＰｓのカルボキシル酸基を活性化させた。以後、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６）で２回洗浄し、１５０μｌ ＭＥＳ緩衝溶液に入れて分散させた。１５０μｌ ＳＰｓ、３３．５μｌ多クローン性ＰＳＡ抗体または多クローン性ＡＦＰ抗体と（ＰＢＳ緩衝溶液中 ０．８３μｇ／μｌ）、５４μｌ ＥＫ（蒸留水中 ２．１μｇ／μｌ）、２６２．５μｌ ０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液を混ぜて結合溶液を準備した。撹拌器を用いて２５℃、１８０ｒｐｍで２時間結合反応を遂行した。以後、８３０ｇで３分間遠心分離し、０．２５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５；Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）に混合した後、３０分間２５℃で反応して残っている活性残基（ＮＨＳエステル）を不活性化させた。続いて、遮断緩衝溶液（０．１Ｍホウ酸緩衝溶液、１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン−２０、ｐＨ８．５）を混合して、３０分間２５℃で反応させた。遮断緩衝溶液で２回洗浄した後、１．５ｍｌ遮断緩衝溶液に混合して４℃で保管した。

＜実験例１＞ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた抗原（ＡＦＰ）検出
＜１−１＞ｍｏｎｏＡｂ−ウェルプレートとｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた抗原の捕集
分析緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ、０．２％ツイーン−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄後、ｍｏｎｏＡｂ−ウェルプレートにＡＦＰ抗原溶液（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，米国）を混ぜた後、２５℃で１時間反応させた。使用したＡＦＰ濃度は、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ及び１ａＭであり、ＡＦＰを入れていない試料を対照群に用いた。ウェルプレートを分析緩衝溶液で５回洗浄した後、ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫ：ＡＦＰを加えた後、混合液を２５℃で１時間インキュベーションした。分析緩衝溶液で３回洗浄した後、酵素活性を測定した。

＜１−２＞信号発生及び検出方法
実験例１−１で抗原を媒介に修得した混成体及びトリプシノーゲン（Ｓｉｇｍａ，米国）をｐＨ８．０トリス緩衝溶液に混ぜた混合液（１０μＭ）を３７℃で２時間反応させた後、１ｍＭ Ｌ−ＢＡｐＮＡ基質（比色基質；Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン ｐ−ニトロアニリド，ハイドロクロライド；ＭＰＢＩＯ，米国）を添加して、４１０ｎｍで吸光度変化を測定した。また、Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン ７−アミド−４−メチル−クマリン ＨＣｌ基質（蛍光基質；Ｓｉｇｍａ，米国）を添加して、Ｅｘ３３３ｎｍ／Ｅｍ４４０ｎｍで蛍光を測定した。

その結果、図４に示されたように抗原検出時の高い再現性を示し、比色基質（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と蛍光基質で同一な抗原検出結果を確認した。

＜実験例２＞ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫまたはｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた抗原（ＡＦＰ）検出
＜２−１＞ｍｏｎｏＡｂ−ウェルプレートとｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた抗原の捕集
使用したＡＦＰ抗原の濃度が、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ及び１ｐＭであることを除いて実験例１−１と同一な方法で抗原を捕集した。

＜２−２＞ｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓとｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた抗原の捕集
分析緩衝溶液で２回洗浄したｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓ（１０ｍｇ／ｍｌ）にＡＦＰ抗原溶液を混ぜた後、２５℃で２時間反応させた。前記ＡＦＰ抗原の濃度は、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭであった。反応終了後、前記ｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓとＡＦＰ抗原の結合体を分析緩衝溶液で１回洗浄した後、遮断緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．２％ツイーン−２０、ｐＨ７．４）に入れて３０分間２５℃で反応させた。続いて、分析緩衝溶液で２回洗浄した後、ｐｏｌｙＡｂ−ＳＰｓ−ＥＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた後、混合液を２５℃で２時間反応させた。分析緩衝溶液で５回洗浄した後、酵素活性を測定した。

＜２−３＞信号発生及び検出方法
実験例２−１及び２−２で抗原を媒介に修得したそれぞれの混成体及びトリプシノーゲン（対照群は無添加）をｐＨ８．０トリス緩衝溶液に混ぜた混合液（１０μＭ）を３７℃で２０時間反応させた後、１ｍＭ Ｌ−ＢＡｐＮＡ基質を添加して４１０ｎｍで吸光度変化を測定した。

その結果、図５に示されたように、ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた場合では１００ｐＭで抗原検出が可能で、ｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた場合では１〜１０ｐＭで抗原検出が可能だった。すなわち、Ｓｐを使用することで最大１００倍程度の検出信号増幅効果を確認し、ＭＭＰｓを用いた場合では反復遂行時の再現性が低いことを確認した。

＜実験例３＞ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫまたはｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた抗原（ＰＳＡ）検出
＜３−１＞ｍｏｎｏＡｂ−ウェルプレートとｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた抗原の捕集
ＡＳＰ抗原の代りに使用したＰＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）の濃度が、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ及び１ｐＭであることを除いて実験例１−１と同一な方法で抗原を捕集した。

＜３−２＞ｍｏｎｏＡｂ−ＭＭＰｓとｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた抗原の捕集
ＡＳＰ抗原の代りに使用したＰＳＡ抗原の濃度が１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ及び１ｐＭであることを除いて、実験例２−２と同一な方法で抗原を捕集した。

＜３−３＞信号発生及び検出方法
実験例３−１及び３−２で抗原を媒介に修得したそれぞれの混成体及びトリプシノーゲン（対照群は無添加）をｐＨ８．０トリス緩衝溶液に混ぜた混合液（１０μＭ）を３７℃で２時間反応させた後、１ｍＭ Ｌ−ＢＡｐＮＡ基質を添加して４１０ｎｍで吸光度変化を測定した。

その結果、図６及び図７に示されたように、ｐｏｌｙＡｂ−ＥＫを用いた場合では５０ｐＭで抗原検出が可能で、ｐｏｌｙＡｂ−Ｓｐ−ＥＫを用いた場合では１〜１０ｐＭで抗原検出が可能だった。すなわち、Ｓｐを使用することで、最大１００倍程度の検出信号増幅効果を確認し、ウェルプレートを用いた場合の反復遂行時の再現性が高いことを確認した。

Claims (8)

1. １）分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子で前記抗原を捕集する工程と、
   ２）工程１）の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
   ３）サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び
   ４）形成信号の変化を測定する工程とを含む抗原の検出方法。
2. 前駆体酵素が、トリプシノーゲンまたはキモトリブシノーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. トリプシノーゲンが、カスケード反応開始剤にエンテロキナーゼを用いて活性化してトリプシンになることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. キモトリブシノーゲンが、カスケード反応開始剤にトリプシンを用いて活性化して、キモトリプシンになることを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. トリプシンが、Ｌ−ＢＡｐＮＡ基質（Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロアニリド，ハイドロクロライド）またはＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン７−アミド−４−メチル−クマリンＨＣｌ基質を信号形成用基質に用いて形成信号を生成することを特徴とする請求項３に記載の方法。
6. 形成信号が、発色、蛍光、生物発光及び化学発光からなる群から選択された１種以上の方法によって形成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 分析対象抗原に特異的な１次抗体が固定された磁性微細粒子及びカスケード反応開始剤、前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質を含む抗原検出用キット。
8. 抗原、洗浄液、反応緩衝溶液及び遮断緩衝溶液をさらに含む請求項７に記載のキット。

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