CN102183657B

CN102183657B - 一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法

Info

Publication number: CN102183657B
Application number: CN201110044837.2A
Authority: CN
Inventors: 苏恩本; 叶森; 颜彬
Original assignee: NANJING EGG-BASED BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Ji Dan Biotech Inc
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2031-02-24
Also published as: CN102183657A

Abstract

本发明公开了一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，包括将一株待测抗原的酶标抗体共价偶联到聚苯乙烯胶乳纳米粒上，将待测抗原的另一株抗体共价偶联到磁性微粒上，将上述两种微粒加入到含有待测抗原的体系中，通过抗体-抗原-酶标抗体的相互作用形成磁性微粒-抗体-待测抗原-酶标抗体-聚苯乙烯胶乳纳米粒复合物，使用磁性分离技术捕获所述的复合物，利用化学发光检测仪检测化学发光底物发光强度即可计算出待测抗原的浓度。该方法具有特异性强，灵敏度高，检测速度快等优势。

Description

一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法

技术领域

本发明属于预防与诊断医学检验领域，涉及一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，具体是涉及一种检测人血液中微量心肌肌钙蛋白I的依赖纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法。

背景技术

心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有较高的心肌特异性及敏感度，已越来越多地用于心肌梗死、心绞痛的诊断和鉴别诊断，并逐渐有取代心肌酶的趋势。在生理条件下，用现有的免疫学方法不能测出这些蛋白的浓度。在缺血时，细胞膜的完整性受损，这些细胞内的蛋白可从损伤的肌细胞中释放入血。因为所用试剂不同，不同的文献报道cTnI的最低检测限不同，大约为0.03～0.1ng/ml。正常下限值也不一样，自0.1至2.5ng/ml均有报道。在心肌梗塞开始后cTnI 3.25～6h开始升高，11.5～24h(平均18h)达峰，持续时间大于96h。cTnI升高的数值可超过测定低限的158倍。cTnI在急性心肌梗死后的释放呈单向时间依赖曲线，第2～4天有一长的平台期。cTnI不仅可以用于诊断急性心肌梗死，对判断心梗病人溶栓是否成功也有一定指导意义。与传统的心肌酶CK、CK-MB、LDH等相比，cTnI在诊断急性心肌梗死方面显示出较高的敏感度。由于cTnI在心肌和心肌外组织的形式不同，因而是理想的心肌损伤时的血清学标志物。

文献报道，使用罗氏诊断E系列免疫分析仪对546健康志愿者的血清进行检测，平均值为14pg/ml，95％的样本介于12.4-24.9pg/ml，血清中cTnI的浓度高于40pg/ml预示着极轻度心肌受损。使用对2000年发表在《美国医学协会期刊》上的美国国家急性心梗注册研究，报告了一组具有说服力的数据。在27080例“心梗”患者中，症状发作60分钟内接受治疗者，死亡率最低，而超过120分钟者，死亡率显著升高。鉴于“心梗”患者接受急诊治疗的生存率与治疗的时间密切相关，美国心脏学会和美国心脏病学学会将急性“心梗”急诊从就诊到球囊扩张的时间-90分钟定为新的金标准。对cTnI的检测方法，主要有传统的酶联免疫吸附法，化学发光法，化学发光磁酶免疫法，胶乳免疫比浊法，传统的酶联免疫吸附法检测时间较长且灵敏度不够高，国内尚无灵敏度较高的化学发光法，化学发光磁酶免疫试剂和仪器，高敏cTnI的测定基本全部依靠国外进口试剂和仪器，胶乳试剂虽然快速，但是灵敏度为0.3ng/ml，达不到高敏的要求，也依赖于国外的技术。利用纳米粒共价偶联酶标记抗体技术，与现有的化学发光磁酶免疫系统结合起来，能大幅度的增加肌钙蛋白I的检测灵敏度，便于预测就诊病人的心肌梗塞等疾病，为疾病的及时治疗争取宝贵的时间，其现实意义巨大。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的上述不足，提供了一种依赖纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法。

本发明的另一目的是提供一种检测试剂盒，可以解决现有技术存在的国内试剂盒在检测过程中灵敏度不够高的问题，使用本发明后能将检测灵敏度提高至少1-2个数量级。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，包括将一株待测抗原的酶标抗体共价偶联到聚苯乙烯胶乳纳米粒上，将待测抗原的另一株抗体共价偶联到磁性微粒上，将待测抗原加入含有上述两种微粒的体系中，通过抗体-抗原-酶标抗体的相互作用形成磁性微粒-抗体-待测抗原-酶标抗体-聚苯乙烯胶乳纳米粒复合物，使用磁性分离技术捕获所述的复合物，加入发光底物、发光增强剂、双氧水，通过纳米粒上的酶的催化作用，进行化学发光，利用化学发光检测仪检测化学发光底物发光强度即可计算出待测抗原的浓度。

所述的聚苯乙烯纳米粒为表面被羧基修饰的20-40纳米的聚苯乙烯纳米粒，所述的磁性微粒亦为表面被羧基修饰的0.7-1.3微米的超顺磁性微球。

所述的共价偶联到聚苯乙烯胶乳纳米粒上的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人cTnI单克隆抗体。

所述的共价偶联到磁性微粒上的抗体为与上述的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人cTnI单克隆抗体相配对的鼠抗人cTnI单克隆抗体。

一种检测试剂盒，包括：A液：共价偶联了待测抗原的酶标抗体的聚苯乙烯胶乳纳米粒悬浮液；B液：共价偶联了待测抗原另一株抗体的磁性微粒悬浮液。

所述的待测抗原的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的待测抗原的抗体。

所述的检测试剂盒还包括0.1mM的化学发光底物鲁米诺溶液，0.1mM的发光增强剂对碘苯酚溶液，以及3mM的双氧水溶液。

所述的0.1mM的鲁米诺溶液以pH8.5，0.1M的Tris-HCl缓冲液为溶剂；0.1mM的对碘苯酚溶液以pH8.5，0.1M的Tris-HCl缓冲液为溶剂；所述的3mM的双氧水溶液以pH4.5的5mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为溶剂。

所述的A液：共价偶联了辣根过氧化物酶标记的cTnI单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳纳米粒悬浮液；所述的B液：共价偶联了另一株cTnI单克隆的磁性微粒悬浮液，所述的两株单克隆抗体为配对抗体。

上述检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备共价偶联了待测抗原的酶标抗体的聚苯乙烯胶乳纳米粒(以下简称致敏纳米粒)：用活化缓冲液活化纳米粒表面化学基团，活化完成后使用偶联缓冲液清洗纳米粒，加入与纳米粒等质量的辣根过氧化物酶标记的待测抗原单克隆抗体，反应后使用封闭缓冲液封闭纳米粒上空余的活化基团，既得致敏纳米粒。

2)制备共价偶联了待测抗原另一株抗体的磁性微粒(致敏磁性微粒)：用活化缓冲液活化纳米粒表面化学基团，活化完成后使用偶联缓冲液清洗磁性微粒，加入相当于磁性微粒质量的1/20的待测抗原的另一株单克隆抗体，反应后使用封闭缓冲液封闭纳米粒上空余的活化基团，既得致敏磁性微粒。

3)最后配制化学发光底物鲁米诺(luminol)(0.1mM，使用pH8.5的0.1M的Tris-HCl缓冲液配制)，双氧水(3mM，使用pH4.5的5mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液配制)和发光增强剂对碘苯酚(0.1mM，使用pH8.5的0.1M的Tris-HCl缓冲液配制)。

上述适用的两株待测抗原的单克隆抗体为配对抗体。

有益效果：本发明的纳米粒化学发光磁酶免疫法利用超顺磁性微粒磁性分离技术，化学发光和共价偶联技术，通过在纳米粒上共价偶联酶标记抗体和磁性微粒上共价偶联抗体，利用磁性分离技术对血清中待测抗原(cTnI)进行捕捉，进而将酶标记抗体纳米粒捕获，此时添加化学发光底物鲁米诺，双氧水，以及发光增强剂对碘苯酚，通过纳米粒上的辣根过氧化物酶的催化作用，进行化学发光，通过特定仪器检测光强。该方法具有特异性强，灵敏度高，检测速度快等优势。

附图说明

图1本发明的交联方式结构示意图：

其中：1、致敏纳米粒；2、致敏磁性微粒；3、酶标抗体；4、cTnI；5、鼠抗人cTnI的单克隆抗体3C7。

图2酶标抗体浓度和磁性微粒浓度对cTnI检测灵敏度和信噪比的影响。

图3纳米粒浓度和磁性微粒浓度对cTnI检测灵敏度和信噪比的影响。

图4传统的化学发光磁酶免疫法检测cTnI的灵敏度检测结果。

图5依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫法检测cTnI的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

一种检测cTnI的试剂盒，包括致敏纳米粒1即共价偶联了辣根过氧化物酶标记的鼠抗人cTnI单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳纳米粒悬浮液；致敏磁性微粒2即共价偶联了另一株鼠抗人cTnI的单克隆抗体的磁性微粒悬浮液；0.1mM的化学发光底物鲁米诺溶液，0.1mM的发光增强剂对碘苯酚溶液，以及3mM的双氧水溶液。将cTnI加入含有上述两种微粒的体系中，通过抗体-抗原-酶标抗体的相互作用形成磁性微粒-抗体-待测抗原-酶标抗体-聚苯乙烯胶乳纳米粒复合物，使用磁性分离技术捕获所述的复合物，加入配制好的鲁米诺，对碘苯酚和双氧水，利用化学发光检测仪检测化学发光底物发光强度即可计算出待测抗原的浓度。磁性微粒-抗体-待测抗原-酶标抗体-聚苯乙烯胶乳纳米粒复合物的交联方式结构示意图见图1。

其中酶标抗体3是标记了辣根过氧化物酶的鼠抗人cTnI单克隆抗体MF4，通过使用高碘酸钠法(Wilson等)将辣根过氧化物酶标记到鼠抗人cTnI单克隆抗体MF4上，使用葡聚糖凝胶过滤纯化得到。

抗体5为鼠抗人cTnI单克隆抗体3C7(购于Fitzgerald公司)，与前一株单克隆抗体是配对的，即针对人cTnI氨基酸序列的不同抗原决定簇。

使用碳化二亚胺(EDAC)法共价偶联酶标抗体以制备致敏纳米粒1悬浮液：20mM MES水溶液(pH5.6)清洗纳米粒(26nm，购于Bangslab公司)两次，重悬纳米粒在此缓冲液中，添加EDAC和Sulfo-NHS使纳米粒：EDAC：Sulfo-NHS的质量比为1∶1∶0.6，24℃活化1小时，20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)清洗三遍纳米粒后，添加与纳米粒等质量的辣根过氧化物酶标记的鼠抗cTnI氨基酸序列87-91的单克隆抗体(酶标抗体3)。24℃反应12小时后添加1/20体积甘氨酸封闭液(1mol/L甘氨酸水溶液)24℃封闭1小时。100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，150mM NaCl，0.05％Tween-20)清洗纳米粒三次，溶于100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，150mMNaCl，0.05％Tween-20，0.1％BSA)中，使致敏纳米粒的浓度为0.25％(W/V，g/100ml)。

致敏磁性微粒2悬浮液：磁性微粒(羧基化磁性微粒，粒径0.7-1.3μm，购于天津倍思乐色谱技术开发中心)使用和纳米粒同样的方法偶联抗体既得致敏磁性微粒，其中与纳米粒偶联方法不同的是应加入相当于磁性微粒质量的1/20的待测抗原的另一株单克隆抗体3C7，制备好的磁性微粒的浓度为0.25％(W/V，g/100ml)。

发光底物的配制，鲁米诺和发光增强剂对碘苯酚分别使用DMSO溶解后使用0.1M的Tris-HCl(pH8.5)配制成终浓度0.1mM，30％双氧水使用5mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH4.5)稀释配制成终浓度3mM。

本发明的纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法可以配套全自动化学发光仪以及半自动化学发光仪，用于快速检测血液中极微量cTnI的含量。

实施例2

1、实验器材和试剂：

EnSpire多标记微孔板检测系统(美国PerkinElmer公司)，96孔白色板(OptiPlate-96，美国PerkinElmer公司)，恒温水浴锅(HH-60，常州国华电器有限公司)，恒温摇床(太仓市科教器材厂)，微量移液器(Thermo公司)，高速冷冻离心机(TGL-16，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，96孔板磁分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)。cTnI标准品(BIO-RAD公司)，PBS-T缓冲液(KH₂PO₄3.35g/L，Na₂HPO₄-12H₂O 17.9g/L，KCl 0.2g/L，NaCl 8.77g/L，Tween-200.5g/L，pH 6.96)，cTnI标准品稀释液为含20％牛血清的PBS-T缓冲液，检测cTnI的试剂盒的制备同实施例1。

2、实验步骤：

2.1反应体系中致敏纳米粒与磁性微粒浓度的确定

2.1.1不依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫实验中酶标抗体与磁性微粒浓度的确定

cTnI标准品使用标准品稀释液稀释成0pg/ml和200pg/ml(2水平)的标准品溶液，酶标抗体浓度梯度按照0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml，30μg/ml配制(9水平)，磁性微粒浓度梯度按照0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％，1％配制(5水平)，共3因素3水平，总计90个试验孔。分别取100μl上述cTnI标准品溶液至96孔白色板中，分别加入10μl致敏磁性微粒，37℃温育10min后每孔加入10μl酶标抗体，37℃温育10min，磁性分离，弃掉上清，加入200μl PBS-T悬浮磁性微粒，再次磁性分离弃上清，重复5次。配制好的鲁米诺，对碘苯酚和双氧水按照1∶1∶1的比例混合均匀后，每孔加入200μl上述结合了cTnI和酶标抗体的悬浮磁性微粒，37℃温育5min后使用EnSpire多标记微孔板检测系统检测发光强度。将0pg/ml cTnI标准品测得的光强度定为S0，200pg/ml cTnI标准品测得的光强度定为S1，S1与S0的比值(S1/S0)为信噪比，直接反映试验检测的灵敏度，结果见图2。由图2可见，酶标抗体浓度在10μg/ml，磁性微粒的浓度选取0.25％，信噪比最高(S1/S0＝1.14)。

2.1.2依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫实验中致敏纳米粒与磁性微粒浓度的确定

cTnI标准品使用标准品稀释液稀释成0pg/ml和5pg/ml(2水平)的标准品溶液，致敏纳米粒浓度梯度按照0.05％，0.1％，0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％配制(10水平)，磁性微粒浓度梯度按照0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％，1％配制(5水平)，共3因素3水平，总计100个试验孔。分别取100μl上述cTnI标准品溶液至96孔白色板中，分别加入10μl致敏磁性微粒，37℃温育10min后每孔加入10μl致敏纳米粒，37℃温育10min，磁性分离，弃掉上清，加入200μl PBS-T悬浮磁性微粒，再次磁性分离弃上清，重复5次。配制好的鲁米诺，对碘苯酚和双氧水按照1∶1∶1的比例混合均匀后，每孔加入200μl上述结合了cTnI和酶标抗体包被的致敏纳米粒的悬浮磁性微粒，37℃温育5min后使用EnSpire多标记微孔板检测系统检测发光强度。将0pg/ml cTnI标准品测得的光强度定为S0，5pg/ml cTnI标准品测得的光强度定为S1，S1/S0为信噪比，直接反映试验检测的灵敏度，结果见图3。由图3可见：致敏纳米粒浓度在0.25％，磁性微粒的浓度选取0.25％信噪比最高(S1/S0＝1.12)。

因此，选取酶标抗体10μg/ml，致敏纳米粒浓度选取0.25％，磁性微粒浓度选取0.25％，做两种不同方法的灵敏度比较。

2.2化学发光磁酶免疫实验灵敏度的考察

2.2.1不依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫实验

cTnI标准品使用标准品稀释液稀释成0pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml，5000pg/ml，10000pg/ml，20000pg/ml，30000pg/ml的标准品溶液。分别取100μl以上浓度cTnI标准品溶液至96孔白色板中，分别加入10μl致敏磁性微粒，37℃温育10min后每孔加入10μl酶标抗体3(10μg/ml)，37℃温育10min，磁性分离，弃掉上清，加入200μl PBS-T悬浮磁性微粒，再次磁性分离弃上清，重复5次。配制好的鲁米诺，对碘苯酚和双氧水按照1∶1∶1的比例混合均匀后，每孔加入200μl上述结合了cTnI和酶标抗体的悬浮磁性微粒，37℃温育5min后使用EnSpire多标记微孔板检测系统检测发光强度，并绘制cTnI浓度-吸光强度曲线图，结果见图4。由图4可见：不依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫灵敏度为200pg/ml，在200pg/ml-10000pg/ml间有良好的线性关系(R²＝0.9984)。

2.2.2依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫实验

cTnI标准品使用标准品稀释液稀释成0pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，400pg/ml，800pg/ml，1000pg/ml，1300pg/ml，1600pg/ml的标准品溶液。取100μl以上浓度cTnI标准品溶液至96孔白色板中，分别加入10μl致敏磁性微粒，37℃温育10min后每孔加入10μl致敏纳米粒(0.25％)，37℃温育10min，磁性分离，弃掉上清，加入200μl PBS-T悬浮磁性微粒，再次磁性分离弃上清，重复5次。配制好的鲁米诺，对碘苯酚和双氧水按照1∶1∶1的比例混合均匀后，每孔加入200μl上述结合了cTnI和酶标抗体包被的致敏纳米粒的悬浮磁性微粒，37℃温育5min后使用EnSpire多标记微孔板检测系统检测发光强度，并绘制cTnI浓度-吸光强度曲线图，结果见图5。由图5可见：依赖纳米粒的化学发光磁酶免疫灵敏度可达到5pg/ml，在5pg/ml-1000pg/ml间有良好的线性关系(R²＝0.9980)。实验证明利用本发明方法可大幅度提高化学发光磁酶免疫法的灵敏度。

在以上的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，其特征在于包括将一株待测抗原的酶标抗体共价偶联到聚苯乙烯纳米粒上，将待测抗原的另一株抗体共价偶联到磁性微粒上，将待测抗原加入含有上述两种微粒的体系中，通过抗体-抗原-酶标抗体的相互作用形成磁性微粒-抗体-待测抗原-酶标抗体-聚苯乙烯纳米粒复合物，使用磁性分离技术捕获所述的复合物，加入发光底物、发光增强剂，通过纳米粒上的酶的催化作用，进行化学发光，利用化学发光检测仪检测化学发光底物发光强度即可计算出待测抗原的浓度；所述聚苯乙烯纳米粒为表面被羧基修饰的20-40纳米的聚苯乙烯纳米粒，所述磁性微粒亦为表面被羧基修饰的0.7-1.3微米的超顺磁性微球。

2.根据权利要求1所述的依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，其特征在于：共价偶联到聚苯乙烯纳米粒上的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法，其特征在于：共价偶联到磁性微粒上的抗体为与权利要求2中所述的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体相配对的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。

4.一种检测试剂盒,其特征在于包括:A液: 共价偶联了待测抗原的酶标抗体的聚苯乙烯纳米粒悬浮液;B液: 共价偶联了待测抗原另一株抗体的磁性微粒悬浮液。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于所述的待测抗原的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的待测抗原的抗体。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于所述的检测试剂盒还包括0.1mM的化学发光底物鲁米诺溶液，0.1mM的发光增强剂对碘苯酚溶液，以及3mM的双氧水溶液。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述的0.1mM的鲁米诺溶液以pH8.5，0.1M的Tris-HCl缓冲液为溶剂；0.1mM的对碘苯酚溶液以pH8.5，0.1M的Tris-HCl缓冲液为溶剂；所述的3mM的双氧水溶液以pH4.5的5mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为溶剂。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述的A液: 共价偶联了辣根过氧化物酶标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的聚苯乙烯纳米粒悬浮液;所述的B液: 共价偶联了另一株抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的磁性微粒悬浮液，所述的两株单克隆抗体为配对抗体。