CN101057145A - 使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物 - Google Patents

使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101057145A
CN101057145A CNA200580028420XA CN200580028420A CN101057145A CN 101057145 A CN101057145 A CN 101057145A CN A200580028420X A CNA200580028420X A CN A200580028420XA CN 200580028420 A CN200580028420 A CN 200580028420A CN 101057145 A CN101057145 A CN 101057145A
Authority
CN
China
Prior art keywords
interested
binding partners
ecl
analysans
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA200580028420XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN101057145B (zh
Inventor
A·巴德
W·苗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Texas System
Original Assignee
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36777656&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101057145(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of Texas System filed Critical University of Texas System
Publication of CN101057145A publication Critical patent/CN101057145A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101057145B publication Critical patent/CN101057145B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了使用电化学发光检测样品中感兴趣的待分析物的方法。本发明还提供了包含至少一种固体支持物的组合物，该固体支持物滞留或含有电化学发光部分。

Description

使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物
本申请要求提交于2004年6月23日的美国临时申请号60/581,719的优先权，该申请在此作为参考被引用。
                       说明书
技术领域
本发明总体上涉及用于检测样品中感兴趣的待分析物的方法和组合物。感兴趣的待分析物可与困扰人或其它活生物体的疾病或状况相关。感兴趣的待分析物包括毒素、化学或生物战剂(warfare agents)以及环境污染物。在某些具体实施方式中，本发明特别涉及组合物，该组合物包含第一和第二载体、在样品中包含的感兴趣的待分析物、滞留(entrapped)或包含在第一载体中的电化学发光(ECL)部分以及感兴趣的待分析物的至少一个特异性结合伴侣(partner)，该伴侣与第一和第二载体中的至少一个相连。在某些具体实施方式中，本发明涉及使用这些组合物检测样品中感兴趣的待分析物的方法。
背景技术
对用于检测和定量待分析物例如化学、生物化学和生物学物质的快速、高度特异性的方法存在持续的且不断扩大的需求。特别地，用于测量少量药品、代谢物、生物标记物、微生物、病毒和其它病原体的方法是希望的。这些材料的存在常常通过结合方法加以确定，这些方法探索表征很多生物系统的高度专一性。依赖于结合以检测样品中存在的感兴趣的分子的已知方法包括核酸杂交技术和蛋白质-配体相互作用例如抗体-抗原结合。在这些方法中，具有诊断价值的复合体的存在典型地通过可观察标记物的存在/活化或缺乏/失活进行表明，该标记物已经与组成复合体的一种或多种材料相连。
灵敏度和选择性均是用于检测由大量成分组成的样品中存在的感兴趣的特定分子的任何系统所希望的性质。在DNA杂交和用于检测感兴趣的生物分子的其它生物实验中的灵敏度在临床诊断(Liron和Fisher Eds.Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays，Kluwer Academic/Plenum Publishers：New York，2000；Kenton等人.1992，Clin.Chem.38：873；Chistodoulides等人.2002，Anal.Chem.74：3030)、法医化学(Heller，2002，Annu.Rev.Biomed.Eng.4：129；Nelson等人.1996，J.Forensic Sci.41：557)、环境研究(Lucarelli等人.2002，Talanta 56：949；Min等人.2002，Anal.Biochem.303：186)、药物研究(Heller，2002，Annu.Rev.Biomed.Eng.4：129；Pollice等人.1985，Clin.Lab.Med.5：463)和生物战剂检测(Smith，2002，Anal.Chem.74：462A；Miao和Bard，2003，Anal.Chem.75：5825)中是重要的。因此提供感兴趣的分子的灵敏的和选择性的检测的任何系统将在所有这些领域具有广阔的实用性。
电化学发光(ECL)法因为其高度灵敏度、大的动态范围和选择性已被广泛用于结合研究(美国专利号6,316,607；Bard，A.J.Ed.Electrogenerated Chemiluminescence，Marcel Dekker New York，2004)。例如，各种技术可用于DNA检测，其中与目标单链DNA(t-ssDNA)结合的电化学、荧光和ECL活性标签在分析过程中生成可测量信号(Liron和Fisher Eds.Novel Approaches in biosensors and RapidDiagnostic Assays，Kluwer Academic/Plenum Publishers：New York，2000；Yang和Ngo Eds.Biosensors and Their Applications，KluwerAcademic/Plenum Publishers：New York，2000；Cunningham，Introduction to Bioanalytical Sensors，J.Wiley & Sons，Inc.：New York，1998)。由于被测量的信号强度通常正比于t-ss DNA的量，且传统地，仅一个或少量标签可结合到一个t-ssDNA上，因而这些方法的灵敏度常常是有限的。已经开发了一些方法，其中一个DNA可以被更大数目的标签标记，由此可以获得更高的灵敏度(Wang和Merkoci，2003，Langmuir 19：989；Zhao等人.2003，J.Am.Chem.Soc.125：11474)。这些方法不提供检测毫微微摩尔(fmol)范围的量所需要的灵敏度。它们也不提供少量非特异性结合、识别互补杂交和2碱基对错配之间的识别能力或多重测量。
因此对高度灵敏的检测系统(例如在毫微微摩尔范围内)存在需要，该系统提供了高度的灵敏度和低的非特异性结合。该系统应当具有广泛的用途由此其可被用于实质性地检测感兴趣的任何分子，如果它能够与至少一种其它分子(例如特异性结合伴侣)结合或相互作用的话。当感兴趣的分子是核酸例如DNA时，系统应当能在以下情形中加以区分：互补杂交、至少2个碱基对错配杂交和非互补DNA杂交。
理想地，检测系统将提供去除ECL标签非特异性结合的简单处理和ECL标签的高度稳定性，由此允许在没有信号损失的情况下进行多重测量的可能性。每个这样的需要至少通过在此公开的发明的某些具体实施方式得到满足。
发明内容
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的待分析物的快速、灵敏和有选择性的方法和组合物。本发明因此涉及用于精确检测(例如假阳性信号的低发生率)包含在样品中的少量(例如1fmol)的感兴趣的待分析物的方法和组合物。通过提供滞留或包含在第一载体中的大量的ECL分子，实现了，或至少部分实现了理想的灵敏度。
在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的待分析物的方法，包括
(a)形成组合物，该组合物包含：
                 (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的待分析物的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的待分析物的存在，前提是B和D不同时与感兴趣的待分析物连接。
在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的生物分子的方法，包含：
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是装有或包含A的第一固体支持物且B与感兴趣的生物分子连接或与感兴趣的生物分子的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的生物分子的样品；且
D是第二固体支持物，该固体支持物与感兴趣的生物分子连接或与感兴趣的生物分子的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的生物分子的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此确定生物分子的存在，
前提是B和D不同时与感兴趣的生物分子连接。
在本发明的某些具体实施方式中，感兴趣的生物分子可以是蛋白质。在本发明的某些具体实施方式中，感兴趣的生物分子可以是核酸。
在某些具体实施方式中，本发明提供了可用于检测样品中感兴趣的待分析物的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D不同时与感兴趣的待分析物连接。
在某些具体实施方式中，本发明提供了可用于检测样品中生物分子的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的第一固体支持物且B与感兴趣的生物分子连接或与感兴趣的生物分子的特异性结合伴侣连接；C是可能含有生物分子的样品；且D是第二固体支持物，该固体支持物与感兴趣的生物分子直接连接或与感兴趣的生物分子的第二特异性结合伴侣连接；其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；前提是B和D不同时与感兴趣的生物分子连接。
在本发明的某些具体实施方式中，感兴趣的生物分子可以是蛋白质。在本发明的某些具体实施方式中，感兴趣的生物分子可以是核酸。
在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的核酸分子的方法，包括：
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的可溶于有机溶剂的珠粒，例如聚苯乙烯珠粒，且B与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的核酸分子的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)将B溶解在有机溶剂中；
(d)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(e)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的核酸分子的存在，前提是B和D不同时与感兴趣的核酸分子连接。
在某些具体实施方式中，感兴趣的核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)。在某些具体实施方式中，感兴趣的核酸分子是核糖核酸(RNA)。
在某些具体实施方式中，本发明提供了可用于检测样品中感兴趣的核酸分子的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D不同时与感兴趣的核酸分子连接。
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的核酸分子的组合物，包含
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接；其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；前提是B和D不同时与感兴趣的核酸分子连接。
在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的蛋白质的方法，包括：
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的蛋白质的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的蛋白质分子的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的蛋白质的存在，
前提是B和D不同时与感兴趣的蛋白质连接。
在某些具体实施方式中，感兴趣的蛋白质的第一和/或第二结合伴侣可以是抗体或特异性结合蛋白。
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的蛋白质的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质连接或与感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的蛋白质分子的样品；且D是可磁化珠，该可磁化珠与感兴趣的蛋白质连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质分子的第二特异性结合伴侣连接；且其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D不同时与感兴趣的蛋白质连接。
在某些具体实施方式中，感兴趣的蛋白质分子的第一和/或第二结合伴侣可以是抗体或特异性结合蛋白。
本发明还提供了进行竞争性结合实验以检测感兴趣的待分析物的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的待分析物的方法，包含：
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导复合体中的ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的待分析物的存在，
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的待分析物的类似物连接；且另一前提是如果B与感兴趣的待分析物的类似物相连，那么D与感兴趣的待分析物的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的待分析物的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的待分析物的类似物相连。
在相关的具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的核酸分子的方法，包含：
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠且B与感兴趣的核酸的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的核酸分子的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)将B溶解在有机溶剂中；
(d)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(e)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的核酸分子的存在，
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的核酸的类似物连接；且另一前提是如果B与感兴趣的核酸分子的类似物相连，那么D与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的核酸分子的类似物相连。
在某些具体实施方式中，本发明提供了检测样品中感兴趣的蛋白质的方法，包括
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的蛋白质的样品；
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的蛋白质的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的蛋白质的存在，
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的蛋白质的类似物连接；且另一前提是如果B与感兴趣的蛋白质的类似物相连，那么D与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连且如果B与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连，那么D与感兴趣的蛋白质的类似物相连。
在某些具体实施方式中，本发明提供了为了检测感兴趣的待分析物用于进行竞争性结合实验的组合物。在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的待分析物的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；D是第二载体，该载体可与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；且其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D中仅有一个与感兴趣的待分析物的类似物连接，且另一前提是如果B与感兴趣的待分析物的类似物相连，那么D与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连，那么D与感兴趣的蛋白质的类似物相连。
在该组合物的某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物是核酸。在该组合物的某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物是蛋白质。
在相关的具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的核酸分子的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；且其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D中仅有一个与感兴趣的核酸分子的类似物连接，且另一前提是如果B与感兴趣的核酸分子的类似物相连，那么D与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的核酸分子的类似物相连。
在某些具体实施方式中，感兴趣的核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)。在某些具体实施方式中，感兴趣的核酸分子是核糖核酸(RNA)。
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的蛋白质的组合物，包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；C是可能含有感兴趣的蛋白质的样品；且D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；其中k、u和x分别是等于或大于1的整数，前提是B和D中仅有一个与感兴趣的蛋白质的类似物连接，且另一前提是如果B与感兴趣的蛋白质的类似物相连，那么D与感兴趣的蛋白质的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的蛋白质的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的蛋白质的类似物相连。
额外的具体实施方式提供了可用于进行本发明的某些方法和形成本发明的某些组合物的试剂盒。在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的待分析物的试剂盒，包含：ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；含有ECL部分的第一载体，其中该第一载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；以及第二载体，该载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接。
本领域的技术人员将理解上述包括方法、组合物和试剂盒的任何具体实施方式也可包括多于一种的ECL部分，前提是各ECL部分在不同的波长发光。包含两种或多于两种ECL部分的组合物、方法和试剂盒可被用于例如检测样品中多于一种的待分析物。
本领域的技术人员将理解上述包括方法、组合物和试剂盒的任何具体实施方式也可包括多于一种的ECL部分，前提是各ECL部分在不同的波长发光。例如，当多于一种的待分析物可被检测时，多于一种的ECL部分是有用的。
本发明的其它目的和优点将在随后的说明书中部分地说明，且部分地根据说明书将是显而易见的或可以通过本发明的实践得以学习。通过所附权利要求中特别指出的元素和组合，本发明的目的和优点将被实现和获得。
应当理解的是，之前的一般性说明和之后的具体说明仅是示范性的和解释性的且不像权利要求一样对发明具有限制性。
附图说明
图1显示了本发明的某具体实施方式的示意图，其中感兴趣的待分析物是与聚苯乙烯珠粒相连的DNA分子，该聚苯乙烯珠粒也作为包含ECL标签的第一载体。还显示了第二珠粒，该珠粒是磁性的且作为与DNA分子连接的第二载体，该DNA分子和与聚苯乙烯珠粒相连的DNA分子互补。两个DNA分子结合形成复合体。将磁场施加到复合体上提供了将感兴趣的待分析物(例如DNA)分离的方法且ECL标签的检测提供了检测感兴趣的待分析物的方法。
图2显示了具有10μm直径的羧酸聚苯乙烯珠粒的荧光图像。图2(a)显示了在滞留了Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2后的珠粒，且图2(b)显示在亲和素共价结合到加载了Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2的珠粒的表面后的珠粒。使用的暴露时间是30秒。样本在λex 490nm被激发。
图3是在在探针DNA-磁珠偶联物(DNA-MB)与互补的DNA杂交后获得的扫描电子显微图(SEM)，该互补DNA与含有Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2的经亲和素包被的聚苯乙烯珠粒偶联(表示为DNA-Ru(II)PSB/亲和素)。使用的两种DNA分子的浓度是5μM，且PSB和MB的浓度分别是10μm和1.0μm。
图4显示了(a)循环伏安(CV)和(b)ECL响应，它们获自0.10μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2的乙腈(MeCN)溶液，该溶液含有0.10M(TBA)BF4电解质-0.10M三丙胺(TPrA)共反应物，在2.2mm直径的Pt电极，扫描速率为50mV/s。为了比较，在不存在TPrA的情况下，含有0.10M(TBA)BF4的处于MeCN中的1.0mMRu(bpy)3[B(C6F5)4]2的CV呈现在(c)中。(c)中的实验条件和(a)和(b)中的相同，但CV电流被乘以10。
图5显示了(a)TPrA和(b)TPrA-三氟乙酸(TFAA)浓度对ECL强度的影响。所有的样品在MeCN中含有0.10μMRu(bpy)3[B(C6F5)4]2和0.10M(TBA)BF4。工作电极是具有2.2mm直径的Pt电极。扫描速率为50mV/s。
图6显示了对TPrA-MeCN系统的ECL背景的去除。在(a)中，使用0.10M TPrA和0.10M(TBA)BF4-MeCN。在(b)中，使用(a)中相同的条件并添加0.055M TFAA。在(c)中使用与(b)中相同的条件并添加1.0％(v/v)H2O。在(d)中使用0.10M(TBA)BF4-MeCN。图6(e)显示了在(a)至(d)中描述的相对ECL强度。
图7显示了作为Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2浓度(a)和加载了Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2的10μm直径聚苯乙烯珠粒的数目(b)的函数的ECL强度。
图8显示了DNA杂交的ECL检测。图8(a)显示了在探针DNA-MB(1.0μm)和靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素(10μm)之间在MB/PSB＝29的比率时发生的DNA杂交。图8(b)显示了在探针DNA-MB(2.8μm)和靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素(10μm)之间在MB/PSB＝4的比率时发生的DNA杂交。
图9显示了使用(a)2.8μm和(b)1.0μm直径的链霉亲和素包被的MB与10μm直径的生物素化PSB反应的泊松分布实验。在将MB-PSB偶联物从反应基质中磁性分离后，从上清液中发现的PSB数量可以计算“结合的PSB％”。
图10显示了从荧光素生物素滴定实验获得的(a)滞留了Ru(bpy)3 2+的10μm直径的链霉亲和素包被的聚苯乙烯珠粒，(b)1.0μm直径的链霉亲和素包被的磁珠，以及(c)2.8μm直径的链霉素包被的磁珠对生物素化的23个核苷酸的ssDNA(p-ssDNA)的结合容量。
图11显示了DPA(a)和RUB(b)的分子结构。
图12是描述了将芳烃加载到聚苯乙烯珠粒中的流程中的步骤的流程图。
图13显示了(a)DPA加载的PSB；(b)RUB加载的PSB和(c)仅PSB的荧光图像。
图14显示了(a)溶解在MeCN中的加载了DPA的PSB和(b)使用TPrA作为共反应物的0.25mM DPA乙腈溶液的CV和ECL行为。
图15显示了(a)溶解在MeCN中的加载了RUB的PSB和(b)使用TPrA作为共反应物的35μM RUB乙腈溶液的CV和ECL行为。
图16显示了ECL信号和C反应性蛋白(CRP)浓度之间的关系。
具体实施方式
A、定义
在此使用的术语“抗体”指免疫球蛋白或其一部分，且包含任何多肽，该多肽包含不论来源、制备的方法或其它特征的抗原结合位点。该术语包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性(monospecific)抗体、多特异性(polyspecific)抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂交(hybrid)抗体、突变抗体和CDR移植抗体。抗体的一部分可以包括能够结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。
在此使用的术语“感兴趣的待分析物”指任何分子、或分子的聚集物，包括在样品中发现的病毒的细胞或细胞组分。同样包括在样品中发现的任何分子的片段。感兴趣的待分析物可以是有机化合物、有机金属化合物或无机化合物。感兴趣的待分析物可以是核酸分子(例如DNA、RNA、质粒、载体或寡核苷酸)、蛋白质(例如抗体、抗原、受体、受体配体或肽)、脂蛋白、糖蛋白、核糖核蛋白或脱氧核糖核蛋白、肽、多糖、脂多糖、脂质、脂肪酸、维生素、氨基酸、药物化合物(例如镇定剂、巴比妥酸盐、鸦片剂、醇、三环抗抑郁剂、苯二氮卓、抗病毒剂、抗真菌抗生素、类固醇、强心苷类、或上述任何化合物的代谢产物)、激素、生长因子、酶、辅酶、脱辅基酶、半抗原、lechtins、底物、细胞代谢产物、细胞组分或细胞器(例如细胞膜、细胞壁、核糖体、染色体、线粒体、或细胞骨架组分)。该定义中还包括毒素、杀虫剂、除草剂和环境污染物。该定义进一步包括复合体，该复合体包含一种或多种在该定义内提供的任何实例。
在此使用的术语“感兴趣的待分析物的类似物”指与感兴趣的待分析物竞争结合特异性结合伴侣的物质。感兴趣的待分析物的类似物可以是已知量的感兴趣的待分析物本身，这些待分析物被加入从而与样品中存在的感兴趣的待分析物竞争结合特异性结合伴侣。
在此使用的术语“载体”指一种或多种固体或液体包装物质。载体可包含有机或无机化合物且其可被用于以下至少一种用途：呈现样品，呈现特异性结合伴侣，或包含或滞留ECL部分。以下进一步具体说明载体。
在此使用时的术语“包含”或“被包含”指载体内部和ECL部分之间的非特异性结合，由此ECL部分与载体相互存在物理接触，但并非必须相互附着。在本发明的某些具体实施方式中，在载体中包含的ECL部分可以与载体相连。在某些具体实施方式中，载体中包含的ECL部分不与载体相连。术语包含/被包含可与术语“被装入/装入”和“被滞留/滞留”互换使用。
在此使用的术语“杂交”指在合适条件下，一个核苷酸序列和第二核苷酸序列之间双链的形成。在某些具体实施方式中，合适的条件可以是严格条件。严格条件是序列依赖性的且在不同环境下将是不同的。更长的序列在更高的温度下特异性杂交(见例如Sambrook等人.1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.和Ausubel等人.1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y)。通常，在确定的离子强度和pH下，对于特定序列，将选择严格条件选择为比热融解点(Tm)低大约5℃。Tm是一温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下，与目标序列互补的多核苷酸的50％与目标序列杂交平衡。典型地，严格条件将是这样的条件，其中盐浓度小于大约1.0M钠离子、典型地大约0.05至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，且温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)而言至少大约30℃，且对于长探针(例如大约50个核苷酸)至少大约60℃。也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺获得严格条件。溶液中甲酰胺的浓度每增加1％，DNA双链的Tm降低大约0.7℃。
杂交可以发生在100％互补的多核苷酸之间，即当双链核酸的两条链之间没有错配时。当在双链核酸的两条链之间存在错配时，杂交也可以发生。在此使用的互补杂交指核酸的两条链之间的杂交，其中在双链核酸的两条杂交链间存在不多于一个错配。
在此使用的术语“连接”包含在两个部分之间的直接共价连接，两个部分之间的直接非共价连接，以及通过一个或多个额外部分介导的两个部分之间的间接连接。例如，两个部分之间的直接共价连接可包括两个氨基酸之间的酰胺键，两个部分之间的直接非共价连接可包括金属和碱之间形成盐的离子相互作用，或在两个水分子之间的氢键。由一个或多个额外的部分介导的两个部分之间的间接连接可包括融合蛋白例如Ig融合蛋白和受体例如TNF受体，其中在Ig和TNF受体之间的连接通过连接子介导，该连接子例如为短氨基酸序列而不是Ig或TNF受体本身的。
术语“连接”不包含由感兴趣的待分析物介导的连接。
在此使用的术语“可磁化的”指物质的一种性质，其中该物质的可穿透性不同于自由空间的可穿透性。该术语包括可顺磁化的和超顺磁化的(superparamagnetizable)。
在此使用的术语“核酸”指由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成的单链或双链形式的聚合物。典型地，单链核酸将包含多于100个碱基且双链核酸将包含多于100个碱基对。术语“核酸”包括含有天然生成的核苷酸以及天然核苷酸类似物的核酸，该类似物与参照核酸具有相似的结合性质。术语核酸还包括由cDNA或基因编码的mRNA。核酸将能够通过互补碱基配对例如通过氢键与其互补物杂交。
在此使用的术语“寡核苷酸”指典型地少于或等于100个碱基长度的单链核酸。当然，互补寡核苷酸可以退火形成双链多核苷酸。在此使用的寡核苷酸可包括天然的(即A、G、C、T或U)或经修饰的碱基。此外，如果键不干扰链间碱基配对，寡核苷酸中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键被连接。因此，例如，寡核苷酸可以是肽-核酸，其中构成的碱基通过肽键而非磷酸二酯键连接(见例如Nielson，2001，Current Opinion in Biotechnology 12：16)。本领域技术人员将理解寡核苷酸可以和与探针序列缺乏完全互补性的序列杂交，且在此所述的方法可被用于在完全互补的结合和不能完全互补的结合之间加以区分。非必须地，寡核苷酸可用放射性同位素、发色团、lumiphores、色原体、或ECL部分直接标记或可用例如生物素间接标记，该生物素随后可被链霉亲和素或亲和素复合体结合。
在此使用的术语“多核苷酸”指由多于2个核苷酸并少于100个核苷酸组成的聚合物。
在此使用的术语“样品”指任何来自或源自生物系统的样本。生物系统包括生态系统(例如水、空气或土壤样本)或生物体(例如植物、动物、真菌、细菌、其它真核生物或原核生物)、病毒或朊病毒。样品可包含感兴趣的待分析物。术语样品也可包含分离的例如经纯化的感兴趣的待分析物。
在此使用的术语“特异性结合伴侣”指在生理条件下能够与第二分子形成相对稳定复合体的第一分子。通常，特异性结合的特征在于相对高的亲和力以及相对低至中等的容量。非特异性结合通常具有低亲和力以及中等至高的容量。典型地，当亲和常数Ka高于大约106M-1，或高于大约108M-1时，结合被认为是特异性的。更高的亲和常数说明更高的亲和力且因此更高的特异性。抗体典型地以106M-1至109M-1或更高的范围内的亲和常数与抗原结合。如果希望，可以通过变化结合条件在几乎不影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。这样的条件是本领域已知的，且使用常规技术的技术人员能够选择合适的条件。可以通过例如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、不相关分子(例如血清白蛋白、奶酪蛋白)的浓度等对条件进行限定。
特异性结合伴侣的实例包括互补核酸序列(例如相互杂交的两条DNA序列、相互杂交的两条RNA序列；或相互杂交的DNA和RNA序列)、抗体和抗原、受体和配体(例如TNF和TNFr-I、CD142和因子VIIa、B7-2和CD28、HIV-1和CD4、ATR/TEM8或CMG与炭疽热毒素的保护性抗原部分)、酶和底物、或分子和结合蛋白(例如维生素B12和内因子、叶酸和叶酸结合蛋白)。特异性结合伴侣也可以是天然存在的特异性结合伴侣的类似物。类似物的实例包括叠氮胸苷(AZT)，与HIV反转录酶结合的核苷酸的类似物；嘌呤霉素，氨酰基-tRNA的末端胺酰基-腺苷部分的类似物；以及甲氨蝶呤，四氢叶酸的类似物。其它类似物可以是感兴趣的待分析物的衍生物。
B、电化学发光底物
在某些具体实施方式中，本发明提供了使用ECL检测样品中感兴趣的待分析物的方法。ECL部分可以是任何化合物，通过将该化合物直接暴露于电化学能量源，该化合物可被诱导重复发射电磁辐射。在某些具体实施方式中，ECL部分在共反应物的存在下可被诱导重复发射电磁辐射。在某些具体实施方式中，ECL部分可包含含有金属的有机化合物，其中该金属选自例如钌、锇、铼、铱、铑、铂、钯、钼和锝。在本发明的某些具体实施方式中，该金属是钌或锇。该金属也可以选自例如稀土金属，包括但不限于铈、镝、铒、铕、钆、钬、镧、镥、钕、镨、钷、铽、铥和镱。在本发明的某些具体实施方式中，该金属是铈、铕、铽或镱。
根据本发明的某些具体实施方式，根据本发明的含有金属的ECL部分具有以下分子式
         M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s
其中M是金属；P是M的多齿配体；L1、L2、L3、L4、L5和L6是M的配体，各配体可以是相同的或配体之间相互是不同的；m是等于或大于1的整数；n、o、p、q、r和s是等于或大于零的整数；且P、L1、L2、L3、L4、L5和L6具有的组成和数量使得ECL部分可被诱导发射电磁辐射且由M的配体提供给M的键的总数量等于M的配位数。
在本发明的某些具体实施方式中，M是钌。在本发明的某些具体实施方式中，M是锇。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分具有M的一个多齿配体。在某些具体实施方式中，ECL部分具有多于一个的多齿配体。在包含多于一个的M的多齿配体的具体实施方式中，多齿配体可以是相同的或不同的。多齿配体包括芳香族和脂肪族配体。合适的芳香族配体包括芳香族杂环配体且可以是含氮的，例如联吡啶、联吡唑(bipyrazyl)、三联吡啶、1，10-邻二氮杂菲和卟啉。
合适的多齿配体可不被取代或被本领域已知的大量取代基中的任何取代基取代。合适的取代基包括例如烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基(carboxaldehyde)、酰胺基、氰基、氨基、羟基、亚氨基、羟基羰基、氨基羰基、脒、胍盐、酰脲、马来酰亚胺含硫基团、含磷基团和N-羟基琥珀酰亚胺的羧酸酯。
此外，L1、L2、L3、L4、L5和L6中至少一个可以是多齿芳香族杂环配体。此外，至少一个这样的多齿芳香族杂环配体可包含氮。合适的多齿配体包括但不限于联吡啶、联吡唑、三联吡啶、1，10-邻二氮杂菲、卟啉、取代联吡啶、取代联吡唑、取代三联吡啶、取代1，10-邻二氮杂菲或取代卟啉。这些取代多齿配体可以由烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基、酰胺基、氰基、氨基、羟基、亚氨基、羟基羰基、氨基羰基、脒、胍盐、酰脲、马来酰亚胺含硫基团、含磷基团和N-羟基琥珀酰亚胺的羧酸酯所取代。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分可包含两个二齿配体，各配体可以是联吡啶、联吡唑、三联吡啶、1，10-邻二氮杂菲、取代联吡啶、取代联吡唑、取代三联吡啶、或取代1，10-邻二氮杂菲。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分可包含三个二齿配体，各配体可以是联吡啶、联吡唑、三联吡啶、1，10-邻二氮杂菲、取代联吡啶、取代联吡唑、取代三联吡啶、或取代1，10-邻二氮杂菲。ECL部分可包含钌。在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分可包含钌、两个二齿联吡啶配体和一个取代二齿联吡啶配体。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分可包含四齿配体如卟啉或取代卟啉。
ECL部分可以具有一个或多个单齿配体，广泛的单齿配体是本领域已知的。合适的单齿配体包括例如一氧化碳、氰化物、异氰化物、卤化物和脂肪族、芳香族和杂环膦、胺、锑化氢和胂。
该ECL部分的某些具体实施方式包含双(2，2’-联吡啶)钌(II)和三(2，2’-联吡啶)钌(II)。
本发明的M的一个或多个配体与额外的化学标签相连在本发明的范围内，所述化学标签例如放射性同位素、荧光组分、或其它的发光的含有钌或锇的中心。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分是三(2，2’-联吡啶)钌(II)四(五氟苯基)硼酸盐。在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分是双[(4，4’-甲酯基)-2，2’-联吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2’-联吡啶-4-基)丙基]-1，3-二氧戊环钌(II)。在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分是双(2，2’-联吡啶)[4-(丁-1-醛)-4’-甲基-2，2’-联吡啶]钌(II)。在本发明的进一步的具体实施方式中，ECL部分是双(2，2’-联吡啶)[4-(4’-甲基-2，2’-联吡啶-4’-基)-丁酸]钌(II)。在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分是(2，2’-联吡啶)[顺式-双(1，2-二苯基膦)乙烯基]{2-[3-(4-甲基-2，2’-联吡啶-4’-基)丙基]-1，3-二氧戊环)锇(II)。在本发明的进一步的实施方式中，ECL部分是双(2，2’-联吡啶)[4-(4’-甲基-2，2’-联吡啶)-丁胺]钌(II)。在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分是双(2，2’-联吡啶)[1-溴-4(4’-甲基-2，2’-联吡啶-4-基)丁烷]钌(II)。在本发明的更进一步的实施方式中，ECL部分是双(2，2’-联吡啶)马来酰亚胺己酸，4-甲基-2，2’-联吡啶-4’-丁胺钌(II)。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分不包含金属且可以是例如红荧烯(rubrene)或9，10-二苯基蒽。
在某些具体实施方式中，ECL部分可被包含在或装入载体中。装入或被吸附在载体上的ECL分子的数量将依赖于ECL分子的大小和载体的大小。载体可包含1×102-1×1020、1×102-1×1015、1×104-1×1012、1×102-1×1010、1×106-1×1010或1×106-1×109个ECL分子。在某些具体实施方式中，ECL部分可被包含或被装入载体中且连接在载体表面，例如通过共价键或非共价相互作用被连接。
在此使用的术语“ECL共反应物”在此涉及化合物，该化合物本身或通过其电化学还原氧化产物在ECL反应序列中发挥作用。
通常ECL共反应物允许使用更简单的方法生成ECL(例如仅使用两步骤氧化还原循环中的一半)和/或提高的ECL强度。在某些具体实施方式中，共反应物可以是如下的化合物，该化合物通过电化学氧化/还原在溶液中直接产生或通过进一步的反应产生强氧化或还原物质。共反应物可以是过氧化二硫酸盐(即S2O8 2-，过硫酸盐)，该盐被不可逆地电还原形成氧化SO4·-离子。共反应物也可以是草酸盐(即C2O4 2-)，该盐被不可逆地氧化形成还原CO2·-离子。可以发挥还原剂作用的一类共反应物是胺或含有胺基团的化合物，包括例如三正丙胺(即N(CH2CH2CH2)3，TPrA)。在某些具体实施方式中，叔胺是比仲胺更好的共反应物。在某些具体实施方式中，仲胺是比伯胺更好的共反应物。
共反应物包括但不限于林肯霉素；氯林可霉素-2-磷酸盐；红霉素；1-甲基吡咯烷酮；地芬尼多；阿托品；曲唑酮；氢氟噻嗪；二氢氯噻；氯林可霉素；四环素；链霉素；庆大霉素；利血平；三甲胺；三正丁基膦；哌啶；N，N-二甲基苯胺；非尼拉敏；溴苯那敏；氯苯纳敏；二苯羟基胺；2-二甲基氨基吡啶；吡拉明；2-苄基氨基吡啶；亮氨酸；缬氨酸；谷氨酸；苯丙氨酸；丙氨酸；精氨酸；组氨酸；半胱氨酸；色氨酸；酪氨酸；羟脯氨酸；天冬氨酸；甲硫氨酸；苏氨酸；丝氨酸；环噻嗪；三氯噻嗪；1，3-二氨基丙烷；哌嗪；氯噻嗪；hydrazinothalazine；巴比妥酸；过硫酸盐；青霉素；1-哌啶基乙醇；1，4-二氨基丁烷；1，5-二氨基戊烷；1，6-二氨基己烷；乙二胺；苯磺酰胺；四甲基砜；乙胺；二乙基胺；三乙基胺；三异丙基胺；二正丙基胺；二异丙基胺；二正丁基胺；三正丁基胺；三异丁基胺；二异丁基胺；仲丁胺；叔丁胺；二正戊基胺；三正戊基胺；正己基胺；硫酸肼；葡萄糖；n-甲基乙酰胺；膦酰基乙酸；和/或它们的盐。
共反应物还包括但不限于N-乙基吗啉；金雀花碱；三正丁基胺；哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)；三乙醇胺；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；三乙烯二胺；乙二胺四乙酸；草酸；1-乙基哌啶；二正戊基胺；N，N，N’，N’-四丙基-1，3-二氨基丙烷；DAB-AM-4，聚丙烯基亚胺四胺树枝状聚合物；DAB-AM-8，聚丙烯基亚胺八胺树枝状聚合物；DAB-AM-16，聚丙烯基亚胺十六胺树枝状聚合物；DAB-AM-32，聚丙烯基亚胺三十二胺树枝状聚合物；DAB-AM-64，聚丙烯基亚胺六十四胺树枝状聚合物；3-(N-吗啉基)丙磺酸；3-吗啉基-2羟基丙磺酸；双甘氨肽；2-吗啉基乙磺酸；2，2-双(羟甲基)-2，2’，2”-三乙醇胺；N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸；N，N-双(2-羟乙基)牛磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)；N，N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸；4-(N-吗啉基)丁磺酸；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)水合物；哌嗪-1，4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸；N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)；和/或它们的盐。
根据本发明的ECL测量可以在有机溶剂例如乙腈、在部分水性系统或在水性系统中进行。用于ECL部分的电化学还原的合适电极可以是例如铂电极或由铂铱合金组成的电极。
C.载体
在某些具体实施方式中，本发明提供了可用于检测感兴趣的待分析物的第一和第二载体。该第一和第二载体能够提供若干功能中的至少一种，包括样品的呈现、特异性结合伴侣的呈现、ECL部分的包含或滞留、以及提供用于将在感兴趣的待分析物和特异性结合伴侣之间形成的复合体从组合物的其它组分中分离出来的手段。
第一或第二载体可包含ECL部分。在某些具体实施方式中，ECL部分可被包含在载体中。因为ECL部分被包含在载体内，本发明提供了将ECL部分从载体中容易地释放出来的方法，例如通过改变某些条件如溶剂的性质。在某些具体实施方式中，例如当载体是由诸如塑料的材料组成的固体支持物时，ECL部分不与载体混合。在某些具体实施方式中，ECL部分可以与载体的表面共价连接并包含在载体内。在某些具体实施方式中，ECL部分可以包含在载体内且被吸附在载体的表面。第一载体非必须地可由包含感兴趣的待分析物的样品组成。在某些具体实施方式中，样品可与第一载体的表面连接，由此使其能够结合特异性结合伴侣。然而，在某些具体实施方式中，样品可以不与第一或第二载体连接。在该具体实施方式中，样品可以在溶液中。
在某些具体实施方式中，第一或第二载体可包含感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣。特异性结合伴侣可与第一载体的表面连接由此使其可被接近从而结合感兴趣的待分析物。
在包含第二载体的本发明的具体实施方式中，该第二载体可包含感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣。该特异性结合伴侣可与第二载体的表面连接由此使其可被接近从而结合感兴趣的待分析物。第二载体可包含用于分离在感兴趣的待分析物和特异性结合伴侣之间形成的复合体的手段。在某些具体实施方式中，第二载体可提供将在感兴趣的待分析物和特异性结合伴侣之间形成的复合体从组合物的其它组分中分离出来的手段。例如，第二载体可以是可磁化的，通过使用磁体使得在感兴趣的待分析物和特异性结合伴侣之间形成的复合体从组合物的其它组分中分离出来。在本发明的某些具体实施方式中，用于将复合体从组合物的其它组分中分离的磁体可位于电极附近，该电极可被用于将电化学能引入系统中，如例如美国专利号5,935,779和6,325,973中所述。
在某些具体实施方式中，第一和第二载体中的至少一个可以是固体支持物。在某些具体实施方式中，第一和第二载体均为固体支持物。固体支持物可包含颗粒，即在至少一维具有大于1000微米的长度的聚合物；纳米颗粒，即在至少一维具有1-1000纳米范围内的长度的聚合物；或微颗粒，即在至少一维具有大于1000纳米但小于或等于1000微米的长度的聚合物。在某些具体实施方式中，固体支持物可具有三维形状，包括不规则和规则形状，例如球形、立方体、圆锥形。
固体支持物可包含珠粒、凝胶或膜。膜可包含例如硝化纤维、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)或羧化聚亚乙烯(美国专利号6,037,124)。膜可以用聚乙烯基苄基二甲基羟乙基氯化铵、聚乙烯基苄基苯甲酰基氨基乙基二甲基氯化铵、聚乙烯基苄基三丁基氯化铵、聚乙烯基苄基三己基氯化铵和聚乙烯基苄基三丁基氯化铵的共聚物、聚乙烯基苄基苄基二甲基氯化铵和聚乙烯基氨基乙基二甲基氯化铵的共聚物以及聚乙烯基苄基苯基脲基乙基二甲基氯化铵和聚乙烯基苄基苄基二甲基氯化铵的共聚物包被(美国专利号5,336,596)。固体支持物可包含任何材料，只要该材料可与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣和/或样品结合(例如聚苯乙烯、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶)和/或该材料能够包含或滞留ECL部分。固体支持物可包含任何合成的有机聚合物例如聚丙烯酸、乙烯聚合物、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈(polyacylonitrile)和聚烯烃。固体支持物也可以包含碳水化合物聚合物例如琼脂糖、纤维素、透明质酸、几丁质、酰基结冷胶(gellan)、右旋糖苷、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、羧甲基几丁质、聚(丙交酯-共-乙二醇)。固体支持物可包含无机氧化物，例如硅石、氧化锆、例如碳包覆的氧化锆(美国专利号5,182,016)、氧化钛、二氧化铈、氧化铝、锰、镁氧(即氧化镁)、氧化钙、可控孔径玻璃(CPG)。固体支持物也可以包含以上提及的一些支持物的组合，包括但不限于右旋糖苷-丙烯酰胺。可以制备固体支持物将其与特异性结合伴侣和/或感兴趣的待分析物之间的非特异性相互作用最小化。
在第一或第二载体至少其中之一是固体支持物的某些具体实施方式中，固体支持物可以是在水性环境中不溶但在有机环境中可溶的，有机环境例如乙腈、醚、氯仿、苯。对于ECL部分被滞留或与这样的固体支持物相连的具体实施方式，可以通过将固体支持物置于有机环境中释放出ECL部分，由此促进ECL部分的检测。有机环境可包括为70-100％、80-100％、90-99％、99-99.99％有机溶剂(体积/体积)的溶剂。
在本发明的某些具体实施方式中，第一或第二载体至少其中之一是凝胶，该凝胶具有在30-60℃范围内的熔点，例如低融解温度琼脂糖。在这些具体实施方式中，在含有ECL部分的载体的熔点之上加热复合体将释放出ECL部分且由此促进检测。
在某些具体实施方式中，固体支持物是珠粒，例如聚苯乙烯珠粒。在第一和第二载体均为珠粒的具体实施方式中，第一载体可具有包含或滞留在其中的ECL部分，且第二载体可以是可磁化珠粒。包含ECL的珠粒和可磁化珠粒均可具有在0.1μm-100μm、0.5μm-50μm、1μm-20μm或0.5μm-10μm范围内的直径。在某些具体实施方式中，第一载体可具有10μm的直径且第二载体可具有1μm的直径。在某些具体实施方式中，第一载体可具有10μm的直径且第二载体可具有2.8μm的直径。
在本发明的某些具体实施方式中，至少一个载体可包含液体。该液体可包含至少一种两性分子。该两性分子是同时具有极性和非极性部分且能够在水性环境中形成聚集物例如微团的分子。因此，微团可以由任何脂肪酸离子例如棕榈酸盐或油酸盐组成。微团可包含一种或多种非离子去垢剂例如Triton X-100或辛基-β-D-葡糖苷。微团可包含一种或多种离子去垢剂例如十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸、溶血卵磷脂。在某些具体实施方式中，微团可同时包含离子和非离子去垢剂。
因此，在某些具体实施方式中，第一和第二载体至少其中之一可以是微团。该微团可以与样品连接，由此感兴趣的待分析物被暴露于微团的表面，因而允许特异性结合伴侣接触感兴趣的待分析物。ECL部分可被包含在微团的内部。例如通过搅拌或超声处理或氧化或还原对微团的破坏将因此提供释放ECL的方式且促进了对感兴趣的待分析物的检测。
在某些具体实施方式中，载体可以是脂质体。脂质体是当磷脂被水合时形成的微观球形囊。当在低剪切力条件下与水混合时，磷脂以片层状排布，分子以类似的方向并排排列，“头部”向上且“尾部”向下。这些片层随后尾尾相连形成具有水性中心的磷脂球中的双层膜。脂质体可以具有均一的尺寸，例如直径200nm。脂质体使得水溶性和水不溶性材料可以在制剂中一同使用而不需要使用表面活性剂或其它乳化剂。水溶性材料被溶于水，磷脂在该水中被水合，且当脂质体形成时，这些材料被滞留在水性中心内。脂质体壁是磷脂膜，容纳脂溶性材料例如油。脂质体可由稳定的天然磷脂混合物、合成的相同链磷脂、含有糖脂的脂质体、两极的脂肪酸、甲基/亚甲基x-相连的、脂蛋白包被的或碳水化合物包被的组成。样品可以呈现在脂质体的表面以促进特异性结合伴侣或样品的结合。脂质体中(即在水性中心或在外周脂质中)可包含ECL部分，见例如美国专利号6,706,861。
D.将样品或特异性结合伴侣与载体连接的方法
可以通过本领域已知的任何方法将含有感兴趣的待分析物或特异性结合伴侣的样品连接。例如，交联剂可被用于蛋白质和核酸(Lund等人.1988，Nucleic Acids Res.16：10861)。类似地，光反应交联剂已被用于核酸和蛋白质(Penchovsky等人.2000，Nucleic Acids Res.28(22)：98；Harrison等人.1989，Biochemistry 28：6023)。合适方法的选择将依赖于样品的性质和载体的性质。该连接可以例如通过共价键、非共价相互作用例如静电相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用、范德华相互作用或氢键。选择连接样品与载体的方法是本领域的普通技术。
在某些具体实施方式中，通过在配体上的特定官能团(例如伯胺、巯基、羧酸、醛)与载体上的反应活性基团之间形成共价化学键，配体被直接固定或“连接”至载体上。
其它的连接方法也是可能的，包括但不限于使用生物素和亲和素或链霉亲和素作为连接子。使用生物素/亲和素链霉亲和素作为连接子的方法是本领域已知的(见Wilchek和Bayer，Eds.Methods inEnzymology vol.184，Academic Press，San Diego 1990)。在某些具体实施方式中，N-羟基马来酰亚胺(NHS)被用于形成生物素的NHS酯。生物素残基可以与各种官能团连接，所述官能团包括但不限于赖氨酸残基上的伯胺，谷胺酰胺或天冬酰胺残基上的羧基部分，或半胱氨酸残基上的巯基部分。在用溴化氰(CNBr)活化载体后，亲和素可通过赖氨酸上的氨基与载体共价连接。
在某些具体实施方式中，样品或结合伴侣可被简单地吸附在载体的表面上。例如，抗体可被吸附在聚苯乙烯微球体的表面上。在希望将蛋白吸附在载体表面的具体实施方式中，为了最大的表面覆盖率(达到单层)，可将溶液的pH调节至蛋白质的等电点或比等电点略微偏碱性。使用稀释的微球体悬浮液(大约1％固体)确保单个微球体的包被。尽管大约0.1mg/ml的蛋白质终浓度通常足够实现单层蛋白，添加该量的大约3至大约10倍量来保证最佳的化学计量和良好的结合驱动力。
可以修饰载体的表面以促进样品或特异性结合伴侣的共价连接。经表面修饰的聚合微球体通常这样制备：将苯乙烯与少量(少于大约5％)的功能性单体例如丙烯酸共聚合，由此生成被-COOH基团包被的微球体。其它单体可被用于制备具有不同表面化学性质的微球体，见例如美国专利号5,599,889。
在硅石微球体表面的天然硅烷醇基团可与基于水或溶剂的硅烷连接剂反应生成具有多种表面官能团的预活化的硅石微球体。实例包括氯甲基、羧基和氨基基团。DNA和RNA可在离液剂(chaotropicagents)的存在下被吸附在硅石上。寡核苷酸可通过5’-氨基末端共价连接至经表面修饰的硅石上。脂质可以通过脂肪酸链上的羧基与硅石上的丙胺表面基团连接，如Boom等人.，1990，J.Clin.Microbiol.，28：495所述。
感兴趣的待分析物或特异性结合伴侣可被引入微团，见例如Savic等人.，2003，Science 300：615；Maysinger等人.，2001，Biochim.Biophys.Acta.1539(3)：205。可以例如通过将蛋白质的6M盐酸胍(Gdn·HCl)溶液缓慢地稀释进过量的重折叠缓冲液(例如3％二己酰基磷脂酰胆碱，20mM Tris·HCl/5mM EDTA/0.6M L-精氨酸，pH 8.5)中，进行蛋白质在去垢剂微团中的溶解和重建。在通过例如透析去除残留Gdn-HCl后，可通过各种技术包括超滤将溶液浓缩。见例如Fernandez等人.2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2358。
感兴趣的待分析物或特异性结合伴侣可被引入脂质体中。将蛋白质引入脂质体中的很多方法是已知的(见例如Rigaud.，等人.，″Liposomes as Tools for the Reconstitution of Biological Systems，″p.71-88，in Liposomes as Tools in Basic Research and Industry，ed.Philippot，J.R.and Schuber，CRC Press，Boca Raton，Fla.(1995))。作为实例，机械方法例如超声破碎仪(sonicator)或法式压滤机(Frenchpress)可被用于通过在过量缓冲液中膨胀和干燥磷脂膜生成单层囊(Lelkes等人.，1985，J.Biol.Chem.260：1796)。可替换地，蛋白质可自发地结合进通过低的胆酸盐或溶血卵磷脂浓度的催化预先形成的脂质体中(Wrigglesworth等人.，1987，Biochem J.246(3)：737)。在磷脂和去垢剂的存在下，蛋白质也可以被共稳定，形成微团后随后去除去垢剂。可以通过逆向蒸发法并用不同量的去垢剂例如Triton X-100、辛基葡糖苷或胆酸钠进行处理来制备大脂质体。在溶解过程的每一步，蛋白质可以被添加。随后可对蛋白质-磷脂去垢剂混合物进行SM2Bio-Beads处理以去除去垢剂(Rigaud等人.，1988，Biochemistry27(8)：2677)。通过在溶液中提供膜蛋白，提供预先形成的脂质体的溶液；并将混合物共同放置，膜蛋白可以被结合进脂质体。在提供预先形成的脂质体的溶液这一步之前，通过将磷脂混合物与至少一种类型的不饱和脂肪酸溶液混合而形成脂质体(美国专利号6,706,861)。本领域技术人员将认识到有很多其它方法连接样品和载体。
E.将ECL部分加载至载体中的方法
在某些具体实施方式中，ECL部分可以与载体的表面连接。以上说明的关于将样品与载体连接的方法可以类似地被用于将ECL部分连接至载体上。当载体是固体支持物例如珠粒时，ECL部分可以例如通过共价键、非共价相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用、范德华相互作用或氢键连接至载体表面。
在本发明的某些具体实施方式中，ECL部分可溶于有机溶剂但不溶于水性溶剂。可将ECL部分溶解在有机溶剂中并随后将其与大量的载体颗粒混合，例如由疏水材料如聚苯乙烯组成的珠粒。含有ECL部分的有机溶剂渗透入载体的孔内且通过有机溶剂的蒸发，ECL部分被滞留或装入载体的内部。当珠粒被溶剂化在水性溶剂中时，ECL部分的绝大部分或全部仍然装在载体内。在某些具体实施方式中，载体是聚苯乙烯珠粒。在某些具体实施方式中，通过在含有ECL部分的溶液中形成凝胶，ECL部分可被结合进凝胶中。在某些具体实施方式中，通过在含有ECL部分的溶液中形成微团，ECL部分可被结合进微团中。在某些具体实施方式中，通过在含有ECL部分的溶液中形成脂质体，ECL部分可被结合进脂质体中。
在某些具体实施方式中，ECL部分可以被滞留在载体内而基本没有损失在周围介质中。在制备和使用过程中，ECL部分损失在周围的液相中是不希望的。载体滞留ECL部分的能力可通过被称作分配系数的重要物理常数来根本地说明。分配系数是K＝C载体/C液体，其中C载体是被吸收进载体的ECL部分的浓度而C液体是没有被吸收的ECL部分的浓度。
在两相系统(载体和液体)中，具有大于1的分配系数的ECL部分显示了对载体相的偏好。高的分配系数值说明了对载体相的强烈偏好。相反地，具有小于1的分配系数的ECL部分将偏好液相。起初在载体内具有高水平的ECL部分的低分配系数系统将有ECL部分损失在周围的液相中。
在某些具体实施方式中，载体和水溶剂之间的分配系数大于大约2。在某些具体实施方式中，载体和水溶剂之间的分配系数大于大约10。在某些具体实施方式中，载体和水溶剂之间的分配系数大于大约100。存在若干化学和物理设计以获得高分配系数。(1)通过库仑引力，ECL部分可被维持在载体上。在该情况中，ECL部分可具有净正电荷且载体具有净负电荷。(2)在某些具体实施方式中，ECL部分在载体相中的溶解度可以大很多。例如，ECL部分在水中是不溶的但在亲脂聚苯乙烯载体中是可溶的。(3)在某些具体实施方式中，因为载体的微观孔隙率小于ECL部分的直径，ECL部分可被滞留在载体内内。(4)在某些具体实施方式中，ECL部分可通过共价键被连接在载体上。
F.检测感兴趣的待分析物的方法
本发明提供了检测在样品中包含的感兴趣的待分析物的各种方法。在本发明的某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物可与载体例如第一载体连接。感兴趣的待分析物可存在于载体表面上由此促进其进入特异性结合伴侣。在某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物可不与任何载体相连。在某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物可存在于溶液中。
本发明的方法提供了至少一种能够与感兴趣的待分析物特异性结合的特异性结合伴侣。在某些具体实施方式中，至少一种特异性结合伴侣可与载体连接。在该具体实施方式中，样品可与第二载体连接。
在某些具体实施方式中，至少一种特异性结合伴侣可以是能够与感兴趣的分子特异性结合的结合蛋白。结合伴侣可与载体连接。在该具体实施方式中，样品可与第二载体连接。
在某些具体实施方式中，至少一种特异性结合伴侣可以是能够与感兴趣的待分析物特异性结合的寡核苷酸或核酸。结合伴侣可与载体连接。在该具体实施方式中，样品可与第二载体连接。
在某些具体实施方式中，本发明提供了两种特异性结合伴侣，即第一和第二特异性结合伴侣，两者均与感兴趣的待分析物特异性地结合。两种特异性结合伴侣均可以与载体连接。因此，在某些具体实施方式种，第一特异性结合伴侣可与第一载体连接且第二特异性结合伴侣可与第二载体连接。在该具体实施方式种，样品可不与任何载体连接。相同的特异性结合伴侣可与第一和第二载体均发生连接也在预期中。在某些具体实施方式中，与感兴趣的待分析物特异性结合的多克隆抗体可以与第一和第二载体均发生连接。在某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物可包含表位的多个拷贝，该表位可被多克隆抗体识别，或当待分析物是核酸时，其可包含序列的多重重复，该序列被与第一和第二载体连接的探针识别。在某些具体实施方式中，至少一种特异性结合伴侣可以是抗体。特异性结合伴侣可均为抗体也在预期中。本发明还包含如下具体实施方式，其中一个特异性结合伴侣可以是抗体且第二特异性结合伴侣可以是特异性结合蛋白。
在某些具体实施方式中，至少一种特异性结合伴侣可以是能够与样品中感兴趣的分子杂交的寡核苷酸。和抗体一样，特异性结合伴侣可均为寡核苷酸或与样品中感兴趣的分子杂交的其它核酸也在预期中。
ECL部分可以通过本领域熟知的方法加以检测，包括例如发射和吸收光谱法，例如紫外吸收、红外吸收和荧光发射；原子吸收、电化学，例如阳极溶出伏安法；中子活化和化学法。在某些具体实施方式中，使用光致发光、化学发光和电化学发光法。在本发明的某些具体实施方式中，可以通过诱导ECL部分发射电磁辐射并检测发出的辐射来确定化学部分的存在。在本发明的某些具体实施方式中，通过将试剂混合物暴露于电磁能、化学能或电化学能，可以诱导ECL部分发射电磁辐射。在本发明的某些具体实施方式中，通过将试剂混合物暴露于化学能或电化学能，可以诱导ECL部分发射电磁辐射。在某些具体实施方式中，加入共反应物以帮助检测ECL部分，例如TPrA。
使用发光技术可以在很低的浓度测定Ru(bpy)3 2+。使用氧化还原法，可能检测到浓度为5×10-8M的Ru(bpy)3 2+。草酸钠(1mM)的磷酸盐缓冲液pH 5.0与0至+1.4伏特的脉冲势能以5至10秒的间隔被用于饱和的甘汞参照电极。使用18mM Na2S2O8和0.1M四正丁基四氟硼酸铵的CH3CN∶H2O(1∶1v/v)溶液，可以检测浓度低至10-13M的Ru(bpy)3 2(见例如美国专利号6,140,138；5,731,089；5,714,089)。
本发明还提供了将ECL部分用于检测感兴趣的待分析物的实验的方法，该方法包括：
(a)形成具有如下化学式的复合体：
                  (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中，在某些具体实施方式中，A是ECL部分，通过直接暴露于电化学能量源，该部分可被诱导重复发射电磁辐射；B是第一载体(与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣连接)，该载体与A相连；C是可能含有感兴趣的待分析物的样品，B通过感兴趣的待分析物的结合伴侣与感兴趣的待分析物连接；以及D是第二载体，该载体可与感兴趣的待分析物直接连接或通过感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣与感兴趣的待分析物连接；k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将(a)中形成的复合体从组合物的其它组分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复发射电磁辐射；以及
(d)检测发射的电磁辐射并由此确定感兴趣的待分析物的存在。
在某些具体实施方式中，本发明的方法可以是竞争性结合实验，例如竞争性抑制实验(见例如Janeway等人。Immunobiology，GarlandPublishing，New York 2001)。在该实验的某些具体实施方式中，已知量的感兴趣的待分析物或感兴趣的待分析物的类似物可与不包含ECL部分的载体连接(术语“连接”包括共价和非共价连接)，例如磁珠。感兴趣的待分析物的结合伴侣可与包含ECL部分的第二载体例如聚苯乙烯珠粒连接。在没有添加感兴趣的待分析物时，复合体将在与第一载体连接的感兴趣的待分析物和与第二载体连接的感兴趣的待分析物的结合伴侣之间形成，有效地将第一载体与第二载体连接。与该复合体结合的ECL部分的量可以通过本领域已知技术测量。样品中感兴趣的待分析物的存在可通过其减少形成的复合体量的能力来检测，该感兴趣的待分析物通过和与载体连接的感兴趣的分子竞争结合与第二载体连接的结合伴侣来减少形成的复合体的量。在某些具体实施方式中，样品中感兴趣的待分析物的量可通过与标准曲线的比较加以定量，该标准曲线使用包含了已知量感兴趣的分子的样品获得。
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测感兴趣的待分析物的层叠(sandwich)型结合实验。在该实验的某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物的第一结合伴侣可与第一载体例如磁珠连接。感兴趣的待分析物的第二结合伴侣可与第二载体例如聚苯乙烯珠粒连接，该载体可包含ECL部分。在含有感兴趣的待分析物的样品的存在下，包含第一载体和第二载体的复合体可以形成。与该复合体连接的ECL部分的量可通过本领域已知技术加以测量，该量正比于样品中感兴趣的生物材料的量。在某些具体实施方式中，样品中感兴趣的待分析物的量可通过与标准曲线的比较加以定量，该标准曲线使用包含了已知量感兴趣的分子的样品获得。
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的待分析物的直接结合方法。在该方法的某些具体实施方式中，样品中的分子可与第一载体例如磁珠连接。感兴趣的待分析物的结合伴侣可与第二载体例如聚苯乙烯珠粒连接，该载体可包含ECL部分。如果样品含有感兴趣的待分析物，同时包含第一载体和第二载体的复合体可以形成。与该复合体连接的ECL部分的量可通过本领域已知技术加以测量，该量正比于样品中感兴趣的生物材料的量。在某些具体实施方式中，样品中感兴趣的待分析物的量可通过与标准曲线的比较加以定量，该标准曲线使用包含了已知量感兴趣的分子的样品获得。
关于这些类型的结合实验的很多变化是本领域技术人员已知的且与本发明的方法相容。
有很多对存在的ECL部分定量的方法。能量输入系统内的速率可以提供对ECL部分的测量。合适的测量包括例如当ECL部分被电化学激发时对电流的测量，当ECL部分被化学激发时还原剂或氧化剂的利用率，或在光致发光技术中对电磁能的吸收的测量。也可以通过测量发射的电磁辐射来检测ECL部分。所有这些测量可以是连续的基于速率的测量，或可以是在长的时间区间内累计信号的累积法。基于速率的测量可使用光电倍增管、光电二极管或光电晶体管进行，这些管产生强度与入射光强度成正比的电流。累积法可包含基于速率的数据的积分或用照相胶片直接提供累积性数据。
本发明还提供了分离复合体的方法，该复合体包含感兴趣的待分析物、至少一种载体和ECL部分。在某些具体实施方式中，磁场可被用于分离复合体，例如当至少一个载体是磁珠时。在某些具体实施方式中，复合体的分离可以通过沉淀实现，例如当复合体的质量比各单独组分的质量大时通过重力实现分离。在某些具体实施方式中，可以使用滤器将复合体从组合物的其它组分中分离出来。例如，滤器可具有的孔径应该足够小以留滞复合体但足够大以允许未复合的材料通过。在某些具体实施方式中，可以使用尺寸排阻柱分离复合体。将复合体从组合物的其它组分中区分出来的其它性质也可被使用，例如对其它结合伴侣的疏水性或亲和性。
G.疾病和状况
在某些具体实施方式中，感兴趣的待分析物可以是与疾病或状况相关的标记物。本发明因此提供了检测与疾病或状况相关的标记物并由此诊断具有疾病或状况的主体的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了通过监测与疾病或状况相关的标记物的存在或数量来监测疾病或状况的进展的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了监测用于治疗疾病或状况的治疗的有效性的方法，该方法通过监测与疾病或状况相关的标记物的存在或数量来监测治疗的有效性。
疾病或状况可包括由感染源引起的感染性疾病，感染源例如细菌、真菌、寄生虫、病毒或朊病毒。细菌病原体的实施例包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、大肠杆菌(E.coli)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、牛链球菌(S.bovis)、无乳链球菌(S.agalactiae)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)。病毒感染的实例包括天花、严重急性呼吸系统综合症(SARS)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、鼻病毒、流行性感冒、呼吸道融合病毒(RSV)、麻疹、骨髓灰质炎、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)。寄生虫的实施例包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malaria)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)以及蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)。
疾病可以是癌症或自免疫疾病。可以成为感兴趣的待分析物的与各种癌症相关的标记物包括黑素瘤的突变体细胞周期素依赖性激酶4；黑素瘤的p17蛋白；黑素瘤的gp 100；黑素瘤的黑素瘤相关抗原1(MART-1)(Melan-A)(PCT公开号WO94/21126)；黑素瘤的p15蛋白；黑素瘤的酪氨酸酶(PCT公开号WO94/14459)；黑素瘤、甲状腺髓样癌、小细胞肺癌、结肠和/或支气管鳞状细胞癌的黑素瘤相关抗原(MAGE)1、2和3(PCT/US92/04354)；黑素瘤相关抗原-Xp(MAGE-Xp)(美国专利号5,587,289)；膀胱、黑素瘤、乳腺和鳞状细胞癌的B黑素瘤抗原(BAGE)(美国专利号5,571,711和国际公开号WO95/00159)；G抗原(GAGE)(美国专利号5,610,013和国际公开号WO95/03422)；肾肿瘤抗原(RAGE)家族(美国专利号5,939,526)；黑素瘤优先表达抗原(PRAME)(此前的DAGE；PCT公开号WO96/10577)；黑素瘤泛突变蛋白(MUM-1/LB-33B)(美国专利号5,589,334)；成神经细胞瘤扩增蛋白(NAG)(美国专利号5,821,122)；FB5(内皮唾酸蛋白)(美国专利号6,217,868)；PSMA(前列腺特异膜抗原)(美国专利号5,935,818)；黑素瘤gp75；黑素瘤癌胚抗原；碳水化合物/脂类例如乳腺、胰腺和卵巢癌的粘液素；黑素瘤的GM2和GD2神经节苷脂；致癌基因例如癌的突变体p53；结肠癌的突变体ras；成红细胞白血病病毒癌基因类似物2(HER2/neu)乳腺癌的原癌基因；以及病毒产物例如子宫颈和食道鳞状细胞癌的人乳头瘤病毒蛋白。与自免疫疾病相关的标记物包括和与系统性红斑狼疮相关的染色质特异性结合的抗体，人白细胞抗原(HLA)等位基因DR2(与multiple schlerosis相关)、DR3(与Graves病相关)和与风湿性关节炎相关的DR4的存在(aneway等人.Immunobiology，GarlandPublishing，New York 2001)。
H、试剂盒
在某些具体实施方式中，本发明提供了用于检测样品中的感兴趣的待分析物的试剂盒。该试剂盒可包括含有至少一个ECL部分的第一载体、第二载体、与第一和第二载体中至少一个相连的感兴趣的待分析物的至少一个特异性结合伴侣、至少一个容器以及非必须的说明书。在某些具体实施方式中，该试剂盒可包含2个或更多的ECL部分。
实施例
化学药品和材料：获自Aldrich(Milwaukee，WI)的三(2，2’-联吡啶)钌(II)二氯六水合物(Ru(bpy)3Cl2·6H2O)、三氟乙酸(TFAA，99％)、四氟硼酸银(AgBF4，98％)和三正丙胺(TPrA，99+％)；获自BoulderScientific Co.(Mead，CO)的四(五氟苯基)硼酸锂(Li[(B(C6F5)4)]·nEt2O，n＝2-3)；获自Fluka(Milwaukee，WI)的四氟硼酸四丁基铵((TBA)BF4，电化学级别)；获自Life Technologies(Rockville，MD)的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，超纯)；获自Sigma(St.Louis，MO)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸(EDAC，SigmaUltra)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、荧光素生物素(90％)、1-甲基咪唑和DNA杂交缓冲液(PerfectHyb plus)；获自EM(Gibbstown，NJ)的氢氧化钠(GR)、盐酸(GR)、氯化钠(GR)、乙醚(无水)、乙腈(HPLC)、四氢呋喃(THF，GR)和乙二胺四乙酸(EDTA)；获自Pierce(Rockford，IL)的亲和素(NeutrAvidin)、D-生物素(ImmunoPure)和生物素-PEO-LC-胺；以及获自Fisher(Fairlawn，NJ)的甲醇(光谱分析级)，除非另外说明，这些药品不进行进一步纯化而被使用。羧酸聚苯乙烯微球/珠粒(PSB，，直径10μm，2.6％(w/w)具有6.5×104珠粒/μL的水性悬浮液)和链霉亲和素包被的超顺磁聚苯乙烯珠粒(被称作磁珠或MB，(a)直径10μm，具有大约9.5×106珠粒/μL的10mg/mL的水性悬浮液；(b)直径2.8μm，具有大约6.5×105珠粒/μL的10mg/mL的水性悬浮液)分别购自PolySciences Inc.(Warington，PA)和Dynal Biotech Inc.(Lake Success，NY)。从炭疽杆菌(Bacillusanthacis)(Ba813)获得的合成的23个核苷酸的单链DNA(ssDNA)寡核苷酸获自Qiagen Operon(Alameda，CA)且具有以下序列：(a)探针，5’-[生物素-TEG]-AACGA TAGCT CCTAC ATTTG GAG-3’(p-ss-DNA，M.W.＝7617g/mol；SEQ ID NO：1)；(b)靶或互补序列，5’-[生物素-TEG]-CTCCA AATGT AGGAG CTATC GTT-3’(t-ssDNA，M.W.＝7608g/mol；SEQ ID NO：2)；(c)非互补序列，5’-[生物素-TEG]-TTAAC ACCTT AGCGA CGGCT AGT-3’(nc-ssDNA，M.W.＝7593g/mol；SEQ ID NO：3)；和(d)2-碱基对错配的寡聚体序列，5’-[生物素-TEG]-CTCCA AACGT AGGAG TTATC GTT-3’(2-bp-m-ssDNA；SEQ ID NO：4)，其中生物素-TEG含有基于三甘醇的16个原子混合极性间隔子，且其被用于减少生物素化DNA和表面限制的亲和素/链霉亲和素相互作用之间的空间位阻。除非另外声明，所有的溶液使用18MΩ-cm去离子化Milli-Q水(Millipore Corp.，Bedford，MA)新鲜配制。
ECL和电化学测量  使用三电极电解池系统，2.2mm直径的Pt盘、2.0mm直径的Au或3.0mm直径的玻碳(GC)盘作为工作电极，Pt丝作为对电极，Ag/Ag+(MeCN中10mM AgBF4和50mM TBABF4)为参比电极。在各实验之前仔细清洁所有的电极。清洁步骤包括：将工作电极浸入铬酸(chomic acid)溶液并用0.05μm氧化铝浆料(Buehler Ltd.，Lake Bluff，IL)将其抛光，用大量水洗涤，用MeCN冲洗，并为参比电极更换多孔Vycor头和玻璃管。5mL一次性玻璃小瓶被用作电化学池。为了排除ECL信号从被Ru(bpy)3 2+污染的系统中产生的可能性，在任何需要的时候使用新的玻璃器皿和电极。使用自制稳压器和安装在电化学池下的光电倍增管(PMT，HamamatsuR4220p，Japan)同时测量ECL强度和循环伏安图。用高电压电源(Bertan High Voltage Corp.，Series 225，Hicksville，NY)为PMT提供-750V电压。
除非另外声明，所有测量在20±2℃的温度下进行。
实施例1：含有Ru(bpy)3 2+的ECL标签的合成
三(2，2’-联吡啶)钌(II)的四(五氟苯)硼酸盐(Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2)被用作本研究中的ECL标签，因为如同在下一部分中显示的，该络合物可通过使用合适的有机溶液而被有效得加载到聚苯乙烯珠粒中且在水性溶液中在珠粒的一系列修饰过程中保持滞留在珠粒内。换言之，Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2在有机溶剂中充分可溶但在水性溶液中完全不溶。选择Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2作为ECL标签的另一个原因是络合物的Ru(bpy)3 2+部分具有很高的ECL功效的事实。通过Ru(bpy)3Cl2和Li[B(C6F5)4]·nEt2O(n＝2-3)在水中的复分解反应制备Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。沉淀物用水洗涤，从乙腈/水溶液中重结晶并在真空下干燥。
实施例2：使用TPrA作为共反应物Ru(bpy)3 2+在MeCN中的电化学和ECL行为
图4中显示了在含有0.10M(TBA)BF4电解质-0.10M TPrA共反应物的MeCN中的0.10μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2在Pt电极以50mV/s的扫描速率的循环伏安和ECL响应。TPrA在大约0.5V vs Ag/Ag+的电势开始氧化，且在大约0.75V vs Ag/Ag+时显示最大氧化峰(图4a)。当电极被扫描至比1.1V vs Ag/Ag+更正的电势时，在此时Ru(bpy)3 2+被氧化成Ru(bpy)3+(图4c)，ECL产生(图4b)。随着增加的电势，ECL强度持续增加，最终形成半波宽为大约700mV且峰电势为大约1.6V vs Ag/Ag+的宽峰。在反向扫描中，观察到更大的ECL强度和相似的峰位置。注意到在TPrA的存在下，Ru(bpy)3 2+的氧化电势可略微正漂移，因为该ECL峰电势与不存在TPrA时的Ru(bpy)3 2+的氧化电势相比更正(图4b和c)。如所预期的，Ru(bpy)3 2+络合物的抗衡离子的改变例如从B(C6F5)4 -到ClO4 -不改变ECL行为。与在水性溶液中的情况形成对比的是，当使用μM水平的Ru(bpy)3 2+时，由于TPrA·+和Ru(bpy)3 +反应形成(通过Ru(bpy)3 2+和TPrA·反应形成)激发态Ru(bpy)3 2+*，前置波ECL出现在TPrA氧化的电势区(Miao，Choi andBard，2002，J.Am.Chem.Soc.124：14478)，在MeCN中没有发现可观测的相应的ECL信号。这暗示在目前的实验条件下，或者TPrA·+在MeCN中的寿命比在中性水性溶液中更短，或者TPrA·+不具有足以将Ru(bpy)3 +氧化成Ru(bpy)3 2+*的能量。除了这点，我们得出结论：使用TPrA作为共反应物在水性溶液中发展起来的ECL机制在MeCN中是可操作的。
作为TPrA浓度的函数的ECL强度在图5a中显示，其中最高ECL强度区对应于30mM的TprA浓度。如同将被预期的，根据在水性溶液中的ECL-pH依赖性研究(Leland等人.1990，J.Electrochem.Soc.137：3127)，通过向Ru(bpy)3 2+/TPrA/MeCN溶液中加入三氟乙酸(TFAA)由此改变溶液的酸度，ECL强度被改变(图5b)。100mMTPrA和55mM TFAA的组合产生最大的ECL响应。
ECL强度和稳定性也受到使用的电极材料的影响。Pt和Au电极显示了相似的响应；ECL在若干电势循环中保持稳定，相比于Au电极，在Pt中发现相对稍微更小的光电流密度。但是，在GC电极处，只有第一次电势循环的前向扫描产生光。在将GC电极抛光后，光再次产生，暗示电极表面已被某种类型的膜阻碍。从含有0.10μMRu(bpy)3[B(C6F5)4]2-0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10M(TBA)BF4的MeCN溶液在0至3.0V vs Ag/Ag+的第一次电势循环中以50mV/s的扫描速率获得的相对ECL强度具有：Au、Pt和GC电极，100∶93∶61的比率。
有趣的是，甚至在没有Ru(bpy)3 2+的情况下，在0.10M(TBA)BF4的乙腈溶液中的TPrA也能产生ECL信号(图6a)。通过蒸馏将TPrA和MeCN纯化、将电解液从(TBA)BF4改变成(TBA)ClO4或使用新打开的电化学级电解液、使用新的玻璃器皿和电极、以及用包被了黑塑料层或没有包被黑塑料层的玻璃管覆盖Pt对电极，都不改变结果。ECL具有2.1V vs Ag/Ag+的峰电势值，和在0.10μM Ru(bpy)3 2+的存在下获得的值相比，该值具有500mV的漂移(图4b)。如此前在图5a中显示的，在没有TPrA的情况下，具有0.10M(TBA)BF4的MeCN溶液中的Ru(bpy)3 2+在仅向正电势的扫描中在相同的强度尺度内不产生可观测的ECL响应。因此，在图6a中显示的ECL信号一定产生自TPrA，且很可能是由于与TPrA自由基相关的电荷转移反应反光电发射(CTRIP)(Murakoshi等人.1992，J.Phys.Chem.96：4593；Uosaki等人.1991，J.Phys.Chem.95：779；Uosaki等人.1990，Chem.Lett.7；1159；McIntyre等人.1987，J.Electroanal.Chem.Interfac.Electrochem.228：293；McIntyre等人.1986，Phys Rev Lett.56：651；McIntyre等人.1985，J.Electroanal.Chem.Interfac.Electrochem 196：199；Murakoshi等人.1993，Conden Mar Mater.Phys.47：2278；Ouyang和Bard 1988，J.Phys.Chem.92：5201；Ouyang和Bard 1987，J.Phys.Chem.91：4058)。从图6a中获得的积分的ECL强度是显著的，它是从图4b中获得的强度的大约12％，因为在没有TPrA的情况下，从0.10M(TBA)BF4/MeCN溶液测量的残余光电流显著较少(图6d)。通过向溶液中加入TFAA，背景TPrA相关的ECL信号被极大地抑制(图6b)，且通过向0.10MTPrA-0.055M TFAA-0.10M(TBA)BF4 MeCN溶液中加入1％(v/v)H2O，实现对“多余”信号的进一步去除(图6c)。图6e显示了从图6a至d获得的相对ECL强度。
实施例3：将ECL标签加载到聚苯乙烯珠粒中
使用Eppendorf 5415D离心机(Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY)以10k rpm离心5分钟将具有10μm直径的羧酸聚苯乙烯珠粒从合适体积(0.10-1.0mL)的2.6％(w/w)聚苯乙烯珠粒悬浮液中分离出来，并随后用1mL的水洗涤1次。
在真空下在60℃将珠粒干燥1小时，随后将1.5mL ECL标签Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2-饱和的(0.7mM)5％THF-95％MeOH(v/v)溶液加入含有PSB的2mL微量离心管中。用Dynal样品混合器(DynalBiotech Inc.)将混合物以20rpm旋转2小时，随后离心并用50％MeOH-50％H2O(v/v)洗涤2次。在真空下在60℃将生成的含有ECL标签的微黄色聚苯乙烯珠粒进一步干燥1小时，该珠粒被命名为Ru(II)PSB。在以上处理的过程中，首先将聚苯乙烯珠粒在含有ECL标签的5％THF-95％MeOH有机溶液中膨胀，使得水不溶性ECL标签可以扩散进入聚合物基质，当通过真空蒸发将有机溶剂从珠粒中去除时，ECL标签被滞留在基质中。通过荧光图像(图2a)可以可视地证实ECL标签向聚苯乙烯珠粒内有效的加载，该荧光图像使用连接了Magnafire-Model S99806 Olympus America CCD相机(OlympusAmerica，Melville，NY)的Nikon Eclipse TE 300倒置显微镜(NikonInstruments Inc.，Melville，NY)获得。7.5×109 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2分子每珠粒的典型加载容量是根据从溶解在MeCN中的Ru(II)PSB和使用TPrA作为共反应物的标准Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2溶液获得的ECL数据估计出来的。
实施例4：将亲和素固定在Ru(II)PSB的表面上
通过Ru(II)PSB-CO-NH-亲和素的形成，亲和素层被共价连接在Ru(II)PSB的表面，该连接通过以下步骤实现：将珠粒浸入1.5mL新鲜配制25μM亲和素的0.10M 1-甲基咪唑缓冲液(pH 7)中，该缓冲液含有0.10M EDAC和0.10M NHS，并且将混合物以大约40rpm旋转1小时。以5-10k rpm离心5分钟将新形成的亲和素包被的Ru(II)PSB从反应溶液中分离，其被命名为Ru(II)PSB/亲和素，并用1mL“1×B&W缓冲液”(1×缓冲&洗涤溶液，5mM Tris-HCl(pH 7.5)+0.5mM EDTA+1.0M NaCl)洗涤三次。将最终的Ru(II)PSB/亲和素产物重悬浮在1×B&W缓冲溶液中并保存在大约4℃直至使用，该缓冲溶液与起始的PSB悬浮液(0.10-1.0mL)具有相同的体积。假设在Ru(II)PSB/亲和素的制备过程中没有损失珠粒，大约地，6.5×104Ru(II)PSB/亲和素珠粒/μL因此可被估计。图2b显示了在珠粒与荧光素生物素反应后Ru(II)PSB/生物素的亮绿色荧光图像，暗示大量的亲和素层已经在Ru(II)PSB的表面形成。相反，在“裸”Ru(II)PSB上的非特异性吸附的荧光素生物素仅产生很弱的荧光图像。根据荧光素生物素滴定实验发现Ru(II)PSB/亲和素对生物素化的23个核苷酸的ssDNA(p-ssDNA)的结合容量具有0.565纳摩尔(p--ssDNA)/mg PSB或1.4×108p-ssDNA分子/珠粒的值(见以下图10和表1)。
实施例5：将ssDNA连接到MB和Ru(II)PSB/亲和素珠粒的表面
探针DNA-MB偶联物。具有1.0μm或2.8μm直径的链霉素包被的磁珠(MB)被用作探针DNA载体。为了形成探针DNA-MB偶联物，首先将5.0μL的1.0μm MB或10.0μL的2.8μm MB转移到2mL的微量离心管中，随后用磁体(Dynal MPC-S)从初始悬浮液中分离出来，随后用200μL的“2×B&W缓冲液”(缓冲&洗涤溶液：10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1.0mM EDTA、2.0M NaCl)洗涤1次并用200μL的1×B&W缓冲液洗涤2次，随后将珠粒浸入100μL的2.5μM生物素化p-ssDNA并伴随40rpm的温和旋转放置30至60分钟。形成的探针DNA-MB偶联物随后被分离并用200μL的1×B&W缓冲液洗涤3次，被转移到新的2mL微量离心管中以避免探针DNA在之前管壁上可能的吸附，并重悬浮在20μL杂交缓冲液中。通过该方法制备的偶联物具有对1.0μm和2.8μm直径的MB分别大约为2.53和1.11纳摩尔(p-ssDNA)/mg(珠粒)，或1.6×106和1.0×107p-ssDNA分子每珠粒的饱和的探针DNA覆盖(见图10和表1)。
[001]表1
  珠粒的类型            结合容量              转折点
 p-ssDNA纳摩尔每毫克珠粒   p-ssDNA分子每珠粒
  10μm PSB1.0μm MB2.8μm MB  0.5652.531.11   1.4×1081.6×1061.0×107   20μL PSB～29.4μL的10μM p-ssDNA10μL MB～25.3μL的10μL p-ssDNA20μL MB～22.2μL的10μM p-ssDNA
靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素偶联物  将100μL合适浓度的生物素化t-ssDNA(1.0×10-8至1.0×10-15M)或1.0×10-9M非互补的ssDNA(nc-ssDNA)和2个碱基对错配的ssDNA(2-bp-m-ssDNA)加入25μL的大约6.5×104珠粒/μL Ru(II)PSB/亲和素的1×B&W缓冲液中并以20rpm的旋转速率温和混合培育1小时，用200μL的1×B&W缓冲液洗涤两次，以3k-5k-10k rpm离心5分钟，并重悬浮在50μL的杂交缓冲液中。
实施例6：DNA杂交和ECL检测
将新制备的靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素偶联物(实施例5)转移到2mL离心管中，该管中含有此前形成的探针DNA-MB偶联物(实施例5)。将合适体积的杂交缓冲液加入管中实现200μL的总的杂交溶液体积。在以20rpm温和混合1小时后，从含有游离的未结合的Ru(II)PSB/亲和素珠粒的“溶液”中磁分离出探针DNA-MB靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素聚集物，用200μL的1×B&W缓冲液温和洗涤三次，并小心地转移到新的离心管中从而将游离Ru(II)PSB/亲和素珠粒在管壁上的可能吸附最小化。这类非特异性吸附可产生高水平的背景ECL，因为和DNA杂交聚集物一起，在壁上的游离Ru(II)PSB/亲和素珠粒也可溶解在MeCN中。最终用200μL水洗涤聚集物，并将其溶解在0.50mL的0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10M(TBA)BF4 MeCN溶液中用于以后的ECL测量。在DNA杂交后探针DNA-MB靶DNA-Ru(II)PSB/亲和素聚集物的形成可以通过图3中显示的SEM图像清楚地证实，在其中探针DNA和互补DNA都具有5μM的浓度，初始比率为MB/PSB＝29，且MB和PSB的大小分别为1.0μm和10μm。
在添加了1％水的0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10(TBA)BF4MeCN中发现在0.10nM to 1.0μM的范围内ECL强度和Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2浓度的线性关系(图7a)。在相同实验条件下，也观察到ECL强度与加载了Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2的10μm直径的聚苯乙烯珠粒的数量之间的好的相关性(图7b)。将珠粒溶解在0.50mL的电解溶液中以证实聚苯乙烯不产生或影响ECL信号。通过比较图7b和7a，明显的是，加载了20Ru(bpy)3 2+的珠粒产生的光强度等于来自0.5nM Ru(bpy)3 2+的光强度。珠粒的加载容量因此被确定为7.5×109Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2分子每珠粒。该结果与根据“大量珠粒(bulkbeads)”ECL测量获得的数据相一致。
设计了两套实验用于DNA杂交的ECL检测。在第一套中，使用1.0μm直径的MB，MB对PSB珠粒的比率为29。如图8a中所示，在该例中，在10pM至10nM的范围内ECL强度正比于靶DNA浓度，且两碱基错配的2-bp-m-ssDNA和非互补nc-ssDNA可以容易地与互补DNA杂交相区别。注意不同于图7中显示的实施例，因为新形成的MB-PSB偶联物和微量离心管已经含有足够的水，因此不向电解溶液中加水。还要注意没有对图8显示的ECL强度进行背景减除。通过降低MB对PSB的比率，且因此提高了Ru(bpy)3 2+对t-ssDNA的放大因子，显著更低浓度的靶DNA进行的DNA杂交应当可检测到。如以下证实的，统计学上，1个10μm直径的PSB可以被1个2.8μm直径的MB吸出。因此，当2.8μm MB和10μm PSB以低比率出现时，DNA杂交相关的ECL信号在非常低的靶DNA浓度发生且因此可被检测到。图8b显示了这样的实施例的结果，其中2.8μm MB/10μm PSB的比率＝4。在低至1.0fmol的浓度下可以检测到t-ssDNA。甚至在这些条件下，获得的ECL强度比当使用1.0nM的2-bp-m-ssDNA和nc-ssDNA分子时从各分子的DNA杂交获得的强度大，且因此可与它们相区别。
实施例7：将生物素-PEO-LC-胺连接到羧酸聚苯乙烯珠粒上以及泊松(Poisson)分布实验
生物素-PEO-LC-胺(M.W.＝418.6g/mol)是水溶性交联剂，具有22.9基于聚环氧乙烷(PEO)的间隔子臂，该臂被用于减少生物素和亲和素相互作用的空间位阻(2003-2004 Applications Handbook &Catalog；Pierce biotechnology，Inc.2003)。通过在0.10M EDAC-0.10MNHS的0.10M 1-甲基咪唑缓冲液(pH7)的存在下，在交联剂的伯胺基团和珠粒的羧基之间形成酰胺键，生物素-PEO-LC-胺分子被共价连接到羧酸聚苯乙烯珠粒的表面上。使用1mL的5mM生物素-PEO-LC-胺与从250μL的2.6％ PSB悬浮液中分离出的PSB反应。以40rpm的旋转速率进行反应2小时。随后将交联剂修饰的PSB(命名为PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素)分离并用400μL的1×B&W缓冲液洗涤3次，重悬浮在250μL的1×B&W缓冲液中，且随后保存在4℃直至使用。
使用10μm直径的PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒以及两个不同尺寸的链霉亲和素/聚苯乙烯包被的磁珠(直径1.0和2.8μm的Dynal珠粒)进行泊松分布测量。当数万个PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒在溶液中与相同或更大数量的1.0或2.8μm的磁珠充分混合时，PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒将通过PBS的生物素和MB的链霉亲和素的不可逆相互作用发生粘附的可能性可被观察且和泊松分布所预测的可能性进行比较。实验上，用175μL的1×B&W缓冲液将50μL的大约6.5×104珠粒/μL PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒(总计3.3×106PSB)稀释，并将其转移至2.0mL微量离心管中，该管包含已知量的链霉亲和素包被的磁珠(直径1.0μm)，该磁珠已从生产商的初始悬浮液中磁性分离并用200μL的2×B&W缓冲液洗涤一次。立即摇晃该混合物并在将PSB-MB聚集物从混合物中磁性分离出之前以40rpm旋转1小时。生成的上清液包含未结合的游离的PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒，且通过倒置显微镜的光学检测确定上清液中PSB的数量。相似的步骤被用于研究2.8μm MB的泊松分布。但是，在该例中，仅一半数量的PSB-CO-NH-LC-PEO-生物素珠粒，即1.6×106个珠粒被用于和已知量的MB反应。
当大量的磁珠与聚苯乙烯珠粒混合物在一起时，这两种珠粒碰撞和发生不可逆反应的可能性P(m，n)应当遵循泊松分布且依赖于以下两个参数：(a)磁珠对聚苯乙烯珠粒的初始比率m，和(b)结合到各聚苯乙烯珠粒上的磁珠的数量n。例如，如果等量的MB和PS珠粒被混合(m＝1)，结合到PS上的MB的平均数量应当是1。但是将存在n＝0，1，2...的分布以导致该平均值。P(m，n)、m和n之间的关系可用如下的泊松分别进行描述：
         P(m，n)＝e-m[mn/n！]n＝0，1，2，...
(见Haight，Handbook of the Poisson Distribution；John Willey &Sons，Inc.：New York，1967)
表2列出了对于不同的m和n值的P(m，n)值。使用该表和泊松分布实验数据(以上提供)，人们可以估计与单个聚苯乙烯珠粒结合并将其从反应溶液中吸出所需要的磁珠粒的最小数量。例如，根据从上清液中收集的PSB的数量，可以计算与MB结合并从反应混合物中被磁性吸出的PSB的百分比。使用若干已知的m值，例如m＝1，2，3，4，5...的一组“结合的PSB％”数据可随后通过实验获得。如果该数据与P(m，n＞j)的理论值(表2)吻合，其中m从进行的实验中获知，j＝0，1，2，3...和 P ( m , n > j ) = Σ i = j + 1 ∞ P ( m , i ) , 那么结合单个聚苯乙烯珠粒并将其吸出所需的磁珠的最小数量必然是j+1。
表2
  m
n 1 2 3 4 5 6 8 10 12
012345... 0.367880.367880.183940.0613130.0153280.0030657... 0.135340.270670.270670.180450.0902240.036089... 0.0497870.149360.224040.224040.168030.10082... 0.0183160.0732630.146530.195370.195370.15629... 0.00673790.0336900.0842240.140370.175470.17547... 0.00247880.0148730.0446180.0892350.133850.16062... 0.000335460.00268370.0107350.0286260.0572520.091604... 4.5400e-050.000454000.00227000.00756670.0189170.037833... 6.1442e-067.3731e-050.000442380.00176950.00530860.012741...
总计 1 1 1 1 1 1 1 1 1
图9显示了这类实验的两个实施例。在第一个实施例中(图9a)，使用2.8μm MB和10μm PSB，且可以推导出MB/PSB＝1的最小结合率。在第二实施例中(图9b)，取代2.8μm MB，将1.0μm MB用于与10μm PSB反应。在该例中，获得了更高的MB对PBS最小结合率，该结合率为3。这些结合率可被用于优化MB和PSB之间的DNA杂交的实验条件，由此最小的靶DNA浓度可被检测。
实施例8：将两个芳烃DPA和红荧烯加载入聚苯乙烯珠粒
除了Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2之外，例如9，10-二苯基蒽(DPA，图11a)和红荧烯(RUB，图11b)也可被加载入聚苯乙烯珠粒(PSB)中。因此，获得了具有不同发射波长的ECL标签。加载程序与用于Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2滞留的程序相似，除了5％THF-95％MeOH“膨胀溶剂”由5％苯-95％MeOH取代，由此两种芳烃在含苯溶剂中是充分可溶的。图12总结了加载程序。
使用UV光激发的荧光成像可视地证实DPA和RUB在PSB中的滞留。如图13a和b中所示，对加载了DPA和RUB的PSB分别观察到强的蓝色和黄至橙色的荧光图像。相反，没有芳烃的PSB显示了弱绿色荧光(图13c)。
根据从溶解在MeCN中的加载了DPA或RUB的PSB和使用三丙胺(TPrA)作为共反应物的标准DPA和RUB溶液获得的ECL数据，估计出7.5×109DPA分子每珠粒或4.0×108RUB分子每珠粒的加载容量。图14显示了(a)溶解在MeCN中的加载了DPA的PSB和(b)使用TPrA作为共反应物的0.25mM DPA乙腈溶液的CV和ECL行为。溶解在MeCN中的加载了RUB的PSB和使用TPrA作为共反应物的35μM RUB乙腈溶液的CV和ECL行为分别显示在图15a和15b中。
实施例9：C反应性蛋白(CRP)的ECL检测
如下制备Ru(II)PSB/亲和素←抗CRP偶联物：将0.100-0.500mL的Ru(II)PSB/亲和素(6.5×104珠粒/μL)(见实施例4)与1mL的2.0mg/mL生物素化抗CRP(Miao和Bard，2003，Anal.Chem.75：5825)的0.10M PBS缓冲液(0.1磷酸钠、0.15M氯化钠)(pH 7.2)(Pierce，Rockford，IL)混合，并在室温下以25rpm的旋转速率旋转1小时。通过离心收集新生成的偶联物，用1×B&W缓冲液洗涤3次(见实施例4)，并重悬浮在1mL的2％牛血清白蛋白(BSA)/0.10M PBS(pH 7.2)溶液中30分钟。在离心和洗涤后(如上)，将偶联物悬浮在合适体积(0.100-0.500mL)的0.10M PBS(pH 7.2)缓冲溶液中并保存在4℃直至使用。
如下制备MB←抗CRP偶联物：将0.100-0.500mL的2.8μm直径的链霉亲和素包被的磁珠(MB，6.5×105珠粒/μL)磁性分离，用1mL的2×B&W缓冲液洗涤1次并用1mL的1×B&W缓冲液洗涤2次，随后与1.5mL的2.0mg/mL生物素化抗CRP的0.10M PBS缓冲液(pH7.2)以25rpm的旋转速率在室温混合1小时。用1mL的1×B&W缓冲液将新生成的MB←抗CRP偶联物洗涤3次，重悬浮在合适体积(0.100-0.500mL)的0.10M PBS(pH 7.2)缓冲溶液中并保存在4℃直至使用。
如下形成层叠型Ru(II)PSB/亲和素←抗CRP<CRP>MB←抗CRP偶联物：20μL的Ru(II)PSB/亲和素←抗CRP偶联物(总计1.3×106PSB)和20μL的MB←抗CRP偶联物(总计1.3×107MB)与CRP样品在200μL的0.10M PBS(pH 7.2)缓冲溶液中在室温下温和混合2小时。将层叠型偶联物从混合溶液中磁性分离并用200μL的1×B&W缓冲液洗涤3次。随后将偶联物和小体积的PBS缓冲液转移至新的2mL离心管中，由此游离Ru(II)PSB/亲和素←抗CRP对旧管壁的可能吸附被最小化(参考实施例6)。最后，使用磁体将“磁性偶联物”从溶液中分离。
用ECL检测CRP。将获得的层叠型偶联物溶解在0.500mL的0.10M TPrA-0.055TFAA-0.10M(TBA)BF4MeCN溶液中，且使用循环伏安法在2.2mm直径的Pt电极进行ECL实验，实验使用0至2.8V vs.Ag/Ag+(0.10M(TBA)BF4MeCN中的10mM AgBF4)的扫描电势窗，扫描速率为50mV/s。如所预期的，从层叠型偶联物获得的CV和ECL图与在图4a和c中显示的图非常相似，因为，在两个例子中，“反应物质”，Ru(bpy)3 2+和TPrA是相同的。如图16所示，ECL强度(前向扫描峰强度和反向扫描峰强度的平均值)在0.010-10μg/mL范围内与CRP浓度线性成比例。
在此引用的所有参考文献被完整地作为参考引入本文。根据参考引入的公开物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的程度，本说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
在说明书和权利要求中使用的表示成分、反应条件等的所有数值应当被理解为在所有情况下被词语“大约”所修饰。因此，除非相反声明，在本说明书和所附的权利要求书中提及的数字参数是近似值，其可根据通过本发明希望获得的理想性质发生变化。至少，并且不企图教条等价地将申请限制在本权利要求的范围内，各数字参数应当被理解为明确数字的数量和普通的附近的值。
本发明的很多改进和变化可以在不悖离本发明精神和范围的情况下进行，这对本领域技术人员将是显而易见的。在此说明的特定具体实施方式仅作为实施例提供且并不意在以任何方式进行限制。希望说明书和实施例仅被认为是示范性的，本发明的真实范围和精神由以下权利要求说明。
                        序列表
<110>Bard，Alan J
     WUJIAN，MIAO
<120>使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物
<130>09526.0010-00000
<150>US 60/581,719
<151>2004-06-23
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>Bacillus anthracis
<400>1
aacgatagct cctacatttg gag                                              23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Bacillus anthracis
<400>2
ctccaaatgt aggagctatc gtt                                              23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>Bacillus anthracis
<400>3
ttaacacctt agcgacggct agt                                              23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>Bacillus anthracis
<400>4
ctccaaacgt aggagttatc gtt                                          23

Claims (205)

1、一种检测样品中感兴趣的待分析物的方法，包括
(a)形成组合物，该组合物包含：
            (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的待分析物的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导复合体中的ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的待分析物的存在，前提是B和D不同时与感兴趣的待分析物连接。
2、根据权利要求1所述的方法，其中B和D至少其中之一是固体支持物。
3、根据权利要求1所述的方法，其中B是第一固体支持物且D是第二固体支持物。
4、根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物与D直接相连。
5、根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物的第二结合伴侣与D相连。
6、根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物不和B或D相连。
7、根据权利要求1所述的方法，其中至少一个特异性结合伴侣与B和D中的至少一个相连。
8、根据权利要求1所述的方法，其中相同的特异性结合伴侣与B和D均发生连接。
9、根据权利要求1所述的方法，其中至少一个特异性结合伴侣是抗体。
10、根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物是核酸。
11、根据权利要求1所述的方法，其中至少一个特异性结合伴侣是核酸。
12、根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸是DNA。
13、根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物是蛋白质。
14、根据权利要求1所述的方法，其中所述ECL部分被包含在第一载体中且与第一载体的表面相连。
15、根据权利要求1所述的方法，其中所述ECL部分在有机溶剂中可溶。
16、根据权利要求1所述的方法，其中所述ECL部分在水性溶剂中不可溶。
17、根据权利要求1所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
18、根据权利要求1所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
19、根据权利要求1所述的方法，进一步包含将电化学势能施加到ECL部分上。
20、根据权利要求1所述的方法，进一步包含用光电倍增管检测发射的电磁辐射。
21、根据权利要求1所述的方法，其中第一和第二载体选自珠粒、凝胶、膜、脂质体和微团。
22、根据权利要求18所述的方法，其中所述第一和第二载体包含选自如下物质的化合物：聚苯乙烯、聚丙烯、琼脂糖、丙烯酰胺、磷脂、硝化纤维、尼龙、PVDF、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、透明质酸、几丁质、酰基结冷胶、右旋糖苷、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、羧甲基几丁质、聚(丙交酯-共-乙二醇)和去垢剂。
23、根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二载体是珠粒。
24、根据权利要求23所述的方法，其中所述第二载体是磁珠。
25、根据权利要求23所述的方法，其中所述第一载体是聚苯乙烯珠粒。
 26、根据权利要求23所述的方法，其中通过施加电磁场，将在(a)中形成的复合体从组合物的其它成分中分离。
27、根据权利要求1所述的方法，进一步包含将B溶解在有机溶剂中的步骤。
28、根据权利要求27所述的方法，其中所述有机溶剂是乙腈。
29、根据权利要求1所述的方法，进一步包含共反应物的添加。
30、根据权利要求29所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
31、根据权利要求30所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
32、根据权利要求1所述的方法，其中样品中感兴趣的待分析物的量被定量。
33、根据权利要求32所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的待分析物的量定量，所述标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的待分析物的样品C的方法绘制。
34、一种检测样品中感兴趣的核酸分子的方法，包括：
(a)形成组合物，该组合物包含：
               (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的核酸分子的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)将B溶解在有机溶剂中；
(d)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导复合体中的ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(e)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的核酸分子的存在，
前提是B和D不同时与感兴趣的核酸分子连接。
35、根据权利要求34所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
36、根据权利要求34所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
37、根据权利要求36所述的方法，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
38、根据权利要求34所述的方法，其中D与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述第二特异性结合伴侣是寡核苷酸。
39、根据权利要求34所述的方法，其中B与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接且D与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接。
40、根据权利要求39所述的方法，其中所述第一和第二特异性结合伴侣是寡核苷酸。
41、根据权利要求34所述的方法，其中B溶解在有机溶剂中，该溶剂选自乙腈、THF、苯或它们的混合物。
42、根据权利要求34所述的方法，其中所述感兴趣的核酸分子是DNA或RNA。
43、根据权利要求34所述的方法，进一步包含共反应物的添加。
44、根据权利要求34所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
45、根据权利要求34所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
46、根据权利要求34所述的方法，其中样品中感兴趣的核酸分子的量被定量。
47、根据权利要求46所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的核酸分子的量定量，该标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的核酸分子的样品(C)的方法绘制。
48、一种用于检测样品中感兴趣的待分析物的组合物，包含：
            (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D不同时与感兴趣的待分析物连接。
49、根据权利要求48所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物与B相连。
50、根据权利要求48所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物与D相连。
51、根据权利要求48所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物不和B或D相连。
52、根据权利要求48所述的组合物，其中B和D至少其中之一是固体支持物。
53、根据权利要求52所述的组合物，其中B是第一固体支持物且D是第二固体支持物。
54、根据权利要求48所述的组合物，其中第一特异性结合伴侣与B相连。
55、根据权利要求48所述的组合物，其中第二特异性结合伴侣与D相连。
56、根据权利要求48所述的组合物，其中第一特异性结合伴侣与B相连且第二特异性结合伴侣与D相连。
57、根据权利要求48所述的组合物，包含两个特异性结合伴侣。
58、根据权利要求57所述的组合物，其中所述两个特异性结合伴侣独立地与第一和第二载体相连。
59、根据权利要求48所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物是核酸。
60、根据权利要求59所述的组合物，其中所述核酸是DNA。
61、根据权利要求48所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物是蛋白质。
62、根据权利要求48所述的组合物，其中所述ECL部分在有机溶剂中可溶。
63、根据权利要求48所述的组合物，其中所述ECL部分在水性溶剂中不可溶。
64、根据权利要求48所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
65、根据权利要求48所述的组合物，其中B和D选自珠粒、凝胶、膜、脂质体和微团。
66、根据权利要求53所述的组合物，其中所述第一和第二固体支持物独立地由选自如下的化合物组成：聚苯乙烯、聚丙烯、琼脂糖、丙烯酰胺、磷脂、硝化纤维、尼龙、PVDF、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、透明质酸、几丁质、酰基结冷胶、右旋糖苷、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、羧甲基几丁质、聚(丙交酯-共-乙二醇)。
67、根据权利要求53所述的组合物，其中第一和第二固体支持物至少其中之一是珠粒。
68、根据权利要求53所述的组合物，其中第二固体支持物是可磁化珠粒。
69、根据权利要求53所述的组合物，其中第一固体支持物是聚苯乙烯珠粒。
70、一种用于检测样品中感兴趣的核酸分子的组合物，包含：
               (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子连接或与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D不同时与感兴趣的核酸分子连接。
71、根据权利要求70所述的组合物，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
72、根据权利要求70所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
73、根据权利要求72所述的组合物，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
74、根据权利要求70所述的组合物，其中B与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接且进一步地，且其中所述第一特异性结合伴侣是寡核苷酸。
75、根据权利要求70所述的组合物，其中D与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接且进一步地，且其中所述第二特异性结合伴侣是寡核苷酸。
76、根据权利要求70所述的组合物，其中B与感兴趣的核酸分子的第一特异性结合伴侣连接且D与感兴趣的核酸分子的第二特异性结合伴侣连接。
77、根据权利要求76所述的组合物，其中所述第一和第二特异性结合伴侣是寡核苷酸。
78、根据权利要求70所述的组合物，其中所述感兴趣的核酸分子是DNA或RNA。
79、一种用于检测样品中感兴趣的蛋白质的组合物，包含：
            (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质连接或与感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的蛋白质的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质连接或与感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D不同时与感兴趣的蛋白质连接。
80、根据权利要求79所述的组合物，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
81、根据权利要求79所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
82、根据权利要求81所述的组合物，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
83、根据权利要求79所述的组合物，其中B与感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体或结合蛋白。
84、根据权利要求79所述的组合物，其中D与感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体或结合蛋白。
85、根据权利要求79所述的组合物，其中感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣和感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣是抗体。
86、一种检测样品中感兴趣的蛋白质的方法，包括：
(a)形成组合物，该组合物包含：
         (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的蛋白质的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的蛋白质的复合体从该组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的蛋白质的存在，
前提是B和D不同时与感兴趣的蛋白质连接。
87、根据权利要求86所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
88、根据权利要求86所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
89、根据权利要求86所述的方法，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
90、根据权利要求86所述的方法，进一步包含用光电倍增管检测ECL部分。
91、根据权利要求86所述的方法，其中B与感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述第一特异性结合伴侣是抗体、抗体的一部分或结合蛋白。
92、根据权利要求86所述的方法，其中D与感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述第二特异性结合伴侣是抗体、抗体的一部分或结合蛋白。
93、根据权利要求86所述的方法，其中B与感兴趣的蛋白质的第一特异性结合伴侣连接且D与感兴趣的蛋白质的第二特异性结合伴侣连接。
94、根据权利要求93所述的方法，其中所述第一和第二特异性结合伴侣是抗体、抗体的一部分或结合蛋白。
95、根据权利要求86所述的方法，其中B溶解在有机溶剂中，该溶剂选自乙腈、THF、苯或它们的混合物。
96、根据权利要求86所述的方法，进一步包含共反应物的添加。
97、根据权利要求96所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
98、根据权利要求96所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
99、根据权利要求86所述的方法，其中样品中感兴趣的蛋白质的量被定量。
100、根据权利要求99所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的蛋白质的量定量，该标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的蛋白质的样品(C)的方法绘制。
101、一种检测样品中感兴趣的待分析物的方法，包括
(a)形成组合物，该组合物包含：
             (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D的复合体从所述组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导复合体中的ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的待分析物的存在，
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的待分析物的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的待分析物的类似物相连，那么D与感兴趣的待分析物的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的待分析物的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的待分析物的类似物相连。
102、根据权利要求101所述的方法，其中B和D至少其中之一是固体支持物。
103、根据权利要求101所述的方法，其中B是第一固体支持物且D是第二固体支持物。
104、根据权利要求101所述的方法，其中所述特异性结合伴侣是抗体。
105、根据权利要求101所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物是核酸。
106、根据权利要求101所述的方法，其中所述特异性结合伴侣是核酸。
107、根据权利要求101所述的方法，其中所述感兴趣的核酸分子是DNA。
108、根据权利要求101所述的方法，其中所述感兴趣的待分析物是蛋白质。
109、根据权利要求101所述的方法，其中所述ECL部分被包含在第一载体中。
110、根据权利要求101所述的方法，其中所述ECL部分在有机溶剂中可溶。
111、根据权利要求101所述的方法，其中所述ECL部分在水性溶剂中不可溶。
112、根据权利要求101所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
113、根据权利要求101所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
114、根据权利要求101所述的方法，进一步包含将电化学势能施加到ECL部分。
115、根据权利要求101所述的方法，进一步包含用光电倍增管检测发射的电磁辐射。
116、根据权利要求101所述的方法，其中第一和第二载体选自珠粒、凝胶、膜、脂质体和微团。
117、根据权利要求103所述的方法，其中B和D独立地包含选自如下物质的化合物：聚苯乙烯、聚丙烯、琼脂糖、丙烯酰胺、硝化纤维、尼龙、PVDF、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、透明质酸、几丁质、酰基结冷胶、右旋糖苷、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、羧甲基几丁质、聚(丙交酯-共-乙二醇)。
118、根据权利要求101所述的方法，其中第一和第二载体是珠粒。
119、根据权利要求118所述的方法，其中第二载体是可磁化珠粒。
120、根据权利要求118所述的方法，其中第一载体是聚苯乙烯珠粒。
121、根据权利要求11 8所述的方法，其中通过施加电磁场，将包含A、B、D的复合体从所述组合物的其它成分中分离。
122、根据权利要求101所述的方法，进一步包含将B溶解在有机溶剂中的步骤。
123、根据权利要求122所述的方法，其中所述有机溶剂是乙腈。
124、根据权利要求101所述的方法，进一步包含共反应物的添加。
125、根据权利要求124所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
126、根据权利要求124所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
127、根据权利要求101所述的方法，其中样品中感兴趣的待分析物的量被定量。
128、根据权利要求127所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的待分析物的量定量，该标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的待分析物的样品(C)的方法绘制。
129、一种检测样品中感兴趣的核酸分子的方法，包括：
(a)形成组合物，该组合物包含：
          (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠粒，所述磁珠粒与感兴趣的核酸的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的核酸分子的复合体从所述组合物的其它成分中分离出来；
(c)将B溶解在有机溶剂中；
(d)通过将ECL部分直接暴露于电化学能来诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(e)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的核酸分子的存在，前提是B和D中仅有一个与感兴趣的核酸分子的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的核酸分子的类似物相连，那么D与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的核酸分子的类似物相连。
130、根据权利要求129所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
131、根据权利要求129所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
132、根据权利要求131所述的方法，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
133、根据权利要求129所述的方法，其中B与感兴趣的核酸分子的类似物连接且进一步地，其中所述类似物是寡核苷酸。
134、根据权利要求129所述的方法，其中D与感兴趣的核酸分子的类似物连接且进一步地，其中所述类似物是寡核苷酸。
135、根据权利要求129所述的方法，其中感兴趣的核酸分子的类似物和感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣均是寡核苷酸。
136、根据权利要求129所述的方法，其中B溶解在有机溶剂中，该溶剂选自乙腈、THF、苯或它们的混合物。
137、根据权利要求129所述的方法，其中所述感兴趣的核酸分子是DNA或RNA。
138、根据权利要求129所述的方法，进一步包含共反应物的添加
139、根据权利要求129所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
140、根据权利要求129所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
141、根据权利要求129所述的方法，其中样品中感兴趣的核酸分子的量被定量。
142、根据权利要求141所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的核酸的量定量，该标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的核酸的样品(C)的方法绘制。
143、一种检测样品中感兴趣的蛋白质的方法，包括
(a)形成组合物，该组合物包含：
                (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
C是可含能有感兴趣的蛋白质的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与特异性结合感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
(b)将包含A、B、D和感兴趣的蛋白质的复合体从所述组合物的其它成分中分离出来；
(c)通过将ECL部分直接暴露于电化学能诱导ECL部分重复地发射电磁辐射；且
(d)检测发射的电磁辐射并因此检测感兴趣的蛋白质的存在，前提是B和D中仅有一个与感兴趣的蛋白质的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的蛋白质的类似物相连，那么D与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣相连，那么D与感兴趣的蛋白质的类似物相连。
144、根据权利要求143所述的方法，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
145、根据权利要求143所述的方法，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
146、根据权利要求143所述的方法，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
147、根据权利要求143所述的方法，进一步包含用光电倍增管检测ECL部分。
148、根据权利要求143所述的方法，其中B与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体、抗体的一部分或结合蛋白。
149、根据权利要求143所述的方法，其中D与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体、抗体的一部分或结合蛋白。
150、根据权利要求143所述的方法，其中B溶解在有机溶剂中，该溶剂选自乙腈、THF、苯或它们的混合物。
151、根据权利要求143所述的方法，进一步包含共反应物的添加。
152、根据权利要求151所述的方法，其中所述共反应物是胺或胺部分。
153、根据权利要求151所述的方法，其中所述共反应物是三正丙胺(TPrA)。
154、根据权利要求143所述的方法，其中样品中感兴趣的蛋白质的量被定量。
155、根据权利要求154所述的方法，其中通过将发射的电磁辐射与标准曲线比较对样品中感兴趣的蛋白质的量定量，该标准曲线通过进行使用含有已知量的感兴趣的蛋白质的样品(C)的方法绘制。
156、一种用于检测样品中感兴趣的待分析物的组合物，包含
              (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的第一载体且B与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的待分析物的样品；且
D是第二载体，该载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的待分析物的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的待分析物的类似物相连，那么D与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的待分析物的特异性结合伴侣相连，那么D与感兴趣的待分析物的类似物相连。
157、根据权利要求156所述的组合物，其中B和D至少其中之一是固体支持物。
158、根据权利要求157所述的组合物，其中B是第一固体支持物且D是第二固体支持物。
159、根据权利要求156所述的组合物，其中所述特异性结合伴侣与B相连。
160、根据权利要求156所述的组合物，其中所述特异性结合伴侣与D相连。
161、根据权利要求156所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物是核酸。
162、根据权利要求161所述的组合物，其中所述核酸是DNA或RNA。
163、根据权利要求156所述的组合物，其中所述感兴趣的待分析物是蛋白质。
164、根据权利要求156所述的组合物，其中所述ECL部分在有机溶剂中可溶。
165、根据权利要求156所述的组合物，其中所述ECL部分在水性溶剂中不可溶。
166、根据权利要求156所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
167、根据权利要求156所述的组合物，其中B和D选自珠粒、凝胶、膜、脂质体或微团。
168、根据权利要求157所述的组合物，其中B和D独立地由选自如下物质的化合物组成：聚苯乙烯、聚丙烯、琼脂糖、丙烯酰胺、硝化纤维、尼龙、PVDF、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、透明质酸、几丁质、酰基结冷胶、右旋糖苷、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、和羧甲基几丁质、聚(丙交酯-共-乙二醇)。
169、根据权利要求157所述的组合物，其中所述固体支持物是珠粒。
170、根据权利要求158所述的组合物，其中所述第二固体支持物是可磁化珠粒。
171、根据权利要求158所述的组合物，其中所述第一固体支持物是聚苯乙烯珠粒。
172、一种用于检测样品中感兴趣的核酸分子的组合物，包含：
              (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的核酸分子的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
C是可能含有感兴趣的核酸分子的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的核酸分子的类似物连接或与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的核酸分子的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的核酸分子的类似物相连，那么D与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的核酸分子的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的核酸分子的类似物相连。
173、根据权利要求172所述的组合物，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
174、根据权利要求172所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
175、根据权利要求174所述的组合物，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
176、根据权利要求172所述的组合物，其中B与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是寡核苷酸。
177、根据权利要求172所述的组合物，其中D与感兴趣的核酸分子的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是寡核苷酸。
178、根据权利要求172所述的组合物，其中感兴趣的核酸分子的类似物和特异性结合伴侣是寡核苷酸。
179、根据权利要求172所述的组合物，其中所述感兴趣的核酸是DNA或RNA。
180、一种用于检测样品中感兴趣的蛋白质的组合物，包含：
                 (A)k，(B)u，(C)，(D)x
其中A是ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
B是含有A的聚苯乙烯珠粒且B与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
C是可含能有感兴趣的蛋白质的样品；且
D是磁珠，该磁珠与感兴趣的蛋白质的类似物连接或与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接；
其中k、u和x分别是等于或大于1的整数；
前提是B和D中仅有一个与感兴趣的蛋白质的类似物连接；且
另一前提是如果B与感兴趣的蛋白质的类似物相连，那么D与感兴趣的蛋白质的结合伴侣相连，且如果B与感兴趣的蛋白质的结合伴侣相连，那么D与感兴趣的蛋白质的类似物相连。
181、根据权利要求180所述的组合物，其中所述ECL部分包含选自锇和钌的金属离子。
182、根据权利要求180所述的组合物，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
183、根据权利要求182所述的组合物，其中所述ECL部分是Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2。
184、根据权利要求180所述的组合物，其中B与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体或结合蛋白。
185、根据权利要求180所述的组合物，其中D与感兴趣的蛋白质的特异性结合伴侣连接且进一步地，其中所述特异性结合伴侣是抗体或结合蛋白。
186、一种用于检测样品中感兴趣的待分析物的试剂盒，包含：
至少一种ECL部分，该部分通过直接暴露于电化学能量源可被诱导重复发射电磁辐射；
含有ECL部分的第一载体，其中该第一载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第一特异性结合伴侣连接；以及
第二载体，该载体与感兴趣的待分析物的类似物连接或与感兴趣的待分析物的第二特异性结合伴侣连接。
187、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述ECL部分选自Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2、红荧烯和9，10-二苯基蒽。
188、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述第一和第二载体是固体支持物。
189、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述第一载体是聚苯乙烯珠粒。
190、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述第二载体是磁珠。
191、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述第一载体是聚苯乙烯珠粒且第二载体是磁珠。
192、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述感兴趣的待分析物是核酸。
193、根据权利要求192所述的试剂盒，其中所述感兴趣的待分析物的第一和第二特异性结合伴侣是寡核苷酸。
194、根据权利要求192所述的试剂盒，其中感兴趣的待分析物的类似物是寡核苷酸。
195、根据权利要求186所述的试剂盒，其中所述感兴趣的待分析物是蛋白质。
196、根据权利要求195所述的试剂盒，其中所述感兴趣的待分析物的第一和第二特异性结合伴侣是抗体或特异性结合蛋白。
197、一种包含了聚苯乙烯珠粒的组合物，该聚苯乙烯珠粒含有芳烃。
198、根据权利要求197所述的组合物，其中所述芳烃选自二苯基蒽和红荧烯。
199、根据权利要求197所述的组合物，其中所述聚苯乙烯珠粒含有大约7.5×109个二苯基蒽分子。
200、根据权利要求197所述的组合物，其中所述聚苯乙烯珠粒含有大约4×108个红荧烯分子。
201、根据权利要求13、86、108或143任一项所述的方法，其中所述蛋白质是C反应性蛋白。
202、根据权利要求61、79、163或180任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是C反应性蛋白。
203、根据权利要求195所述的试剂盒，其中所述蛋白质是C反应性蛋白。
204、根据权利要求1、34、86、101、129或143任一项所述的方法，其中k是大于或等于2的整数。
205、根据权利要求48、70、79、156、172或180任一项所述的组合物，其中k是大于或等于2的整数。
206、根据权利要求186所述的试剂盒，进一步包含至少两种ECL部分。
CN200580028420.XA 2004-06-23 2005-06-23 使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物 Active CN101057145B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58171904P 2004-06-23 2004-06-23
US60/581,719 2004-06-23
PCT/US2005/022388 WO2006083305A2 (en) 2004-06-23 2005-06-23 Methods and compositions for the detection of biological molecules using a two particle complex

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101057145A true CN101057145A (zh) 2007-10-17
CN101057145B CN101057145B (zh) 2014-10-22

Family

ID=36777656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200580028420.XA Active CN101057145B (zh) 2004-06-23 2005-06-23 使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物

Country Status (9)

Country Link
US (3) US8188243B2 (zh)
EP (1) EP1787124A2 (zh)
JP (1) JP5118964B2 (zh)
KR (1) KR101076578B1 (zh)
CN (1) CN101057145B (zh)
AU (1) AU2005326758B2 (zh)
CA (1) CA2571283C (zh)
HK (1) HK1114173A1 (zh)
WO (1) WO2006083305A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102183657A (zh) * 2011-02-24 2011-09-14 南京基蛋生物科技有限公司 一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法
CN104854456A (zh) * 2012-10-16 2015-08-19 模式诊断有限公司 利用电化学检测的免疫测定
CN106596972A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 青岛科技大学 一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法
CN108152275A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 福州大学 一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法
CN114752374A (zh) * 2022-04-11 2022-07-15 北京艾维镝生物技术有限责任公司 一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物的制备方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312896B1 (en) * 1998-09-17 2001-11-06 Igen Inaternational, Inc. Assays for measuring nucleic acid binding proteins and enzyme activities
US8188243B2 (en) * 2004-06-23 2012-05-29 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of biological molecules using a two particle complex
SI2271938T1 (sl) 2008-04-11 2014-07-31 Board Of Regents Of The University Of Texas System Postopek in naprava za ojačenje električno generirane kemiluminiscence nanodelcev
EP2626693A3 (en) 2008-05-08 2014-10-01 Board of Regents of the University of Texas System Luminescent nanostructured materials for use in electrogenerated chemiluminescence
JP5455878B2 (ja) 2010-11-30 2014-03-26 シスメックス株式会社 被検物質の電気化学的検出方法
WO2013112745A1 (en) * 2012-01-24 2013-08-01 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Peptide identification and sequencing by single-molecule detection of peptides undergoing degradation
CN102854183A (zh) * 2012-09-04 2013-01-02 上海师范大学 一种固态电化学发光检测三聚氰胺的方法
WO2015054287A2 (en) * 2013-10-07 2015-04-16 The University Of Utah Research Foundation Methods and systems for electrochemically detecting or quantifying an analyte
CN106248659A (zh) * 2016-09-14 2016-12-21 燕山大学 一种晶相依赖有机半导体微纳电化学发光传感器及其应用
US11307206B2 (en) * 2018-04-27 2022-04-19 Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin Functionalized metal-labeled beads for mass cytometry
CN108827946B (zh) * 2018-04-30 2021-03-02 福建师范大学 一种共用共反应试剂类型的呕吐毒素比率型电致化学发光免疫传感器及其检测方法
CN109651621B (zh) * 2019-01-08 2021-05-14 安徽师范大学 一种锆基金属有机框架复合材料及其制备方法和应用
CN109946289B (zh) * 2019-04-16 2021-06-22 济南大学 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法
CN110146692A (zh) * 2019-05-28 2019-08-20 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒
WO2021019732A1 (ja) * 2019-07-31 2021-02-04 株式会社日立ハイテク 生体分子分析方法および生体分子分析装置
CN112649605B (zh) * 2020-12-14 2022-11-01 哈尔滨理工大学 一种基于NaBiF4上转换纳米粒子的ECL生物传感器
CN113267629B (zh) * 2021-05-13 2022-06-24 广东优尼德生物科技有限公司 一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法
WO2023084370A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 3M Innovative Properties Company Solid support comprising ligands suitable for polynucleic acid processing, articles and methods
WO2023084369A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 3M Innovative Properties Company Method of processing polynucleic acids
CN114113051B (zh) * 2021-12-16 2023-06-16 南京信息工程大学 一种psma电致化学发光传感器的制备方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5500188A (en) 1984-03-01 1996-03-19 Molecular Devices Corporation Device for photoresponsive detection and discrimination
US5310687A (en) 1984-10-31 1994-05-10 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US6881536B1 (en) 1986-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Particle based electrochemiluminescent assays
US6271041B1 (en) 1986-04-30 2001-08-07 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
DE3752345T2 (de) 1986-04-30 2002-08-22 Igen Int Inc Elektrolumineszente Verbindungen und Zwischenprodukte zur Herstellung
US6316607B1 (en) 1986-04-30 2001-11-13 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent assays
US5935779A (en) 1988-11-03 1999-08-10 Igen International Inc. Methods for improved particle electrochemiluminescence assay
US5182016A (en) 1990-03-22 1993-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Polymer-coated carbon-clad inorganic oxide particles
IL100867A (en) 1991-02-06 1995-12-08 Igen Inc Method and device for improved luminescence testing
ZA92803B (en) 1991-02-06 1992-11-25 Igen Inc Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescene asay including plurality of magnets
US5342774A (en) 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US5336596A (en) 1991-12-23 1994-08-09 Tropix, Inc. Membrane for chemiluminescent blotting applications
US5369036A (en) * 1992-07-02 1994-11-29 Becton, Dickinson And Company Enhancement of signal in immunoassays using microparticles which contain different detectable substances
EP0687180B1 (en) 1992-12-22 2000-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for detection and treatment of individuals having abnormal cells expressing hla-a2/tyrosinase peptide antigens
US5620886A (en) 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
JPH06300763A (ja) * 1993-04-14 1994-10-28 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 蛍光免疫測定用蛍光マイクロビーズ及びその製造方法
US5571711A (en) 1993-06-17 1996-11-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for BAGE tumor rejection antigen precursors
US5610013A (en) 1993-07-22 1997-03-11 Ludwig Institute For Cancer Research Method for diagnosing a disorder by determining expression of gage tumor rejection antigen precursors
US5935818A (en) 1995-02-24 1999-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding alternatively spliced prostate-specific membrane antigen and uses thereof
DE69535002T2 (de) 1994-03-08 2006-12-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Rekombinante humanisierte antikörper gegen fb5
US5589334A (en) 1994-06-03 1996-12-31 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule which codes for a tumor rejection antigen precursor which is processed to an antigen presented by HLA-B44, and uses thereof
US5599889A (en) 1994-08-16 1997-02-04 Stoever; Harald D. H. Method of forming polymer microspheres
US5830753A (en) 1994-09-30 1998-11-03 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor dage and uses thereof.
HUT74974A (en) 1994-11-07 1997-03-28 Knsai Paint Co Ltd Process to form a coated film
WO1996021154A1 (en) 1995-01-06 1996-07-11 Igen, Inc. Electrogenerated chemiluminescence through enhanced particle luminescence
US6140045A (en) 1995-03-10 2000-10-31 Meso Scale Technologies Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US5939526A (en) 1995-03-21 1999-08-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated RAGE-1 derived peptides which complex with HLA-B7 molecules and uses thereof
US6319670B1 (en) 1995-05-09 2001-11-20 Meso Scale Technology Llp Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles
US5679519A (en) 1995-05-09 1997-10-21 Oprandy; John J. Multi-label complex for enhanced sensitivity in electrochemiluminescence assay
US5821122A (en) 1995-06-07 1998-10-13 Inserm (Institute Nat'l De La Sante Et De La Recherche . .) Isolated nucleic acid molecules, peptides which form complexes with MHC molecule HLA-A2 and uses thereof
ATE358276T1 (de) 1995-06-07 2007-04-15 Bioveris Corp Elektrochemilumineszenz-enzymimmunoassay
US5792621A (en) 1995-06-28 1998-08-11 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Fiber-optic chemiluminescent biosensors for monitoring aqueous alcohols and other water quality parameters
JP3545524B2 (ja) * 1995-12-28 2004-07-21 ロッシュ ディアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 生理活性物質を固定化した導電性磁気ビーズ
US6037124A (en) 1996-09-27 2000-03-14 Beckman Coulter, Inc. Carboxylated polyvinylidene fluoride solid supports for the immobilization of biomolecules and methods of use thereof
US6548246B1 (en) * 1997-05-16 2003-04-15 The Regents Of The University Of California Method and probes for the identification of microbial genes specifically induced during host infection
US6365346B1 (en) * 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
US6200531B1 (en) 1998-05-11 2001-03-13 Igen International, Inc. Apparatus for carrying out electrochemiluminescence test measurements
US6312896B1 (en) 1998-09-17 2001-11-06 Igen Inaternational, Inc. Assays for measuring nucleic acid binding proteins and enzyme activities
WO2000023785A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 Ljl Biosystems, Inc. Improvements in luminescence assays
US6136268A (en) 1999-08-17 2000-10-24 Orion Diagnostica Method for luminescence measurements
US6248353B1 (en) 1999-12-10 2001-06-19 Dade Behring Inc. Reconstitution of purified membrane proteins into preformed liposomes
US6548264B1 (en) 2000-05-17 2003-04-15 University Of Florida Coated nanoparticles
US6808939B2 (en) 2001-06-29 2004-10-26 Igen International, Inc. ECL labels having improved non-specific binding properties, methods of using and kits containing the same
US6919173B2 (en) 2001-09-10 2005-07-19 Meso Scale Technologies, Llc. Assay buffer, compositions containing the same, and methods of using the same
CA2477017A1 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
DE60320780D1 (de) * 2002-04-22 2008-06-19 Univ Florida Funktionalisierte nanopartikel und verwendungsverfahren
US7176036B2 (en) * 2002-09-20 2007-02-13 Arrowhead Center, Inc. Electroactive microspheres and methods
US7597936B2 (en) 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
US7741033B2 (en) 2003-05-13 2010-06-22 Trustees Of Boston College Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
JP4087295B2 (ja) * 2003-06-06 2008-05-21 株式会社サタケ ダイオキシン類の測定方法及び装置
WO2005062982A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Xing-Xiang Li Signal amplification methods for analyte detection
US20050191687A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-01 Tianxin Wang Method for multiplexed analyte detection
US8188243B2 (en) * 2004-06-23 2012-05-29 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of biological molecules using a two particle complex

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102183657A (zh) * 2011-02-24 2011-09-14 南京基蛋生物科技有限公司 一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法
CN102183657B (zh) * 2011-02-24 2014-02-05 南京基蛋生物科技有限公司 一种依赖聚苯乙烯纳米粒大幅度增加化学发光磁酶免疫灵敏度的方法
CN104854456A (zh) * 2012-10-16 2015-08-19 模式诊断有限公司 利用电化学检测的免疫测定
CN106596972A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 青岛科技大学 一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法
CN106596972B (zh) * 2016-12-16 2018-08-10 青岛科技大学 一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法
CN108152275A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 福州大学 一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法
CN114752374A (zh) * 2022-04-11 2022-07-15 北京艾维镝生物技术有限责任公司 一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物的制备方法
CN114752374B (zh) * 2022-04-11 2023-02-03 北京艾维镝生物技术有限责任公司 一种均相化学发光免疫检测技术所用微球组合物的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0512611A (pt) 2008-03-25
CA2571283A1 (en) 2006-08-10
US9442117B2 (en) 2016-09-13
US8871917B2 (en) 2014-10-28
WO2006083305A2 (en) 2006-08-10
US20150044669A1 (en) 2015-02-12
KR20070049631A (ko) 2007-05-11
JP5118964B2 (ja) 2013-01-16
KR101076578B1 (ko) 2011-10-24
WO2006083305A3 (en) 2007-04-05
EP1787124A2 (en) 2007-05-23
WO2006083305A8 (en) 2010-04-22
US20060078912A1 (en) 2006-04-13
CN101057145B (zh) 2014-10-22
HK1114173A1 (zh) 2008-10-24
JP2008504528A (ja) 2008-02-14
CA2571283C (en) 2013-10-22
AU2005326758A1 (en) 2006-08-10
US20120329173A1 (en) 2012-12-27
AU2005326758B2 (en) 2011-07-14
US8188243B2 (en) 2012-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101057145A (zh) 使用双粒子复合体检测生物分子的方法和组合物
CN100419426C (zh) 功能化纳米微粒及其使用方法
CN1107863C (zh) 含有多个磁体的磁微粒基发光测定的方法和装置
CN1094593C (zh) 改进的发光测定的方法和装置
Kushon et al. Detection of single nucleotide mismatches via fluorescent polymer superquenching
Xue et al. Simultaneous electrochemical detection of multiple antibiotic residues in milk based on aptamers and quantum dots
CN1864066A (zh) 使用非线性光学技术检测涉及构象变化的相互作用的方法
US20050158782A1 (en) Magnetic fine particles having lower critical solution temperature
CN1582394A (zh) 分子的快速灵敏检测
CN1016645B (zh) 捕获靶子及本底的方法及亲和性测定的装置
Cai et al. Silica nanoparticles based label-free aptamer hybridization for ATP detection using hoechst33258 as the signal reporter
Zavoiura et al. Quantum dot-PNA conjugates for target-catalyzed RNA detection
Yi et al. Aptamer-aided target capturing with biocatalytic metal deposition: An electrochemical platform for sensitive detection of cancer cells
Kim et al. Label-free and naked eye detection of PNA/DNA hybridization using enhancement of gold nanoparticles
Yoshino et al. Bioengineering of bacterial magnetic particles and their applications in biotechnology
US20080050842A1 (en) Method of visualization and quanitification of biopolymer molecules immobilized on solid support
Taira et al. Self‐assembly DNA‐conjugated polymer for detection of single nucleotide polymorphism
CN109001164B (zh) 一种基于锰卟啉淬灭CdSe量子点的光电生物传感器及其制法和应用
CN1791799A (zh) 钩挂/脱开存在于样品中的靶子或者物体的装置和方法
JP7448239B2 (ja) 核酸配列等の簡便検出法
Nakauchi et al. DNA Terminal-Specific Dispersion Behavior of Polystyrene Latex Microparticles Densely Covered with Oligo-DNA Strands Under High-Salt Conditions
Narmack Functionalization and Evaluation of Nanoparticle Probes for the Development of a 14-Plex Diagnostic assay
WO2024089242A1 (en) Kit and process for the detection of a target nucleic acid
Urmann Aptamer-based optical biosensors
BRPI0512611B1 (pt) Método, kit e composição para detectar um ácido nucleico ou proteína em uma amostra

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1114173

Country of ref document: HK

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20081219

Address after: American Texas

Applicant after: Univ Texas

Address before: American Texas

Applicant before: Univ Texas

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1114173

Country of ref document: HK