JP7448239B2 - 核酸配列等の簡便検出法 - Google Patents

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Description

本発明は、標的核酸を簡便に効率よく検出するためのキットおよびそれを用いた検出方法に関する。また、本発明は、標的分子を簡便に効率よく検出するためのキットおよびそれを用いた検出方法に関する。
近年、mRNAやmiRNA（マイクロRNA）などのRNA分子を標的とした疾患やストレスなどの検出法の開発が注目されている。RNAの定量検出法としてリアルタイムPCRを用いる方法が知られているが、クリニックでの簡易検査やセルフメディケーションに用いるには装置の価格や使用コストが高く、操作も煩雑である。
一方、特許文献１ではローリングサークル増幅法によってRNAを検出する方法が開示されているが、アナライトのRNAをプライマーに使用しているため、検出対象にできる配列が３'末端に制約される。また、増幅効率や検出効率の面でも十分ではない。
このような技術背景の下、本発明者らはRNA配列の簡便検出法を報告した（特許文献２）。詳細には、標的RNAと一本鎖環状DNAおよびプライマーとをハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させ、プライマーからローリングサークル増幅（RCA）法により増幅を行い、増幅産物に含まれる検出試薬結合配列（グアニン四重鎖含有配列など）をチオフラビンT（ThT）誘導体などの検出試薬を用いて検出することで、標的RNAを検出する方法である。
また、本発明者らは標的分子の検出法を報告した（特許文献３）。詳細には、一本鎖環状DNA、キャプチャーオリゴヌクレオチドおよびプライマーを用いたローリングサークル増幅（RCA）法において、キャプチャーオリゴヌクレオチドおよびプライマーの配列に、標的の非核酸分子に結合するアプタマー配列を含めることにより、非核酸分子を効率的に検出する方法である。
特開2012-080871号公報 国際公開2016/152936号 国際公開2018/168895号
特許文献２、３に記載の一本鎖環状DNA、キャプチャーオリゴヌクレオチドおよびプライマーを用いたローリングサークル増幅（RCA）法（SATIC法とも呼ばれる）により、それぞれ、標的核酸又は標的分子を効率よく検出できるようになったが、さらなる改良が求められていた。したがって、本発明は、標的核酸又は標的分子を簡便な手法でさらに効率よく検出するためのキットおよび方法の提供を課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。特許文献２、３に記載されたいずれの方法でも、溶液中に遊離の状態にある２種類のプライマーを用いていたが、これを改良し、担体に結合したプライマーやキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いること、さらには各々の量比を調整することによって、標的核酸又は標的分子を検出する感度が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットを提供する。
前記核酸検出用キットは、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、アビジンが固定されている担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
ことを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、前記担体に結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーと第２のオリゴヌクレオチドプライマーの割合がモル比で1:10～1:30であることを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、（v）検出用試薬を含み、前記第２一本鎖環状DNAが検出用試薬結合配列に相補的な配列を含むことを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬であることを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含むことを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含むことを好ましい態様としている。
Figure 0007448239000001
 Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１～５の炭化水素基を示し、
nは０～５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
前記核酸検出用キットは、一般式（I）で表される化合物が下記式（II）または（III）で表されることを好ましい態様としている。
Figure 0007448239000002
Figure 0007448239000003
前記核酸検出用キットは、グアニン四重鎖結合試薬が下記のThT-PEGであることを好ましい態様としている。ここで、PEG鎖は枝分かれ構造を有してもよい。なお、ThT-PEGはポリエチレングリコール鎖とともに担体に固定化されてもよい。
Figure 0007448239000004
ThT-PEG
（R5はアミノ基、水酸基、アルキル基、またはカルボキシル基であり、ｎは４～５０の整数である。）
前記核酸検出用キットは、グアニン四重鎖結合試薬が下記のThT-PEG-ThTであることを別の好ましい態様としている。なお、ThT-PEG-ThTのPEG鎖部分は枝分かれ構造を有してもよく、ポリエチレングリコール鎖とともに担体に固定化されてもよい。また、PEGリンカーの代わりにスペルミンリンカーを有する化合物を用いることもできる。
Figure 0007448239000005
ThT-PEG-ThT
前記核酸検出用キットは、クラウンエーテルを含むことを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、前記クラウンエーテルが、18-クラウン-6または15-クラウン-5であることを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、非イオン性界面活性剤を含むことを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたはオクチルフェノールエトキシレートであることを好ましい態様としている。
前記核酸検出用キットは、標的核酸がウイルスRNAであることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記キットを使用した標的核酸の検出方法であって、
標的核酸に前記第１一本鎖環状DNAおよび前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、
該第１のオリゴヌクレオチドプライマーからローリングサークル増幅によって標的核酸に基づく核酸増幅反応を行う工程、
得られた増幅産物に、前記第２一本鎖環状DNAおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、
該記第２のオリゴヌクレオチドプライマーからローリングサークル増幅によって前記増幅産物に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含む方法を提供する。
また、本発明は、
第１の領域と、第１の領域の３’側の、変異を含む第２の領域とを含む短鎖標的核酸、
（i）短鎖標的核酸の第２の領域に相補的な短鎖標的核酸結合領域とその３’側の第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第１の一本鎖環状DNA、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と、短鎖標的核酸の第１の領域に相補的な短鎖標的核酸結合配列を含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む第２の一本鎖環状DNA、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、その５’末端を介して、担体と結合しており、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットを提供する。
また、本発明は、前記キットを使用した短鎖標的核酸の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む短鎖標的核酸に、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、
ローリングサークル増幅によって短鎖標的核酸とキャプチャーオリゴヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含む方法を提供する。
また、本発明は、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットを提供する。
また、本発明は、前記キットを使用した標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含む方法を提供する。
本発明によれば、標的核酸配列又は標的分子が存在すると、RCAによって第１増幅産物が生成し、該第１増幅産物と第２一本鎖環状DNAの複合体にオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズして、RCAにより、第２増幅産物、例えば、幾つものグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列が直列に繋がったDNA鎖が生成し、これをThT（誘導体）などの検出試薬で染色することにより、核酸配列を特異的に検出できる。
いずれにおいても、プライマーやキャプチャーオリゴヌクレオチドを担体に固定化したことにより、顕著に検出感度を向上させることができるようになった。
また、検出試薬としてThT-PEGやThT-PEG-ThTを使用することにより、目視で増幅産物の有無を確認することができ、検査を簡便に行うことができる。さらに、検出試薬としてThT-PEGまたはThT-PEG-ThTとPEG鎖を担体に固定化したもの、またはそれらとThT-PEGまたはThT-PEG-ThTを組み合わせたものを使用することで、検出感度を顕著に向上させることができる。
本発明に係る核酸検出方法の模式図。 本発明の実施例１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の比較例１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の比較例１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例１の結果を示す図（図面代用写真）。（A）：ターゲットRNA (40mer)を用いた場合、（B）：ターゲットRNA (全長)を用いた場合。 本発明の参考例１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例１の結果を示す図。 本発明の実施例４の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例２の結果を示す図。 本発明に係る標的分子検出方法の模式図。 本発明の実施例５の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例３の結果を示す図。 本発明の実施例６の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例４の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例４の結果を示す図。 本発明の実施例７の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例５の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例５の結果を示す図。 本発明の実施例８の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例６の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の参考例６の結果を示す図。 本発明の実施例９の結果を示す図。 本発明に係る核酸検出方法の模式図。 本発明に係る核酸検出方法の模式図。 本発明の実施例１０の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１２の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１４の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１５の結果を示す図～その１（図面代用写真）。 本発明の実施例１５の結果を示す図～その２（図面代用写真）。 本発明の実施例１６の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１７の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１８の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例１９の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２０の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２２の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２３の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２４の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２５の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２６の結果を示す図（図面代用写真）。レーン１：化合物２、レーン２：化合物５、レーン３：ThT‐PEGとPEG鎖を担体に固定化したもの、レーン４：化合物２＋化合物５、レーン５：化合物２＋ThT‐PEGとPEG鎖を担体に固定化したもの、レーン６：化合物５＋ThT‐PEGとPEG鎖を担体に固定化したもの、レーン７：化合物２＋化合物５＋ThT‐PEGとPEG鎖を担体に固定化したもの。 本発明の実施例２７の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２８の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例２９の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３０の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３１の結果を示す図（図面代用写真）。 本発明の実施例３２の結果を示す図（図面代用写真）。
＜第一の態様＞
＜標的核酸検出キット＞
本発明の第一の態様における第一の形態にかかる標的核酸検出キットは、
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットである。
＜標的核酸＞
標的核酸は、第１一本鎖環状DNAおよび第１のオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズするものであれば、特に限定されない。SNPなどの遺伝子変異を含む配列であってもよく、その場合には、標的核酸の第２の部位に該遺伝子変異を含む（図１６を参照のこと。図１６の星印が変異を示す。）。標的核酸としては、例えば、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、DNA/RNAキメラが挙げられる。また、天然の塩基、ヌクレオチド及びヌクレオシドからなるものであってもよく、非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むものであってもよい。
DNAは、特に限定されず、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAを含むあらゆる種類のDNAを標的として検出することが可能である。また、DNAの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。感染症などの疾患や中毒症などを引き起こすDNAウイルスや病原菌由来のDNAなどが例示される。
RNAは、特に限定されず、mRNA、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）を含むあらゆる種類のRNAを標的として検出することが可能である。mRNAは、ポリＡ配列を有していても、有していなくてもよい。RNAは、siRNA、miRNA、piRNA、rasiRNA、rRNA、tRNAを含むノンコーディングRNAであってもよく、さらに、ウイルスなどのゲノムRNAであってもよい。また、RNAの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。疾患特異的に発現するRNAや疾患で発現量が変化するRNA、感染症などの疾患や中毒症などを引き起こすRNAウイルス（例えば、インフルエンザウイルスなど）や病原菌由来のRNAなどが例示される。
増幅反応時（使用時）の標的核酸の濃度は、下限が例えば0.1aM以上、1aM以上、10aM以上、50aM以上であり、一方で、上限が例えば1000aM以下、500aM以下、200aM以下、100aMである。
＜第１一本鎖環状DNA＞
第１一本鎖環状DNAは、標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基のプライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む。
図１を参照して説明する（標的核酸の第２の部位に該遺伝子変異を含む場合には図１６を参照のこと。ただし、図１の符号２１、２１１、２１２、２２、２２１、２２２は、それぞれ、図１６の符号２７、２７１、２７２、２８、２８１、２８２に対応する。）。ただし、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。また、便宜上、担体は記載して
いない。
第１一本鎖環状DNA２０は標的核酸２１の第1の部位２１１に相補的な配列２０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列
２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。
第１一本鎖環状DNA２０は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。
＜第１オリゴヌクレオチドプライマー＞
第１オリゴヌクレオチドプライマー２２は、標的核酸２１の、第１の部位２１１の３’側に隣接した第２の部位２１２に相補的な８～１５塩基の配列２２１と、その３’側に連結された、第１一本鎖環状DNA２０のプライマー結合部位２０２に相補的な７～８塩基の配列２２２と、を含む。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２は、その５’末端を介して、担体と結合している。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２、その５’末端、および担体のいずれについても、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２が、その５’末端を介して、担体と結合でき、該第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２を用いて後述するローリングサークル増幅（RCA）法によって標的核酸２１に基づく核酸増幅反応ができるものであれば、それらの態様は制限されない。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２の５’末端として、例えば、ビオチン、アミノ基、アルデヒド基、又はＳＨ基で修飾されたものなどが挙げられる。担体としては、これらのそれぞれと結合できる担体が挙げられ、例えば、アビジン（その誘導体、すなわち、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラビジンなどを含む。）が固定されている担体、また、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理された担体などが挙げられる。固定化は常法に従えばよい。
担体は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２と後述する第２オリゴヌクレオチドプライマー２５とを近傍に固定できるものが好ましい。両者が近傍に存在することで、第１オリゴヌクレオチドプライマー２２から第１増幅産物２３が増幅される段階と、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５から第２増幅産物２６が増幅される段階とが、溶液中に遊離の状態にある２種類のプライマーを用いた、例えば特許文献２に記載の方法と比較して、効率的に行われ、結果として検出感度の著しい向上が達せられるからである。
好ましい担体として、例えばビーズや、センサー等で用いる基板のような平面担体が挙げられる。ビーズとは、粒子状の不溶性担体であり、その平均粒径は例えば10 nm～100 μmであり、好ましくは30nm～１0μmであり、より好ましくは30nm～１μm、さらに好ましくは30nm～500nmである。ビーズの材質は特に限定されない。例えば、磁性体（フェライトやマグネタイトなどの酸化鉄、酸化クロム、コバルトなどの磁性材料）、シリカ、アガロース、セファロースなどが挙げられる。磁性体ビーズは、「磁気ビーズ」と称されることがある。また、金コロイドなどの金属コロイド粒子も使用できる。
＜第２一本鎖環状DNA＞
第２一本鎖環状DNA２４は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補
配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列２４２と、
を含む。
配列２０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基であ
る。第２一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化す
ることによって得ることができる。
第２一本鎖環状DNA２４は、検出用試薬結合配列に相補的な配列を含むことが好ましい。該検出用試薬結合配列としては、例えばグアニン四重鎖形成配列が挙げられる。
グアニン四重鎖形成配列としては、Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr; 10(4): 261-275.に記載されたような配列が挙げられ、Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3で表されるが、具体的には、特許文献２に記載の配列などが例示される。よって、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３としては、Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3が例示される。すなわち、連続する３つのＣが、１～１０個（好ましくは１～５個）の任意の塩基（Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）からなる配列をスペーサーとして、４回繰り返される配列である。
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３はその前後、すなわち、第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列２４１との間および第２プライマー結合配列２
４２との間に任意の配列を含んでもよい。
なお、図１では、第２一本鎖環状DNA２４がグアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３を含む場合について説明したが、これは、第２一本鎖環状DNA２４が検出用試薬結合配列に相補的な配列を含む場合の一例に過ぎず、しかも、該検出用試薬結合配列に相補的な配列がグアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３である場合に過ぎない。このほかにも、例えば、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。
また、第２一本鎖環状DNA２４が検出用試薬結合配列に相補的な配列を含まなくても、第２増幅産物２６を検出できる公知の検出方法によって検出することができる。すなわち、検出用試薬結合配列に結合する検出用試薬を用いなくても公知の検出方法によって検出することができる。例えば、第１増幅産物２３には結合せず、第２増幅産物２６に特異的に結合する蛍光試薬などで第２増幅産物２６を標識し、蛍光強度を測定することで検出する方法などが挙げられる。
＜第２オリゴヌクレオチドプライマー＞
第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に
相補的な配列２５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、
を含む。
第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、その５’末端を介して、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２が結合している前記担体と結合している。
第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５、その５’末端、および担体のいずれの態様についても、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの欄の説明を援用するが、好ましくは、それぞれ、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２、その５’末端、および担体の態様と同一の態様であることが好ましい。
すなわち、例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２は、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、アビジンが固定されている担体と結合しており、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２が結合している前記担体と結合していることが好ましい。
＜第１オリゴヌクレオチドプライマーと第２オリゴヌクレオチドプライマーの量比＞
担体に固定された第１オリゴヌクレオチドプライマー２２と第２オリゴヌクレオチドプライマー２５の量比には、各プライマーを担体に固定化する際の濃度比が反映される。例えば、後述する実施例のように、担体を洗浄後、上清を除去し、そこへ濃度が１μMの第１オリゴヌクレオチドプライマー２２と、濃度が20μMの第２オリゴヌクレオチドプライマー２５とを含む混合液を担体に加えて固定化すると、担体に固定された第１オリゴヌクレオチドプライマー２２と第２オリゴヌクレオチドプライマー２５の量比（モル比）は、1: 20と扱うことができる。
担体に固定化された、第１オリゴヌクレオチドプライマー２２と第２オリゴヌクレオチドプライマー２５の量比は、モル比で、好ましくは1:10～1:30であり、より好ましくは1:10～1:25であり、さらに好ましくは1:10～1:20であり、よりさらに好ましくは1:10～1:15である。
増幅反応時（使用時）の第１オリゴヌクレオチドプライマー２２の濃度は、モル比で、好ましくは0.0025 pmol/μL以上、より好ましくは0.005 pmol/μL以上であり、一方で、好ましくは0.04 pmol/μL以下、より好ましくは0.02 pmol/μL以下である。
また、増幅反応時（使用時）の第２オリゴヌクレオチドプライマー２５の濃度は、モル比で、好ましくは0.0125 pmol/μL以上、より好ましくは0.025 pmol/μL以上であり、一方で、0.8 pmol/μL以下、より好ましくは0.4 pmol/L以下である。
＜第１一本鎖環状DNAと第２一本鎖環状DNAの量の関係＞
増幅反応時（使用時）の第１一本鎖環状DNA２０と第２一本鎖環状DNA２４の量比は、モル比で、好ましくは1:2～1:1000、より好ましくは1:3～1:500、さらに好ましくは1:4～1:400である。
また、増幅反応時（使用時）の第１一本鎖環状DNA２０の濃度は、下限が例えば0.1nM以上、1nM以上、10nM以上、50nM以上であり、一方で、上限が例えば500nM以下、200nM以下、100nM以下である。
また、増幅反応時（使用時）の第２一本鎖環状DNA２４の濃度は、下限が例えば20nM以上、40nM以上、100nM以上、200nM以上であり、一方で、上限が例えば1000nM以下、500nM以下、400nM以下である。
＜増幅方法＞
図１に示されるように、まず、標的核酸２１に第１一本鎖環状DNA２０およびプライマー２２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的核酸２１に基づく核酸増幅反応を行う。
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNA２０と標的核酸２１とプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
RCA法はLizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998);米国特許第５，８５４，０３３号及び同第６，１４３，４９５号；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３などに記載されている。RCA法は、例えば、phi29 polymerase、Klenow DNA Polymerase (5'-3', 3'-5' exo minus) 、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社)、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることで行うことができる。
RCAによるＤＮＡの伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃～６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーがＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃～４２℃、より好ましくは約３０～３７℃で反応する。
RCAによって、標的核酸２１依存的に、プライマー２２から第１一本鎖環状DNA２０に沿って第１増幅産物２３が増幅される。
増幅産物２３は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３に相補的な配列２３３を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２一本鎖環状DNA２４は、第１増幅産物２３の配列２３３に、配列２４１を介してハイブリダイズ
する。
このようにしてできた、第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNA２４の複合体に、第２
オリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一
本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５
１を有するので、第１増幅産物２３の、第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的な
領域２３４に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２一
本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
この第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNA２４と、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５との三者複合体から、RCAにより、第２増幅産物２６が増幅される。第２増幅産物２６は、例えばグアニン四重鎖を含む配列２６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬２６２によって検出される。第１増幅産物２３に含まれる領域２３１のそれぞれに第２一本鎖環状DNA２４がハイブリダイズしてRCA反応が起こる。
第１オリゴヌクレオチドプライマー２２と第２オリゴヌクレオチドプライマー２５が同一担体上に固定化されることにより、第１オリゴヌクレオチドプライマー２２から第１増幅産物２３が増幅される段階と、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５から第２増幅産物２６が増幅される段階とが、近傍で行われるため、溶液中に遊離の状態にある２種類のプライマーを用いた特許文献２に記載の方法と比較して、検出感度の著しい向上が達せられる。
なお、図１６に例示したように、標的核酸２７として、SNPなどの遺伝子変異を含む配列を用いて該変異の有無を検出する場合には、該変異のタイプが第１オリゴヌクレオチドプライマー２８に設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、該変異のタイプが第１オリゴヌクレオチドプライマー２８に設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
そのため、第１のオリゴヌクレオチドプライマー２８においては、標的核酸２７の第２の部位２７２に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、標的核酸２７の第２の部位２７２に相補的な配列２８１の最も３’側の位置に有することが好ましい。
例えば、標的核酸２７の遺伝子変異がA/Gの一塩基多型で、Aを検出しようとするときは、Aに対応するTが第２の部位に相補的な配列２８１の最も３’側の位置になるように、第１オリゴヌクレオチドプライマー２８を設計することが好ましい。
また、反応系に例えば約150 mM以上のナトリウムイオンなど高濃度の塩が存在する場合にはSATIC反応が進みにくいが、反応系にクラウンエーテルが存在すると高塩濃度下でもSATIC反応が進みやすくなる。クラウンエーテルとしては、例えば、18-クラウン-6や15-クラウン-5が挙げられる。反応系におけるクラウンエーテルの終濃度は、例えば180～280 mM、好ましくは180～240 mMや240～280 mMである。
また、核酸やタンパク質の水和性や安定性の向上のために、反応系は非イオン性界面活性剤を含んでもよい。そのような場合としては、例えば、生体サンプルを安定的な状態で処理するときなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Tween 20）やオクチルフェノールエトキシレート（Triton X-100、Nonidet P-40）が挙げられる。反応系におけるポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートの終濃度は、2 v/v%以下とすることが好ましく、1 v/v%以下とすることがより好ましい。反応系におけるオクチルフェノールエトキシレートの終濃度は、0.8 v/v%以下とすることが好ましく、0.5 v/v%以下とすることがより好ましい。
＜検出方法＞
RCAによって得られる第２増幅産物２６は、上述した通り、公知の検出方法によって検出することができるが、第２一本鎖環状DNA２４が検出用試薬結合配列に相補的な配列を含むことにより、RCAによって得られる第２増幅産物２６に検出用試薬結合配列が含まれることが好ましい。
該検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列等である場合には、RCAによって得られる増幅産物は、グアニン四重鎖結合試薬を用いて検出することができる。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
［１］チオフラビンT（ThT）またはその誘導体
Figure 0007448239000006
 ［２］H-aggregate 『Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
Figure 0007448239000007
 ［３］TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
Figure 0007448239000008
 ［４］PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
Figure 0007448239000009
 ［５］BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan, D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
［６］APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
Figure 0007448239000010
 ［７］チアゾールオレンジ（TO）
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
［８］マラカイトグリーン
『Li X.; Zheng F.; Ren R.Chem Commun, 2015, 51, 11976-11979. 』
Figure 0007448239000011
好ましくは、上記マラカイトグリーンや、以下の一般式（I）で示されるＴｈＴ誘導体が使用できる（Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084）。
Figure 0007448239000012
 ここで、Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭素数１～１０（好ましくは１～５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（－ＮＲ2）（Ｒは独立して水素または炭素数１～５のアルキル基）、ニトロ基（－ＮＯ2）、シアノ基（－ＣＮ）、イソシアネート基（－ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（－ＯＨ）、アルデヒド基（－ＣＨＯ）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、メルカプト基（－ＳＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（－Ｏ－）、イミノ基（－ＮＨ－）、チオエーテル基（－Ｓ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、チオエステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１～５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１～３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１～５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。
ｎは０～５の整数を示し、より好ましくは０～３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。
具体的には以下のような化合物が例示される。
Figure 0007448239000013
Figure 0007448239000014
以下のPEG鎖を含むThT誘導体（ThT-PEG）を使用することもできる。
ここで、R5はアミノ基、水酸基、アルキル基、またはカルボキシル基であり、ｎは４～５０の整数であり、好ましくは５～２０の整数であり、より好ましくは８～１５の整数であり、特に好ましくは１１である。ThT-PEGとしては、R5がアミノ基の化合物がより好ましい。
Figure 0007448239000015
以下のThTがPEG鎖で連結されたThT誘導体（ThT-PEG-ThT）を使用することもできる。
ここで、ｎは４～５０の整数であり、好ましくは５～２０の整数であり、より好ましくは８～１５の整数であり、特に好ましくは１１である。また、ThT-PEG-ThTのPEG鎖はスペルミンリンカーで置換されてもよい。
Figure 0007448239000016
検出は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、RCA産物を含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。
なお、本発明の方法において、グアニン四重鎖結合試薬としてThT-PEGやThT-PEG-ThTを使用する場合には、RCA産物にThT-PEGまたはThT-PEG-ThTが結合すると特異的な凝集が起こるため、その凝集を目視で観察することによって蛍光検出装置を用いなくとも簡便にRCA増幅の有無を確認できる。なお、ThT-PEGとThT-PEG-ThTを同時に使用してもよい。
凝集を目視で観察することによってRCA増幅の有無を確認する場合、RCA増幅後に反応後処理として次の操作を行うことで速やかな凝集を生じさせることができる。
例えば、ビーズを用いている場合には、反応溶液に磁石を適用するなどしてビーズを集積してもよいし、チューブなどの反応容器を揺らしビーズを均一にしてもよいし、そのまま放置してもよい。好ましくは、反応溶液に磁石を適用するなどして磁気ビーズを集積することである。
さらに、上記の反応後処理の後、所定時間、所定温度に静置するのが好ましい。そして、チューブなどの反応容器を揺らしてビーズを均一にしたあとに磁石を適用するなどしてビーズを集積してもよいし、そのまま磁石を適用するなどしてビーズを集積してもよい。
上記所定時間とは、好ましくは１０分間以内、より好ましくは５分間以内、さらに好ましくは３分以内、よりさらに好ましくは１分以内であり、一方で、好ましくは３０秒以上である。また、上記所定温度とは、好ましくは１０℃以下、より好ましくは５℃以下、さらに好ましくは２℃以下、よりさらに好ましくは－１０℃以下、特に好ましくは－２０℃以下であり、一方で、好ましくは－３０℃以上である。
また、グアニン四重鎖結合試薬としてThT-PEG-ThTを使用する場合、PEGが併存してもよい。PEGとしては、例えばPEG 800以上、好ましくはPEG 900以上であり、一方で、例えばPEG 4000以下、好ましくはPEG 2000以下、より好ましくはPEG 1500以下、さらに好ましくはPEG 1200以下である。
また、ThT-PEG-ThTとPEGを用いる場合、反応系におけるPEGの終濃度は、例えば8 w/v%以上、好ましくは10 w/v%以上であり、一方で、例えば30 w/v%以下、好ましくは25 w/v%以下である。
ThT-PEG-ThTとPEGのモル比は１：１００００～１：２５０００であることが好ましい。
また、ThT-PEG-ThTとPEGを用いる場合、反応時間は、例えば15分以上、好ましくは20分以上であり、一方で、例えば3時間以下などである。
また、グアニン四重鎖結合試薬としてThT-PEGまたはThT-PEG-ThTを使用する場合、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTは担体に固定化された形態で反応物に添加されてもよい。ここで、担体としては、磁気ビーズなどのビーズや金コロイドなどが使用でき、その平均粒径としては例えば10 nm～100 μmであり、好ましくは30nm～１0μmであり、より好ましくは30nm～１μm、さらに好ましくは30nm～100nmである。ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTの担体への固定化は、例えば、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTにビオチンを付加し、担体に導入されたストレプトアビジンにビオチンを反応させることでThT-PEGまたはThT-PEG-ThTを担体に固定化することができる。なお、ThT-PEG-ThTを担体に固定化する場合は、PEG鎖部分に分岐鎖を設け、そこにビオチンを付加して担体に導入されたストレプトアビジンと反応させることが好ましい。ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTを担体に固定化する場合には、合わせてPEG鎖（（CH2CH2O）n、n=４～５０）も担体に固定化することが好ましい。PEG鎖の担体への固定化も、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThT同様に、PEG鎖にビオチンを付加し、担体に導入されたストレプトアビジンにビオチンを反応させることで行うことができる。
ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTとPEG鎖を担体に固定化し、検出試薬として使用する場合、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTとPEG鎖の割合は３：７～９：１であることが好ましい。
また、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTとPEG鎖を担体に固定化したものと、ThT-PEGおよび／またはThT-PEG-ThTを合わせて使用することもできる。
本発明の方法に使用し得る、グアニン四重鎖検出試薬の一例としての、ThT誘導体の合成例と、ThT誘導体を用いたグアニン四重鎖検出の実験例は、特許文献２に記載されており、公知である。
また、ThT-PEGについては、特開２０１８－１５４５６４の実施例にThT-P42として記載されている。ThT-PEG-ThTの合成法は後述の実施例に示した。
本発明の第一の態様における第二の形態は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーをmiRNAなどの短鎖標的核酸、好ましくは変異を含む短鎖標的核酸とし、それを捕捉するキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いる、核酸検出用キット、および該キットを使用した標的核酸の検出方法である。
このようなmiRNAとしては、例えば、miR-21CA、miR-13bなどが例示される。
変異を含むmiRNAの例で説明すると、
本形態にかかるキットは、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAを短鎖標的核酸として用い、
（i）miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第１の一本鎖環状DNA、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と、miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む第２の一本鎖環状DNA、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、その５’末端を介して、担体と結合しており、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが結合している前記担体と結合している、キットであり、
標的核酸の検出方法は、該キットを使用するものである。この場合、miRNAが第一のプライマーとして機能してそこから伸長鎖が生じ、これに第２の一本鎖環状DNAと、第２のオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズして増幅反応が進行する。
図１７を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。また、便宜上、担体は記載していない。
一本鎖環状DNA４０は標的miRNA４２の第２の領域４２２に相補的な配列（miRNA結合領域）４０１と、その３’側に連結した第２の領域４０２と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３を含む。
配列４０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列４０２の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１の一本鎖環状DNA４０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA４０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３と同一の配列４４１と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列４４２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３と、を含む。
配列４４１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列４４２の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３については、第一の態様における第一の形態で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA４４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA４４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
なお、図１７では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。また、本態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、第2の一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
＜キャプチャーオリゴヌクレオチド＞
キャプチャーオリゴヌクレオチド４１は、その５’末端を介して、担体と結合している。キャプチャーオリゴヌクレオチド４１、その５’末端、および担体のいずれについても、キャプチャーオリゴヌクレオチド４１が、その５’末端を介して、担体と結合でき、標的miRNA４２とハイブリダイズし、該標的miRNA４２を用いてローリングサークル増幅（RCA）法によって標的miRNA４２に基づく核酸増幅反応ができるものであれば、それらの態様は制限されない。キャプチャーオリゴヌクレオチド４１の５’末端、および担体については、第一の態様における第一の形態の第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２で説明したのと同様である。
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５の５’末端、および担体については、第一の態様における第一の形態の第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５で説明したのと同様である。
第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、を含む。
＜増幅方法＞
図１７に示されるように、まず、標的miRNA４２に、キャプチャーオリゴヌクレオチド４１および第１の一本鎖環状DNA４０をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様における第一の形態と同様である。
RCAによって、標的miRNA４２依存的に、第１の一本鎖環状DNA４０に沿って第１増幅産物４３が増幅される。
増幅産物４３は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３に相補的な配列４３１を含むため、この配列４０３と同一の配列４４１を含む第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の増幅産物４３の配列４３１に、配列４４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１を有するので、第１の増幅産物４３の、第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域４３２に、配列４５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、配列４５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA４４の第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA４４にも配列４５２を介してハイブリダイズする。
この第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNA４４と、第２のオリゴヌクレオチドプ
ライマー４５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物４６（伸長鎖）が増幅さ
れる。第２の増幅産物４６はグアニン四重鎖を含む配列４６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬４７によって検出される。本形態では、第１の増幅産物４３に含まれる領域４３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA４４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
短鎖標的核酸の配列がキャプチャーオリゴヌクレオチドの配列とハイブリダイズするときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、短鎖標的核酸の配列がキャプチャーオリゴヌクレオチドの配列とハイブリダイズしないときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、短鎖標的核酸の配列または有無が同定できる。
短鎖標的核酸が変異を含む場合には、短鎖標的核酸の変異のタイプがキャプチャーオリゴヌクレオチドの配列に設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、短鎖標的核酸の変異のタイプがキャプチャーオリゴヌクレオチドの配列に設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、短鎖標的核酸の変異のタイプまたは変異の有無が同定できる。
＜検出試薬＞
本発明の方法においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いることもできるが、特異的かつ好感度に検出するためには、特定の核酸配列（検出試薬結合配列）に結合して発光又は発色する分子が好ましい。例えば、上記のThT誘導体などのグアニン四重鎖結合試薬が挙げられる。ThT誘導体としてThT-PEGまたはThT-PEG-ThTを使用する場合、増幅産物を目視で確認できるため好ましく、ThT-PEGまたはThT-PEG-ThTをPEG鎖とともに担体に固定化すること、さらにはThT-PEGまたはThT-PEG-ThTをPEG鎖とともに担体に固定化したものと、ThT-PEGおよび／またはThT-PEG-ThTを合わせて使用すること、でより検出感度を挙げることができるので好ましい。
その他の詳細は、第一の態様における第一の形態と同様である。
＜第二の態様＞
＜標的分子の検出方法＞
本発明の第二の態様にかかる標的分子の検出方法は、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチ
ドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２
一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含み
、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配
列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２一本鎖環状DNAは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補
配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環
状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接
した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列に相補的な配
列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、方法である。
＜標的分子＞
本明細書において、標的分子は、第１のアプタマー配列と第２のアプタマー配列に結合できる分子であれば特に制限されないが、非核酸分子が好ましく、タンパク質やペプチド、低分子化合物などが挙げられ、糖、ビタミン、ホルモン、補酵素なども含まれる。
例えば、ホルモンとしては、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどが例示される。
タンパク質としては、トロンビンなどの血液凝固因子、ウイルス由来タンパク質、サイトカインや増殖因子（上記ホルモンにも該当し得る）、腫瘍マーカーなどの疾患マーカータンパク質などが例示される。
抗生物質としては、ストレプトマイシン、アンピシリン、カナマイシン、アクチノマイシン、アンホテリシン、アンチマイシン、バフィロマイシン、ブレオマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、コンカナマイシン、エリスロマイシン、G418、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、マイトマイシン、ネオマイシン、オリゴマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、ラパマイシン、テトラサイクリン、トブラマイシン、バリノマイシンなどが例示される。
標的分子は単離されたものでもよいし、生物種由来の試料に含まれるものでもよい。そのような標的分子を含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物を含む試料が挙げられる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調製した試料であってもよい。
＜第１一本鎖環状DNA＞
第１一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列を含む。
図１０を参照して説明する。ただし、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。また、便宜上、担体は記載していない。
第１一本鎖環状DNA３０は、第１の領域３０１（プライマー結合配列）と、第２の領域３０２（キャプチャーオリゴヌクレオチド３１の第1の領域３１１に相補的な配列）と、第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３を含む。
第１の領域３０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２の領域３０２の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１一本鎖環状DNA３０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第１一本鎖環状DNA３０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
＜第１のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含む。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、アプタマーの結合特性、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図１０では、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２は、標的分子３７に結合する第１のアプタマー配列３２１と、その３’側に連結された、第１一本鎖環状DNA３０の第１の領域３０１に相補的な配列３２２とを含む。第１のアプタマー配列３２１の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％であり、第１一本鎖環状DNA３０の第１の領域３０１に相補的な配列３２２の長さは好ましくは７～８塩基である。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２は、その５’末端を介して、担体と結合していてもよい。
その場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２、その５’末端、および担体のいずれについても、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２が、その５’末端を介して、担体と結合でき、標的分子３７に結合する第１のアプタマー配列３２１を含み、該第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２を用いて後述するローリングサークル増幅（RCA）法によって標的分子３７に基づく核酸増幅反応ができるものであれば、それらの態様は制限されない。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２が、その５’末端を介して、担体と結合している場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２の５’末端、および担体については、第一の態様における第一の形態で説明したのと同様である。
第１のアプタマー配列３２１は、上記のような標的分子３７と結合する配列である。第１のアプタマー配列３２１は標的分子３７のアプタマー配列として公知の配列（例えば、Nucleic Acids Res (2004) 32 (suppl_1): D95-D100.に記載のアプタマーデータベースに記載の配列）を使用してもよいし、ＳＥＬＥＸ（Stoltenburg, R.ら、(2007), Biomolecular Engineering 24、381～403頁；Tuerk, C.ら、Science 249、505～510頁；Bock, L. C.ら、(1992)、Nature 355、564～566頁）または非ＳＥＬＥＸ（Berezovski, M.ら(2006)、Journal of the American Chemical Society 128、1410～1411頁）を用いて選択された配列を使用してもよい。
標的分子３７に結合する2種類のアプタマー配列を第1のアプタマー配列３２１および後述する第2のアプタマー配列３１２として使用すればよい。
また、第1のアプタマー配列３２１および後述する第2のアプタマー配列３１２は2種類別々に選択されてもよいが、ステムループ構造やバルジループ構造などを形成して2ヵ所で標的分子に結合するアプタマー配列をループ部分で切断して得られるスプリットアプタマーを第１のアプタマー配列３２１および第２のアプタマー配列３１２として使用してもよい。
＜キャプチャーオリゴヌクレオチド＞
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含む。キャプチャーオリゴヌクレオチドの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性やアプタマーの結合特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図１０で説明すると、キャプチャーオリゴヌクレオチド３１は、第１一本鎖環状DNA３０の第２の領域３０２に相補的な配列３１１と、その３'側に連結された前記標的分子３７に結合する第２のアプタマー配列３１２とを含む。
第２の領域３０２に相補的な配列３１１および第２のアプタマー配列３１２の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。
なお、第２のアプタマー配列３１２から非特異的な伸長反応が進行しないようにするために第２のアプタマー配列３１２の３’末端はリン酸基などで修飾されていることが好ましい。
キャプチャーオリゴヌクレオチド３１は、その５’末端を介して、担体と結合していてもよい。
その場合、キャプチャーオリゴヌクレオチド３１、その５’末端、および担体のいずれについても、キャプチャーオリゴヌクレオチド３１が、その５’末端を介して、担体と結合でき、標的分子３７に結合する第２のアプタマー配列３１２を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２を用いて後述するローリングサークル増幅（RCA）法によって標的分子３７に基づく核酸増幅反応ができるものであれば、それらの態様は制限されない。
キャプチャーオリゴヌクレオチド３１が、その５’末端を介して、担体と結合している場合、キャプチャーオリゴヌクレオチド３１の５’末端、および担体については、第一の態様における第一の形態で説明したのと同様である。
＜第２一本鎖環状DNA＞
第２一本鎖環状DNA３４は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配
列３０３と同一の配列３４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列３４２と、
を含む。
配列３０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列３４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA３４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２一本鎖環状DNA３４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
第２一本鎖環状DNA２４は、検出用試薬結合配列に相補的な配列を含むことが好ましい。検出試薬結合配列については、第一の態様における第一の形態で説明したのと同様である。
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３の５’側に隣接した領域３０４と同一の配列３５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNA３４の第２のプライマー結合配列３４２に相補的な配列３５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、を含む。第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５の配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５は、その５’末端を介して、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２が結合している前記担体と結合している。
第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５、その５’末端、および担体のいずれの態様についても、第一の態様における第一の形態で説明したのと同様である。
＜増幅方法＞
図１０に示されるように、標的分子３７が存在すると、標的分子３７と、キャプチャーオリゴヌクレオチド３１と、第１一本鎖環状DNA３０と、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２との４者複合体が形成され、その結果、ローリングサークル増幅（RCA）法によって核酸増幅反応が行われる。反応条件等は第一の態様における第一の形態と同様である。RCAによって、標的分子３７依存的に、第１のオリゴヌクレオチドプライマー３２から第１一本鎖環状DNA３０に沿って第１増幅産物３３が増幅される。
第１増幅産物３３は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３に相補的な配列３３１を含むため、この配列３０３と同一の配列３４１を含む第２一本鎖環状DNA３４は、第１の増幅産物３３の配列３３１に、配列３４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物３３と、第２一本鎖環状DNA３４の複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３の５’側に隣接した領域３０４と同一の配列３５１を有するので、第１の増幅産物３３の、第１一本鎖環状DNA３０の領域３０４に相補的な領域３３２に、配列３５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５は、配列３５１の３’側に、第２一本鎖環状DNA３４の第２のプライマー結合配列３４２に相補的な配列３５２を有するので、第２一本鎖環状DNA３４にも配列３５２を介してハイブリダイズする。
この第１の増幅産物３３と、第２一本鎖環状DNA３４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー３５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物３６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物３６は、例えば、グアニン四重鎖を含む配列３６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬３８によって検出される。第１の増幅産物３３に含まれる領域３３１のそれぞれに第２一本鎖環状DNA３４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
標的分子が存在すると、標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１一本鎖環状DNAと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーとの４者複合体が形成され、その結果、増幅反応が起こり、増幅産物が検出されるが、標的分子が存在しないときは増幅反応が起こらず、増幅産物が検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的分子が検出及び定量できる。
＜検出試薬＞
上記の通り、検出試薬結合配列と検出試薬の組み合わせは任意に決定でき、アプタマー配列とアプタマー結合性発色分子の組み合わせ、分子ビーコン結合配列と分子ビーコンの組み合わせ、特異的配列とそれにハイブリダイズする標識プローブの組み合わせなどを用いることもできるが、好ましくはグアニン四重鎖とグアニン四重鎖結合試薬の組み合わせである。グアニン四重鎖結合試薬としては、第一の態様における第一の形態に記載した試薬が挙げられる。
本発明の他の態様は、前記標的分子の検出キットである。
前記標的分子の検出キットは、上述したような、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットである。
第２一本鎖環状DNAは、グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含んでもよい。
本発明の標的分子検出キットは、さらに、グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬を含んでもよい。
本発明の標的分子検出キットは、さらに、既に説明したクラウンエーテルや非イオン性界面活性剤を含んでもよい。
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（プライマー固定化ビーズの調製）
(a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー（P1）とビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1.25 μM)、P2 (5 μＭ)のP1・P2混合液を調製した。
プライマー（P1）のDNA配列は配列番号１の配列である。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
FGビーズ（FG beads streptavidin）をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。上記操作をさらに2回行った。
(c) 磁気ビーズにプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜きとった。上記P1・P2混合液4 μLを加えた。25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。上記操作をさらに2回行った。磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40μL加えてピペッティングした。上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
プライマー（P1・P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（1 分）。上清を除去した。SATIC試薬を18 μL加えて、さらにターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)もしくはノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)をそれぞれ2 μL (10,000, 1,000, 100 fM)加えた。37℃で2時間反応させた。
第１一本鎖環状DNA（cT1）のDNA配列は配列番号３の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)のRNA配列は配列番号５の配列である。
ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)のRNA配列は配列番号６の配列である。
（蛍光顕微鏡による観察）
スライドガラスに20 μL反応液をのせて、その上にカバーガラスを置いた。蛍光顕微鏡（キーエンスBZ-700）を用いて蛍光観察した（レンズ 60倍、撮影速度1/2.3秒、励起光波長（420 nm±30 nm）、カットフィルター波長480 nm）。
Figure 0007448239000017
（結果）
結果を図２に示す。ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)の濃度が10 fMである場合でも検出することができた。後述する比較例１の場合よりも高感度に検出することができた。一方で、ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39 mer)では蛍光は確認されなかった。
〔実施例２〕<ビーズへの固定量比の検討>
（プライマー固定化ビーズの調製）
(a) ビオチン化プライマーの調製
表２に記載した濃度のビオチン化プライマーP1・P2混合液を調製した。ビオチン化プライマーは1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解した。
Figure 0007448239000018
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記P1・P2混合液（ア～キ）4 μLをそれぞれ加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)を用いなかったこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例１と同様にした。
Figure 0007448239000019
Figure 0007448239000020
（結果）
結果を図３－１、図３－２に示す。条件AにおいてターゲットRNAであるCidR_40 (40mer)を1 aMの低濃度で検出することができた。また、条件Bにおいては、ターゲットRNAであるCidR_40 (40mer)を10 aMの濃度で検出することができた。
〔実施例３〕<テンプレートの濃度比の検討>
（プライマー固定化ビーズの調製）
実施例２の表４の条件Aを採用し、ビオチン化プライマーP1・P2混合液を用いて調製したプライマー固定化FGビーズを反応に用いた。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)を用いなかったこと、また、追加でターゲットRNAであるCidR_1298 (全長)、ノンターゲットRNAであるArfR_2642 (全長)を用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
ターゲットRNAであるCidR_1298 (全長)のRNA配列は配列番号７の配列である。
ノンターゲットRNAであるArfR_2642 (全長)のRNA配列は配列番号８の配列である。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例１と同様にした。
Figure 0007448239000021
Figure 0007448239000022
（結果）
結果を図４－１、図４－２、図４－３に示す。条件Hの場合に最も強い蛍光が観察された。条件H, I, Jでは、cT2の濃度が400 nMのとき、cT1の濃度が1～100 nMで変化しても、ターゲットRNAであるCidR_40 (40mer)を1a Mの低濃度で検出することができた。
また、図５に示すように、条件Hでは、ターゲットRNAであるCidR_1298 (全長)とノンターゲットRNAであるArfR_2642 (全長)を識別することができた。
溶液中で反応を行う従来のSATIC法では、検出限界が1 pMであったところ、本方法では、条件Hを用いることで、1 aMのターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)を検出することができた。つまり、本方法の検出感度は、従来法のそれの100万倍向上した方法であるといえる。
〔比較例１〕
（プライマー固定化ビーズの調製）
(a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、5μＭの溶液を調製した。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、4 μLの5 μMビオチン化プライマー（P2）を加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
プライマー（P2）固定化FGビーズを2 μLすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例１と同様にした。
Figure 0007448239000023
（結果）
結果を図６に示す。ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)の濃度が10,000 fMである場合に蛍光が確認された。一方で、ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39 mer)では蛍光は確認されなかった。
〔比較例２〕
（プライマー固定化ビーズの調製）
(a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー（P1）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、1. 25 μＭの溶液を調製した。また、ビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、5 μＭの溶液を調製した。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、4 μLの1.25 μMビオチン化プライマー（P１）を加えたもの、4 μLの5 μMビオチン化プライマー（P２）を加えたものを用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
プライマー（P1）固定化FGビーズ2 μLとプライマー（P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例１と同様にした。
Figure 0007448239000024
（結果）
結果を図７に示す。ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)の濃度が100,000 fMである場合に蛍光が確認された。一方で、ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39 mer)では蛍光は確認されなかった。比較例１よりも検出感度が悪かった。
〔参考例１〕<検出系の検量線の作成>
（プライマー固定化ビーズの調製）
実施例２の表４の条件Aを採用し、ビオチン化プライマーP1・P2混合液を用いて調製したプライマー固定化FGビーズを反応に用いた。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
ターゲットRNA (40 mer)もしくはノンターゲットRNA (39mer)、または、ターゲットRNA (全長)もしくはノンターゲットRNA (全長)を、それぞれ2 μL (10,000, 1,000, 100, 10 aM)用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
96穴プレート（V底プレート:IWAKI MICROPLATE 3420-096）に3 μL反応液をのせて、磁石を用いてビーズを収集した。蛍光顕微鏡（キーエンス BZ-700）を用いて蛍光観察した（レンズ 4倍、撮影速度 1/8.5秒、励起光波長（420 nm±30 nm）、カットフィルター波長480 nm）。
Figure 0007448239000025
（結果）
結果を図８－１、図８－２、図８－３（A）、図８－３（B）に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。すなわち、ターゲットRNA (40mer)とターゲットRNA (全長)を用いて1 aM～1,000 aMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができるようになった。
〔実施例４〕
（プライマー固定化ビーズの調製）
実施例２の表４の条件Aを採用し、ビオチン化プライマーP1・P2混合液を用いて調製したプライマー固定化FGビーズを反応に用いた。
（プライマー固定化ビーズを用いた反応）
ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)もしくはノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)ではなく、ターゲット二重鎖DNA (40 bp)であるCidD_40（配列番号９）もしくはターゲット二重鎖DNA (全長)であるCidD_1298（配列番号１０）、又はノンターゲット二重鎖DNA (39 bp)であるArfD_39（配列番号１１）もしくはノンターゲット二重鎖DNA (全長)であるArfD_2642（配列番号１２）をそれぞれ2 μL (10,000, 1,000, 100, 10 aM)用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
第１一本鎖環状DNA（cT1-9bp）のDNA配列は配列番号１３の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
（蛍光顕微鏡による観察）
96穴プレート（V底プレート: IWAKI MICROPLATE 3420-096）に3 μL反応液をのせて、磁石を用いてビーズを収集した。蛍光顕微鏡（キーエンス BZ-700）を用いて蛍光観察した（レンズ 4倍、撮影速度 1/8.5秒、励起光波長（420 nm±30 nm）、カットフィルター波長480 nm）。
Figure 0007448239000026
（結果）
結果を図９－１に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。ターゲット二重鎖DNA（40 bp）であるCidD_40又はターゲット二重鎖DNA（全長）であるCidD_1298では1 aM～1,000 aMの範囲で蛍光が確認できた。一方で、ノンターゲット二重鎖（39 bp）であるArfD_39又はノンターゲット二重鎖DNA（全長）であるArfD_2642では蛍光は確認されなかった。
〔参考例２〕
実施例４の結果に基づいて、検出系の検量線を作成した。
（結果）
結果を図９－２に示す。1 aM～1,000 aMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができた。
〔実施例５〕
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズの調製）
(a) ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチドとビオチン化プライマーの調製
ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-mir-21ca）とビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、CS-mir-21ca（1 μM）、P2（20 μM）のCS-mir-21ca・P2混合液を調製した。
キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-mir-21ca）のDNA配列は配列番号１４の配列である。3’末端はリン酸化されている。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにキャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記CS-mir-21ca・P2混合液4 μLを加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを用いた反応）
CS-mir-21ca・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、ターゲットであるmiR-21CA（配列番号１５）、又はノンターゲットであるmiR-21（配列番号１６）若しくはmiR-221（配列番号１７）をそれぞれ2 μL（10 nM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
第１一本鎖環状DNA（cT1-mir-21ca）のDNA配列は配列番号１８の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
プライマー（P1-thr）のDNA配列は配列番号１９の配列である。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000027
（結果）
結果を図１１－１に示す。ターゲットであるmiR-21CAを用いた場合には蛍光が確認されたが、ノンターゲットであるmiR-21又はmiR-221を用いた場合には蛍光は確認されなかった。すなわち、ターゲットであるmiR-21CAの存在を特異的に検出することができた。
〔参考例３〕
実施例５と同様にして、キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを調製した。また、それとは別途、下記のプライマー固定化ビーズを調製した。
（プライマー固定化ビーズの調製）
(a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、20 μMのP2溶液を調製した。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記P2溶液4 μLを加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを、又はプライマー固定化ビーズを用いた反応）
CS-mir-21ca・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μL、又はプライマー（P2）固定化FGビーズを2 μLすくいとり、ターゲットであるmiR-21CAを、2 μL（1, 10, 100, 1000 fM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例５と同様にした。
Figure 0007448239000028
（結果）
結果を図１１－２、図１１－３に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。
CS-mir-21ca・プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、ターゲットであるmiR-21CAについて濃度0.1 fM～100 fMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができた。
一方、プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、上記同様にターゲットであるmiR-21CAについて濃度0.1 fM～100 fMで反応させたが、蛍光を確認できなかった。
キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定したビーズを用いることにより、ビーズ近傍で１段目の反応が起き、1段目の反応伸長物がビーズ近傍に存在しやすい状態となったと推察される（P2だけ固定化した場合では、溶液中で1段目の反応が進むため、ビーズ近傍に1段目の反応伸長物が集まりにくいと考えられる。）。そのため、1段目の反応伸長物を固定しなくても２段目の反応がより進みやすくなったと考えられる。また、ビーズを用いない従来法（すなわち溶液系）の場合の500 fMよりも高感度（約5000倍向上）に検出できた。
〔実施例６〕
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズの調製）
(a) ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチドとビオチン化プライマーの調製
ビオチン化キャプチャーヌクレオチド（CS-mir-13b）とビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、CS-mir-13b（1 μM）、P2（20 μM）のCS-mir-13b・P2混合液を調製した。
キャプチャーヌクレオチド（CS-mir-13b）のDNA配列は配列番号２０の配列である。3’末端はリン酸化されている。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにキャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記CS-mir-13b・P2混合液4 μLを加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを用いた反応）
CS-mir-13b・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、ターゲットであるmiR-13b（配列番号２１）、又はノンターゲットであるmiR-13a（配列番号２２）若しくはmiR-221（配列番号１７）をそれぞれ2 μL（10 nM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
第１一本鎖環状DNA（cT1-mir-13b）のDNA配列は配列番号２３の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000029
（結果）
結果を図１２－１に示す。ターゲットであるmiR-13bを用いた場合には蛍光が確認されたが、ノンターゲットであるmiR-13a又はmiR-221を用いた場合には蛍光は確認されなかった。尚、miR-13bの塩基配列は、miR-13aの塩基配列と１塩基のみ相違するものである。すなわち、１塩基の相違まで含めて、ターゲットであるmiR-13bの存在を特異的に検出することができた。
〔参考例４〕
実施例６と同様にして、キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを調製した。また、参考例３と同様にして、プライマー（P2）固定化ビーズを調製した。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを、又はプライマー固定化ビーズを用いた反応）
CS-mir-13b・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μL、又はプライマー（P2）固定化FGビーズを2 μLすくいとり、ターゲットであるmiR-13bを、2 μL (1, 10, 100, 1000 fM) 用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000030
（結果）
結果を図１２－２、図１２－３に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。
CS- mir-13b・プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、ターゲットであるmiR-13bについて濃度0.1 fM～100 fMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができた。一方、プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、上記同様にターゲットであるmiR-13bについて濃度0.1 fM～100 fMで反応させたが、蛍光を確認できなかった。
キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定したビーズを用いることにより、ビーズ近傍で１段目の反応が起き、1段目の反応伸長物がビーズ近傍に存在しやすい状態となったと推察される（P2だけ固定化した場合では、溶液中で1段目の反応が進むため、ビーズ近傍に1段目の反応伸長物が集まりにくいと考えられる。）。そのため、1段目の反応伸長物を固定しなくても２段目の反応がより進みやすくなったと考えられる。また、ビーズを用いない従来法（すなわち溶液系）の場合の100 fMよりも高感度（約1000倍向上）に検出できた。
〔実施例７〕
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズの調製）
(a) ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチドとビオチン化プライマーの調製
ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-thr）とビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、CS-thr（1 μM）、P2（20 μM）のCS-thr・P2混合液を調製した。
キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-thr）のDNA配列は配列番号２４の配列である。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにキャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック（磁石のついたチューブたて）にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記CS-thr・P2混合液4 μLを加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを用いた反応）
CS-thr・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、ターゲットであるトロンビン、又はノンターゲットとしてリゾチーム、レクチン若しくはストレプトアビジンをそれぞれ2 μL（10 nM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
第１一本鎖環状DNA（cT1-thr）のDNA配列は配列番号２５の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
プライマー（P1-thr）のDNA配列は配列番号１９の配列である。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000031
（結果）
結果を図１３－１に示す。ターゲットであるトロンビンを用いた場合には蛍光が確認されたが、ノンターゲットであるリゾチーム、レクチン、又はストレプトアビジンを用いた場合には蛍光は確認されなかった。すなわち、ターゲットであるトロンビンの存在を特異的に検出することができた。
〔参考例５〕
実施例７と同様にして、キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを調製した。また、参考例３と同様にして、プライマー（P2）固定化ビーズを調製した。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを、又はプライマー固定化ビーズを用いた反応）
CS-thr・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μL、又はプライマー（P2）固定化FGビーズを2 μLすくいとり、ターゲットであるトロンビンを、それぞれ2 μL（10, 100, 1000, 10000 fM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000032
（結果）
結果を図１３－２、図１３－３に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。
CS-thr・プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、ターゲットであるトロンビンについて濃度1 fM～1000 fMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができた。
一方、プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、上記同様にターゲットであるトロンビンについて濃度1 fM～1000 fMで反応させたが、蛍光を確認できなかった。
キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定したビーズを用いることにより、ビーズ近傍で１段目の反応が起き、P1伸長物がビーズ近傍に存在しやすい状態となったと推察される（P2だけ固定化した場合では、溶液中で1段目の反応が進むため、ビーズ近傍にP1伸長物が集まりにくいと考えられる。）。そのため、P1を固定しなくても２段目の反応がより進みやすくなったと考えられる。また、ビーズを用いない従来法（すなわち溶液系）の場合の50 pMよりも高感度（約5万倍向上）に検出できた。
〔実施例８〕
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズの調製）
(a) ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチドとビオチン化プライマーの調製
ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-str）とビオチン化プライマー（P2）を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、CS-str（1 μM）、P2（20 μM）のCS-str・P2混合液を調製した。
キャプチャーオリゴヌクレオチド（CS-str）のDNA配列は配列番号２６の配列である。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
(b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
実施例１と同様にした。
(c) 磁気ビーズにキャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離し（5 分）、上清を抜きとった後において、上記CS-str・P2混合液4 μLを加えたこと以外は、実施例１と同様にした。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを用いた反応）
CS-str・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、ターゲットであるストレプトマイシン、又はノンターゲットであるアンピシリン若しくはカナマイシンをそれぞれ2 μL（10 μM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
第１一本鎖環状DNA（cT1-thr）のDNA配列は配列番号２５の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
プライマー（P1-str）のDNA配列は配列番号２７の配列である。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000033
（結果）
結果を図１４－１に示す。ターゲットであるストレプトマイシンを用いた場合には蛍光が確認されたが、ノンターゲットであるアンピシリン又はカナマイシンを用いた場合には蛍光は確認されなかった。すなわち、ターゲットであるストレプトマイシンの存在を特異的に検出することができた。
〔参考例６〕
実施例８と同様にして、キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを調製した。また、参考例３と同様にして、プライマー（P2）固定化ビーズを調製した。
（キャプチャーオリゴヌクレオチドとプライマーとを固定化したビーズを、又はプライマー固定化ビーズを用いた反応）
CS-str・プライマー（P2）固定化FGビーズ2 μL、又はプライマー（P2）固定化FGビーズを2 μLすくいとり、ターゲットであるストレプトマイシンを、それぞれ2 μL（0.1, 1, 10, 100 nM）用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
（蛍光顕微鏡による観察）
実施例４と同様にした。
Figure 0007448239000034
（結果）
結果を図１４－２、図１４－３に示す。ビーズを収集することにより蛍光強度を定量的に測定可能となった。
CS-str・プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、ターゲットであるストレプトマイシンについて濃度0.01 nM～10 nMの範囲で検量線を作成することができ、定量分析ができた。
一方、プライマー（P2）固定化FGビーズを用いた場合、上記同様にターゲットであるストレプトマイシンについて濃度0.01 nM～10 nMで反応させたが、蛍光を確認できなかった。キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定したビーズを用いることにより、ビーズ近傍で１段目の反応が起き、P1伸長物がビーズ近傍に存在しやすい状態となったと推察される（P2だけ固定化した場合では、溶液中で1段目の反応が進むため、ビーズ近傍にP1伸長物が集まりにくいと考えられる。）。そのため、P1を固定しなくても２段目の反応がより進みやすくなったと考えられる。また、ビーズを用いない従来法（すなわち溶液系）の場合の75 nMよりも高感度（約7500倍向上）に検出できた。
〔実施例９〕
（蛍光色素の調製）
マカライトグリーンを蒸留水に溶解し、200 μMの溶液を調製した。
（溶液系での反応）
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)、又はノンターゲットRNAであるArfR_39 (39 mer)をそれぞれ2 μL (10 nM)加え、37 ℃で2時間反応させた。
尚、コントロールとして水を用いた。また、リファレンスとして二重鎖DNA（40 bp, 1 μM、ただしSATIC反応は行なっていない。）を用いた。
プライマー（P1）のDNA配列は配列番号１の配列である。
プライマー（P2）のDNA配列は配列番号２の配列である。
第１一本鎖環状DNA（cT1）のDNA配列は配列番号３の配列であり、両端で結合して環状化している。
第２一本鎖環状DNA（cT2）のDNA配列は配列番号４の配列であり、両端で結合して環状化している。
ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)のRNA配列は配列番号５の配列である。
ノンターゲットRNAであるArfR_39 (39mer)のRNA配列は配列番号６の配列である。
（蛍光分光光度計による測定）
蛍光測定用セルに70 μLの反応液を入れて蛍光分光光度計を用いて測定を行った。励起波長590 nm、測定波長630 nm～800 nmの条件で測定した。
Figure 0007448239000035
（結果）
結果を図１５に示す。ターゲットRNAであるCidR_40 (40 mer)の場合には、蛍光強度が増大した。励起波長が生体成分由来の光吸収の少ない600 nm付近であるため、生体成分から直接検出できる可能性がある。
ThT-HE以外のグアニン四重鎖結合試薬でも本検出系に利用することができることが確認された。
［実施例１０］各ThT誘導体の凝集促進剤としての効果
1)プライマー固定化金コロイドの調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 ｍM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) 金コロイドにプライマーを固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化金コロイドと凝集剤を用いた反応
P1・P2金コロイド(2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。SATIC試薬14 μLを加えて、さらにターゲット(40mer CIDEC :10 pM)を2μL加えた。
凝集剤としてThT-HE, ThT-PEG（R5=NH2、n=11）, ThT-スペルミン, ThTをそれぞれ2 μLを加えた。
37℃で2時間反応させた。
なお、プライマーP1、P2、cT1、cT2は上述のものを用いた。
また、ターゲットRNAはCidR_40を用い、オフターゲットRNAはArfR_39を用いた。
Figure 0007448239000036
3) 目視による観察
金コロイドの変化を目視で観察した。
結果を図１８に示す。
各ThT誘導体を加えたところThT-PEG(化合物2)を加えた時のみ、凝集体を確認した。
［実施例１１］金コロイドの粒径の検討
1)プライマー固定化金コロイドの調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(10, 15, 30 nm)をよくボルテックスし、10 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) 金コロイドにプライマーを固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドに上記P1・P2混合溶液2 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
2)目視の観察
金コロイドの変化を目視で観察した。
結果を図１９に示す。
粒径が10nm 以下では、Primer を金コロイドに結合しただけで凝集した。
［実施例１２]金コロイドの粒径の検討(続)
1)プライマー固定化金コロイドの調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(15, 30, 40, 60 nm)をよくボルテックスし、10 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) 金コロイドにプライマーを固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドに上記P1・P2混合溶液2 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化金コロイドと凝集剤を用いた反応
P1・P2金コロイド(2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。SATIC試薬16 μLを加えて、さらにターゲット(40 mer CIDEC：10 pM)2μLを加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000037
3) 目視による観察
金コロイドの変化を目視で観察した。
結果を図２０に示す。
各粒径の金コロイドにP1およびP2を結合させてSATIC反応を行ったところ、粒径 30 nm以上において凝集を確認した。
［実施例１３］ポリエチレングリコール(PEG)添加による凝集効果
1)プライマー固定化金コロイドの調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) 金コロイドにプライマーを固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化金コロイドと凝集剤を用いた反応
P1・P2金コロイド(2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。SATIC試薬12μLを加えて、さらにターゲット(40 mer CIDEC：10 pM)2μLを加えた。
PEG200, 6000, 8000の各種溶液を4μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000038
3) 目視による観察
金コロイドの変化を目視で観察した。
結果を図２１に示す。
各種PEG を加えて SATIC 反応を行っても、凝集は見られないことが確認された。つまりPEG の添加による凝集効果はないことが確認できた。
［実施例１４］検出感度の検討
1)プライマー固定化金コロイドの調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) 磁気ビーズの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、40 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) 金コロイドにプライマーを固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化金コロイドと凝集剤を用いた反応
P1・P2金コロイド(2μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
SATIC試薬16μLを加えて、さらにターゲット (40 mer CIDEC：10aM～10 pM)2μLを加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000039
3) 目視による観察
金コロイドの変化を目視で観察した。
結果を図２２に示す。
濃度10aM (120 copies/ tube)の40merのターゲットRNAを目視で検出できた。
［実施例１５］各ThT誘導体の凝集促進剤としての効果 (ナノ粒子：FGビーズ 粒径：180nm)
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬16 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
ThT-HE, ThT-PEG, ThT-スペルミン, ThTをそれぞれ2 μLを加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000040
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２３に示す。
各ThT誘導体を加えたところThT-PEG(化合物2)を加えた時のみ、凝集体を確認した。また、図２４に示すように、この凝集はターゲットのみに対して特異的に生じることが確認された。
［実施例１６］検出特異性および検出感度の検証
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000041
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２５に示す。
40merのターゲットを、10aM (120 copies/ tube)の濃度で目視で検出できた。
［実施例１７］凝集剤に修飾金コロイドを用いる検出系
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)修飾金コロイドの調製
a) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
b) 金コロイドにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)を固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドにThT-ビオチン(100μM)・PEG-ビオチン(100μM)の混合溶液2 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2-2-3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬16 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
凝集剤として修飾金コロイドを2μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000042
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２６に示す。
化合物3と4が同時に固定化された金コロイドを凝集剤として使用したSATIC反応は、ターゲット（CIDEC40mer）の存在下でのみ特異的に凝集を生じる。
［実施例１８］化合物 3 と 4 の金コロイドへの固定化率の最適化
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)修飾金コロイドの調製
a) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
b) 金コロイドにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)を固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドにThT-ビオチン(化合物3：100μM)・PEG-ビオチン(化合物4：100μM)の混合溶液2 μLを加えた。このとき、化合物3が0, 10, 30, 50, 70, 90, 100％になるように混合液を調製した。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬16 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40 mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
凝集剤として修飾金コロイドを2μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000043
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２７に示す。
化合物3と化合物4の固定化比率が30:70から90:10の金コロイドを、SATIC反応に用いると凝集を生じることが確認された。
［実施例１９］検出特異性および検出感度の検証
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)修飾金コロイドの調製
a) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
b) 金コロイドにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)を固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドにThT-ビオチン(化合物3：100μM)・PEG-ビオチン(化合物4：100μM)の混合溶液2 μLを加えた。このとき、化合物3の割合が50％になるように調製した。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18μLを加えて、さらにターゲットRNA(40 mer CIDEC：10aM～10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10a～10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000044
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２８に示す。
1aM (12 copies/tube)の濃度の40merのターゲット(CIDEC)を目視で検出できた。
［実施例２０］検出特異性および検出感度の検証(続)
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)修飾金コロイドの調製
a) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。：10μM)・PEG-ビオチン(化合物4)を固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドにThT-ビオチン(化合物3：100μM)・PEG-ビオチン(化合物4：100μM)の混合溶液2μLを加えた。このとき、化合物3の割合が50％になるように調製した。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18μLを加えて、さらにターゲットRNA(全長CIDEC：10aM～10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(全長Arf：10a～10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000045
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図２９に示す。
1aM (12 copies/tube)の濃度の全長のターゲット(CIDEC)を目視で検出できた。
［実施例２１］化合物 3 と 4 のストレプトアビジンへの修飾率の最適化
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)化合物3と4結合ストレプトアビジンの調製
a) ストレプトアビジンの調製
1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解したストレプトアビジン溶液(400 μM)を調製した。
b) ストレプトアビジンにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)の固定化
ストレプトアビジン溶液50μLにThT-ビオチン(化合物3：0～400μM)・PEG-ビオチン(化合物4：0～400)の混合溶液50 μLを加えた。そのとき、化合物3が0, 25, 50, 75, 100%になるように混合溶液を調製した。
25℃、30分間インキュベーションした。
3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬14μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(40mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
修飾ストレプトアビジン 4μLを加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000046
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３０に示す。
化合物3と化合物4の修飾率が50:50から25:75のストレプトアビジン複合体を、SATIC反応に用いると凝集を生じることが確認された。
［実施例２２］検出特異性および検出感度の検証 (凝集剤：修飾ストレプトアビジン)
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)化合物3と4結合ストレプトアビジンの調製
a) ストレプトアビジンの調製
1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解したストレプトアビジン溶液(400 μM)を調製した。
b) ストレプトアビジンにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)の固定化
ストレプトアビジン溶液50μLにThT-ビオチン(化合物3：200μM)・PEG-ビオチン(化合物4：200μM)の混合溶液50 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。
3-3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾ストレプトアビジン)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM～10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(40mer Arf：10aM～10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000047
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３１に示す。
100aM (1200 copies/tube)の濃度の40merのターゲットを目視で検出できた。
［実施例２３］化合物5（ThT-PEG-ThT、ｎ=11）の凝集促進剤としての効果
1) プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000048
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３２に示す。
ThT-PEG-ThTを凝集剤としたとき、ターゲット特異的に目視で検出することができた。
［実施例２４］検出特異性および検出感度の検証 (ThT-PEG-ThT化合物5)
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM～10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(39 mer Arf：10aM～10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000049
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３３に示す。
濃度1aM (12copies/tube)の40merターゲットを目視で検出できた。
［実施例２５］検出特異性および検出感度の検証 (続) (ThT-PEG-ThT化合物5)
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(全長CIDEC：10aM～10pM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(全長 Arf：10aM～10pM) を2 μL加えた。
37℃で2時間反応させた。
Figure 0007448239000050
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３４に示す。
濃度1aM (12copies/tube)の全長mRNAターゲットを目視で検出できた。
［実施例２６］混合した凝集剤の効果
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2)修飾金コロイドの調製
a) 金コロイドの使用前の準備・洗浄
金コロイド(30 nm)をよくボルテックスし、20 μLすくいとり、0.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
b) 金コロイドにThT-ビオチン(化合物3)・PEG-ビオチン(化合物4)を固定化・洗浄
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜きとった。
洗浄した金コロイドにThT-ビオチン(100μM)・PEG-ビオチン(100μM)の混合溶液2 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
遠心分離機で遠心分離し、金コロイドと上清を分離した。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを20 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
3) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤(修飾金コロイド)を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬14 μLを加えて、さらにターゲットRNA(全長CIDEC：10aM) を2 μL加えた。もしくはオフターゲットRNA(全長 Arf：10aM) を2 μL加えた。
凝集剤として化合物3, 化合物5, 修飾金コロイドの混合液を6μL加えた。なお、凝集剤１つの場合は水を４μL、凝集剤2つの場合は水2μLを加えた。
37℃で1時間反応させた。
Figure 0007448239000051
4) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。また、時間経過を観察した。
結果を図３５に示す。
凝集剤7を反応液に含む場合、1aM (12copies/tube)の全長のターゲット5分程度で目視により検出できた。
［合成例］
ThT誘導体の合成
以下のスキームに従ってThT-ビオチンおよびThT-PEG-ThTを合成した。なお、ThT-PEGおよびThT-AEの合成法は参考文献（Kataoka, Y.; Fujita, H.; Afanaseva, A.; Nagao, C.; Mizuguchi, K.; Kasahara, Y.; Obika, S.; Kuwahara, M. Biochemistry, 2019, 58, 493.）に記載の通りである。
Figure 0007448239000052
スキーム. ThT誘導体の合成
[ThT-ビオチンの合成]
ThT-PEG (33 mg, 35 μmol)にdry N,N-Dimethylformamide (DMF) (0.30 mL)を加えて撹拌し、そこにN-Succinimidyl D-biotinate (12 mg, 35 μmol)を加えて90℃で2時間撹拌した。反応混合物を減圧留去した後、HPLCを用いて精製することでThT-ビオチンを得た。収量 : 0.21 mg 収量 : 0.51%
1H NMR (500 MHz, Deuterium oxide) δ 8.01 (1H, d) 7.98 (1H, s) 7.76 (2H, d) 7.73 (1H, d) 6.97 (2H, d) 5.12 (2H, s) 4.58 (1H, q) 4.39 (1H, q) 3.87 (2H, s) 3.71 (2H, s) 3.68-3.66 (40H, m) 3.61 (3H, q) 4.41 (2H, t) 3.36 (2H, q) 3.29 (1H, q) 3. 20 (2H, q) 3.11 (6H, s) 3.04 (1H, q) 2.96 (1H, dd) 2.74 (1H, d) 2.57 (3H, s) 2.24 (2H, t) 1.72-1.49 (4H, m) 1.27 (2H, q); ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 1180.75, calculated for [M+] = 1180.59.
[化合物T1の合成]
ThT-AE (32 mg, 0.10 mmol)にdry Dichloromethane (CH2Cl2) (0.30 mL)を加えて撹拌し、そこにTriethylamine (TEA) (85 μL, 0.61 mmol)を加えた後にSuccinic anhydride (11 mg, 0.11 mmol)を加え、室温で30分撹拌した。反応混合物を減圧留去した後、残渣を水で懸濁させ、CH2Cl2で洗浄した。水層を減圧留去することで化合物T1を定量的に得た。ESI-MS (positive ion mode) m/z, found =412.15, calculated for [M+] =412.17.
[ThT-PEG-ThTの合成]
ThT-PEG (10 mg, 10 μmol)にdry DMF (0.3 mL)を加えて撹拌し、そこにHOBt・H2O (4. 2 mg, 26 μmol)、PyBOP (14 mg, 26 μmol)を加えた後にDIPEA (14 μL, 80 μmol)を加えた。そこに、dry DMF (0.2 mL)に溶解した化合物T1 (5.6 mg, 13 μmol)を加え、室温で5時間撹拌した。反応混合物を減圧留去した後、残渣をCH2Cl2で溶解し、水で洗浄した。有機層を減圧留去し、ジエチルエーテルで固液抽出した後にHPLCを用いて精製することでThT-PEG-ThTを得た。
収量 : 0.82 mg 収率 : 6.1%
1H NMR (500 MHz, Deuterium oxide) δ 8.01 (2H, d) 7.97 (2H, s) 7.75 (6H, t) 6.95 (4H, d) 5.12 (4H, t) 3.86 (4H, s) 3.68 (44H, q) 3.61 (4H, q) 3.42-3.35 (4H, m) 3.10 (12H, s) 2.65 (4H, t) 2.57 (3H, s) 2.54 (3H, t); ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 1348.51, calculated for [H+]= 1348.67.
［実施例２７］化合物5（ThT-PEG-ThT）と各種PEGの凝集促進剤としての効果（続）
1) プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM) を2 μL加えた。
37℃で20分反応させた。
Figure 0007448239000053
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３６に示す。
ThT-PEG-ThT・各種PEG 10w/v%を凝集剤とした本実施例では、PEG1000を添加した時に、凝集がおきた。
［実施例２８］化合物5（ThT-PEG-ThT）と各種PEGの凝集促進剤としての効果(PEG濃度検討)
1) プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM) を2 μL加えた。
37℃で20分反応させた。
Figure 0007448239000054
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３７に示す。
ThT-PEG-ThT・PEG1000 を凝集剤とした本実施例では、10～20w/v%添加した時、反応時間20分程度で凝集体ができた。
［実施例２９］SATIC反応へのクラウンエーテルとその塩濃度の効果
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化キャプチャープローブ(CS-thr)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、CS-thr (1 μM)、P2(20 μＭ)のCS-thr・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記CS-thr・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
CS-thr・プライマー(P2)固定化FGビーズ(2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲット(トロンビン)もしくはノンターゲット(ストレプトアビジン)をそれぞれ2 μL(1fM)加えた。
Figure 0007448239000055
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図３８に示す。
通常高濃度のナトリウムイオン存在下では、SATIC反応はほとんど進まない。一方、18-クラウン-6と15-クラウン-5を添加した場合、反応液中に150 mMのNaClが添加されていてもSATIC反応が進むことがわかった。
［実施例３０］界面活性剤の添加濃度の検討
1)プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子と凝集剤を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM) を2 μL加えた。
37℃で20間反応させた。
Figure 0007448239000056
3) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。また、時間経過を観察した。
結果を図３９に示す。
非イオン性界面活性剤は核酸やタンパク質の水和性や安定性向上に使用される。生体サンプルを安定的な状態で処理するとき添加されることがしばしばある。そこで代表的な界面活性剤がSATIC反応に及ぼす影響を調べたところ、Tween20では反応液中に1%程度まで、また、Nonidet P-40では0.5%程度まで許容されることがわかった。
［実施例３１］反応後の凝集の方法（温度の検討）
1) プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM) を2 μL加えた。
37℃で20分反応させた。
3) 反応後処理
反応後以下のいずれかの処理を行った。
１）反応溶液に磁石を適用してナノパーティクルを集積した。
２）チューブを揺らしてナノパーティクルを均一にした。
３）そのままの状態にした。
9-1-4) 冷却
上記の反応後処理をおこない以下のいずれかの温度に5分間静置した。
１）4℃
２）0℃
３）-21℃
４）25℃（室温）
5) 冷却後処理
冷却後以下のいずれかの処理を行った。
１）チューブを揺らしてナノパーティクルを均一にしたあと磁石で集積した。
２）冷却後そのまま磁石でナノパーティクルを集積した。
6）ArfRを入れたチューブのナノパーティクルが均一になるまでチューブを揺らした。
Figure 0007448239000057
下表中の１～２４は条件１～２４を示す。
Figure 0007448239000058
7) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図４０に示す。
冷却温度0℃および-21℃の条件（特に8と14の条件）で凝集が速やかに生じた。
［実施例３２］反応後の凝集の方法（時間の検討）
1) プライマー固定化ナノ粒子の調製
a) ビオチン化プライマーの調製
ビオチン化プライマー(P1)とビオチン化プライマー(P2)を1×φ29 DNA polymerase reaction bufferに溶解させ、P1 (1 μM)、P2(20 μＭ)のP1・P2混合溶液を調製した。
b) ナノ粒子の使用前の準備・洗浄
FGビーズ(FG beads streptavidin)をよくボルテックスし、均一な粒子になるまで撹拌し、4 μLすくいとり、1.5 mLのエッペンドルフ社製チューブに入れた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
c) ナノ粒子にプライマーを固定化・洗浄
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(5 分)。上清を抜きとった。
洗浄したFGビーズに上記P1・P2混合溶液4 μLを加えた。
25℃、30分間インキュベーションした。その際、5分おきにボルテックスを行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、1×φ29 DNA polymerase reaction bufferを40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した（5 分）。上清を抜き取り、水を40 μL加えてピペッティングした。
上記操作をさらに2回行った。これを使用するまで冷蔵保存した。
2) プライマー固定化ナノ粒子を用いた反応
P1・P2固定化FGビーズ2 μLをすくいとり、0.5 mL エッペンドルフ社製チューブに加えた。
磁気ラック(磁石のついたチューブたて)にチューブをセットして、磁気ビーズと上清を分離した(1 分)。上清を除去した。
SATIC試薬18 μLを加えて、さらにターゲットRNA(40mer CIDEC：10aM) を2 μL加えた。
37℃で20分反応させた。
3) 反応後処理
反応溶液に磁石を適用してナノパーティクルを集積した。
4) 冷却
上記の反応後処理をおこない以下のいずれかの温度に0、1、3、5、10分間静置した。
１）0℃（条件８）
２）-21℃（条件１４）
5) 冷却後処理
冷却後以下のいずれかの処理を行った。
１）チューブを揺らしてナノパーティクルを均一にしたあと磁石で集積した。
２）冷却後そのまま磁石でナノパーティクルを集積した。
6）ArfRを入れたチューブのナノパーティクルが均一になるまでチューブを揺らした。
Figure 0007448239000059
7) 目視による観察
ナノ粒子の変化を目視で観察した。
結果を図４１に示す。
冷却温度0℃の条件では冷却時間3分で凝集が生じ、また、-21℃の条件では冷却時間1分で凝集が生じた。このように冷却により凝集を早く観察できることが分かった。
２０・・・一本鎖環状DNA、２１・・・標的核酸、２２・・・第１オリゴヌクレオチドプ
ライマー、２３・・・第１増幅産物、２４・・・第２一本鎖環状DNA、２５・・・第２オ
リゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２増幅産物、２０１・・・第１の部位に相補的な配列、２０２・・・第１プライマー結合配列、２０３・・・第２一本鎖環状DNA結合
配列の相補配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した部位、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬、２１１・・・第１の部位、２１２・・・第２の部位、２２１・・・第２の部位に相補的な配列、２２２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列、２３１・・・、２０３の相補領域、２３２・・・部位２０４に相補的な領域、２３３・・・配列２０３に相補的な配列、２３４・・・第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的
な領域、２４１・・・第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列、２４
２・・・第２プライマー結合配列、２５１・・・部位２０４と同一の配列、２５２・・・第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列、２７・・・変異を
含む標的miRNA、２７１・・・第１の部位、２７２・・・第２の部位、２８・・・第１オ
リゴヌクレオチドプライマー、２８１・・・第２の部位に相補的な配列、２８２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列
３０・・・第１一本鎖環状DNA、３１・・・キャプチャーオリゴヌクレオチド、３２・・・第１のオリゴヌクレオチドプライマー、３３・・・第１の増幅産物（伸長鎖）、３４・・・第２一本鎖環状DNA、３５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、３６・・・第２の増幅産物（伸長鎖）、３７・・・標的分子、３８・・・グアニン四重鎖検出試薬、３０１・・・第１の領域（プライマー結合配列）、３０２・・・第２の領域、３０３・・・第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列、３０４・・・３０３の５’側に隣接した領域、３１１・・・第２の領域に相補的な配列、３１２・・・第２のアプタマー配列、３２１・・・第１のアプタマー配列、３２２・・・第１の領域に相補的な配列、３３１・・・３０３の相補領域、３３２・・・領域３０４に相補的な領域、３４１・・・第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列３０３と同一の配列、３４２・・・第２のプライマー結合配列、３４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、３５１・・・領域３０４と同一の配列、３５２・・・第２一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列３４２に相補的な配列、３６１・・・グアニン四重鎖を含む配列
４０・・・一本鎖環状DNA、４１・・・キャプチャーオリゴヌクレオチド、４２・・・miRNA、４３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、４４・・・第２の一本鎖環状DNA、４５・
・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、４６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、４７・・・グアニン四重鎖検出試薬、４０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、４
０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、４０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、４０４・・・４０３の５’側に隣接した領域、４１１・・・一本鎖環状DNAの第２
の領域に相補的な配列、４１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、４２１・・・miRNAの第１の領域、４２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、４３１・・・４０３の
相補領域、４３２・・・領域４０４に相補的な領域、４３３・・・配列４０３に相補的な配列、４３４・・・第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域、４４１・・
・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列４０３と同一の配列、４４２・・・第２のプラ
イマー結合配列、４４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、４５１・・・領域４０４と同一の配列、４５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列
４４２に相補的な配列、４６１・・・グアニン四重鎖形成配列

Claims (22)

  1. （i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
    該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
    第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
    を含む第１一本鎖環状DNAと、
    （ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
    ～８塩基の配列と、
    を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
    （iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
    該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
    を含む、第２一本鎖環状DNAと、
    （iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
    列と、
    を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
    を含み、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
    核酸検出用キット。
  2. 前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、アビジンが固定されている担体と結合しており、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端がビオチンで修飾されており、該ビオチンを介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
    請求項１に記載の核酸検出用キット。
  3. 前記担体に結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーと第２のオリゴヌクレオチドプライマーの割合がモル比で1:10～1:30である、
    請求項１または２に記載の核酸検出用キット。
  4. （v）検出用試薬を含み、
    前記第２一本鎖環状DNAが検出用試薬結合配列に相補的な配列を含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸検出用キット。
  5. 前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項４に記載の核酸検出用キット。
  6. グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項５に記載の核酸検出用キット。
  7. グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項５または６に記載の核酸検出用キット。
    Figure 0007448239000060
     Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
    Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１～５の炭化水素基を示し、
    nは０～５の整数を示し、
    ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
  8. 一般式（I）で表される化合物が下記式（II）または（III）で表される、請求項７に記載の核酸検出用キット。
    Figure 0007448239000061
    Figure 0007448239000062
  9. グアニン四重鎖結合試薬が下記の化合物である、請求項５または６に記載の核酸検出用キット。
    Figure 0007448239000063
     （R5はアミノ基、水酸基、アルキル基、またはカルボキシル基であり、ｎは４～５０の整数である。）
  10. グアニン四重鎖結合試薬が下記の化合物である、請求項５または６に記載の核酸検出用キット。
    Figure 0007448239000064
     （ｎは４～５０の整数である。）
  11. 前記化合物がポリエチレングリコール鎖とともに担体に固定化されている、請求項９または１０に記載の核酸検出用キット。
  12. クラウンエーテルを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸検出用キット。
  13. 前記クラウンエーテルが、18-クラウン-6または15-クラウン-5である、請求項１２に記載の核酸検出用キット。
  14. 非イオン性界面活性剤を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸検出用キット。
  15. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたはオクチルフェノールエトキシレートである、請求項１４に記載の核酸検出用キット。
  16. 標的核酸がウイルスRNAである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸検出用キット。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のキットを使用した標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記第１一本鎖環状DNAおよび前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、
    該第１のオリゴヌクレオチドプライマーからローリングサークル増幅によって標的核酸に基づく核酸増幅反応を行う工程、
    得られた増幅産物に、前記第２一本鎖環状DNAおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、
    該第２のオリゴヌクレオチドプライマーからローリングサークル増幅によって前記増幅産物に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
    増幅された核酸を検出する工程、
    を含む方法。
  18. 第１の領域と、第１の領域の３’側の変異を含む第２の領域を含む短鎖標的核酸、
    （i）短鎖標的核酸の第２の領域に相補的な短鎖標的核酸結合領域とその３’側の第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第１の一本鎖環状DNA、
    （ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と、短鎖標的核酸の第１の領域に相補的な短鎖標的核酸結合配列を含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
    （iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む第２の一本鎖環状DNA、
    （iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
    を含み、
    前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、その５’末端を介して、担体と結合しており、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが結合している前記担体と結合している、
    核酸検出用キット。
  19. 請求項１８に記載のキットを使用した短鎖標的核酸の検出方法であって、
    第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む短鎖標的核酸に、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、
    ローリングサークル増幅によって短鎖標的核酸とキャプチャーオリゴヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
    当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
    増幅された核酸を検出する工程、
    を含む方法。
  20. 第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
    補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
    標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
    第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
    第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
    第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
    オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
    前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
    標的分子の検出キット。
  21. 請求項２０に記載のキットを使用した標的分子の検出方法であって、
    標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
    ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
    当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
    ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
    増幅された核酸を検出する工程、
    を含む方法。
  22. 下記式で表される化合物。
    Figure 0007448239000065
     （ｎは４～５０の整数である。）
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