JP2010193884A - 小型化ハイスループット核酸分析 - Google Patents
小型化ハイスループット核酸分析 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010193884A JP2010193884A JP2010034500A JP2010034500A JP2010193884A JP 2010193884 A JP2010193884 A JP 2010193884A JP 2010034500 A JP2010034500 A JP 2010034500A JP 2010034500 A JP2010034500 A JP 2010034500A JP 2010193884 A JP2010193884 A JP 2010193884A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- beads
- amplification
- bead
- primer
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 87
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 259
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 141
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 97
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 65
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 54
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 44
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 34
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 33
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 8
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 175
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 104
- 239000000047 product Substances 0.000 description 65
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 39
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 37
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 36
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 12
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 11
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 229940043215 aminolevulinate Drugs 0.000 description 6
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 6
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2NC([N+](=O)[O-])=CC2=C1 HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical group O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091093094 Glycol nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 3-[[di(propan-2-yl)amino]-[6-[[(4-methoxyphenyl)-diphenylmethyl]amino]hexoxy]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(NCCCCCCOP(OCCC#N)N(C(C)C)C(C)C)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036364 Deoxyribonuclease IV (Phage T4-Induced) Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000577853 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Mlh1 Proteins 0.000 description 1
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Chemical group 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical group O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- VWQLXGMNLCGJRC-UHFFFAOYSA-N [3,3-dimethyl-2-(2-phenoxyacetyl)butanoyl] 3,3-dimethyl-2-(2-phenoxyacetyl)butanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OCC(=O)C(C(C)(C)C)C(=O)OC(=O)C(C(C)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 VWQLXGMNLCGJRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUQUNBOKLNVMMK-UHFFFAOYSA-N [5-[6-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxyhexylcarbamoyl]-6'-(2,2-dimethylpropanoyloxy)-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound C12=CC=C(OC(=O)C(C)(C)C)C=C2OC2=CC(OC(=O)C(C)(C)C)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)NCCCCCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N)=CC=C21 XUQUNBOKLNVMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical group 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003366 endpoint assay Methods 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 1
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- FDRPZJWMPZUHBN-UHFFFAOYSA-N triazin-2-ium;chloride Chemical group Cl.C1=CN=NN=C1 FDRPZJWMPZUHBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】a) 各ビーズが少なくとも1対の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに、前記プライマーの少なくとも1つが光切断可能なリンカーによってビーズに結合されることを特徴とする複数のビーズを提供する工程
b) 試料から目的の核酸分子を捕捉する工程
c) 前記複数のビーズをクローン的に単離する工程
d) 前記少なくとも1つのプライマーを光誘導切断する工程
e) 前記核酸をクローン的に増幅し、それにより多数の増幅産物を作製する工程
f) 前記増幅産物を分析する工程
を含む方法。
【選択図】なし
Description
近年、ピロリン酸配列決定に基づく超ハイスループット配列決定システムが開示され、それにより本質的に1週間以内での細菌のゲノムの配列決定が可能になった(特許文献1、特許文献2、非特許文献1)。せん断されたゲノムDNAから開始して、油中PCR反応混合物エマルジョン中に捕捉されたビーズに1分子断片が結合する。次いで、増幅により、それぞれのビーズが同じ断片の多コピーを有するクローン的に(clonally)増幅されたDNAのライブラリーがもたらされる。
アピラーゼの存在下で触媒される、PPi+アデノシン5'ホスホ硫酸(APS)→ATP
ルシフェラーゼの存在下で触媒される、ATP+ルシフェリン→光+オキシルシフェリン
オキシルシフェリンの発光の検出
のように検出されることを特徴とする。
-癌検出:過剰な野生型バックグラウンドにおける突然変異対立遺伝子の定量
-対立遺伝子不均衡の検出
-稀な転写物および/または転写物中の突然変異対立遺伝子の遺伝子発現
-ウイルスの検出および定量
などの分野においては、デジタル計数原理が非常に望ましい。
〔1〕a) 各ビーズが少なくとも1対の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに、前記プライマーの少なくとも1つが光切断可能なリンカーによってビーズに結合されることを特徴とする複数のビーズを提供する工程
b) 試料から目的の核酸分子を捕捉する工程
c) 前記複数のビーズをクローン的に単離する工程
d) 前記少なくとも1つのプライマーを光誘導切断する工程
e) 前記核酸をクローン的に増幅し、それにより多数の増幅産物を作製する工程
f) 前記増幅産物を分析する工程
を含む方法、
〔2〕工程c)が、エマルジョンの作製を含み、各ビーズが単一のミセル内に封入されている、〔1〕記載の方法、
〔3〕工程f)が、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内への前記複数のビーズの分配および前記増幅産物の検出を含む、〔2〕記載の方法、
〔4〕工程f)が、さらに、前記増幅産物の配列決定反応を含む、〔3〕記載の方法、
〔5〕前記配列決定反応が合成反応による配列決定である、〔4〕記載の方法、
〔6〕前記増幅産物の作製がモニターされる、〔3〕記載の方法、
〔7〕前記増幅産物が、特異的二本鎖DNA結合蛍光実体または配列特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される、〔6〕記載の方法、
〔8〕前記増幅産物が、温度勾配に供することにより分析される、〔7〕記載の方法、
〔9〕工程c)が、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内への前記複数のビーズの分配を含む、〔1〕記載の方法、
〔10〕工程e)およびf)がリアルタイムPCRによって同時に行なわれる、〔1〕記載の方法、
〔11〕切断可能なリンカーによってビーズに結合されている前記少なくとも1つのプライマーが検出可能なタグを有する、〔6〕〜〔10〕いずれか記載の方法、
〔12〕前記検出可能なタグが、質量タグ、色標識、e-タグおよび抗体によって検出可能なハプテンからなる群より選択される、〔11〕記載の方法、
〔13〕前記検出可能な標識が、好ましくは、前記標識されたプライマーが伸長されていない限り消光される蛍光標識であることを特徴とする、〔12〕記載の方法、
〔14〕切断可能なリンカーによってビーズに結合されている複数のプライマーの各メンバーが異なる検出可能なタグを有することを特徴とする、〔11〕〜〔13〕いずれか記載の方法、
〔15〕定量的変異分析のための〔4〕または〔5〕記載の方法の使用、
〔16〕遺伝子発現のモニタリングのための〔4〕または〔5〕記載の方法の使用、
〔17〕対立遺伝子特異的増幅を行なうことによる定量的変異分析のための〔6〕〜〔11〕いずれか記載の方法の使用、
〔18〕遺伝子発現のモニタリングのための〔6〕〜〔11〕いずれか記載の方法の使用、
〔19〕相対的または絶対的核酸定量のための〔6〕〜〔11〕いずれか記載の方法の使用、
〔20〕切断可能なリンカーによってビーズに結合されている複数のプライマーの各メンバーが異なる検出可能な標識を有することを特徴とする、〔17〕〜〔19〕いずれか記載の方法の使用
に関する。
したがって、本発明は、
a) それぞれのビーズが少なくとも一組の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、前記プライマーの少なくとも1つが光切断可能リンカーを介してビーズに結合することをさらに特徴とする、複数のビーズを提供する工程、
b) 試料から目的の核酸分子を捕捉する工程、
c) 前記複数のビーズをクローン的に単離する工程、
d) 前記少なくとも1つのプライマーを光切断する工程、
e) 前記核酸をクローン的に増幅して、複数の増幅産物を生成する工程、
f) 前記増幅産物を分析する工程
を含む、多数の目的の核酸分子を処理する方法に関する。
したがって、本発明は、少なくとも2つの配列特異的増幅プライマーを含む固相支持体であって、少なくとも1つのプライマーが誘導性切断可能リンカーにより前記支持体に結合されている固相支持体に関する。
-それぞれ個々の配列特異的な捕捉分子を有するビーズに標的DNAを供することによる目的の配列の1つまたは混合されたプールの選択。
-ビーズ1つ当たり1つの標的分子の統計学的な捕捉。
-PCRによる増幅;増幅された遺伝子特異的物質を有するビーズの数は配列特異的標的分子の数に比例する。
本発明は、標的増幅および検出のために第1の配列特異的増幅プライマーが標的分子にハイブリダイズして溶液中に放出され得、一方で第2の配列特異的増幅プライマーが切断可能な条件下で表面に共有結合したまま残るような、第1の配列特異的増幅プライマーの、フレキシブルかつ切断可能なリンカー分子を介した固相支持体への可逆的共有結合を要する。切断可能リンカー分子は、酸、塩基、光または当業者に周知の任意の他の手段により切断可能であり得る。好ましくは、正確に1つのプライマーが切断可能リンカーを介してビーズに結合する。
- Wittebolle, Lieven; Verstuyft, Karmen; Verstraete, Willy; Boon, Nico. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 81(3) (2006) 476-480、
- Steinberg, Gali; Stromsborg, Katie; Thomas, Lynette; Barker, David; Zhao, Chanfeng. Biopolymers 73(5) (2004) 597-605、
- Di Giusto, Daniel, A.; King, Garry, C. Topics in Current Chemistry 261 (2005) (Immobilisation of DNA on Chips II) 131-168、
- Zatsepin, Timofei, S.; Stetsenko, Dmitry, A.; Gait, Michael, J.; Oretskaya, Tatiana, S., Bioconjugate Chemistry 16(3) (2005) 471-489
に記載および概説される。
-少なくとも1つ以上の官能基を有する固相支持体を提供する工程、および
-前記1つ以上の官能基と2つの配列特異的プライマーの1つまたは複数の反応基を反応させる工程
を含む方法により作製され、切断可能反応部分は、前記固相支持体とその1つの官能基もしくはその複数の官能基の1つを連結するスペーサーの1つの中に存在するか、または前記切断可能部分は前記配列特異的プライマーの1つとその反応基を連結するスペーサーの1つの中に存在する。
-それぞれが異なる保護基を有する2つの独立した官能基を含む固相支持体を提供する工程、
-第1の官能基を脱保護し、該第1の官能基を、第1のプライマーの反応基と反応させる工程、前記プライマーは、該反応基とヌクレオチド配列自身の間に切断可能実体を有することを特徴とする、および
-第2の官能基を脱保護し、前記固相支持体の該第2の官能基を第2のプライマーの反応基と反応させる工程を含む。
-それぞれが異なる保護基を有する2つの独立した官能基を含む固相支持体を提供する工程、前記官能基の一つは切断可能プライマーを介して固相支持体に連結される、
-第1の官能基を脱保護し、該第1の官能基を第1のプライマーの反応基と反応させる工程、および
-第2の官能基を脱保護し、前記固相支持体の該第2の官能基を第2のプライマーの反応基と反応させる工程を含む。
-それぞれが異なる保護基を有する2つの官能基を含む固相支持体を提供する工程、前記官能基は分枝リンカーを介して固相支持体に連結される、
-第1の官能基を脱保護し、該第1の官能基を、第1のプライマーの反応基と反応させる工程、前記プライマーは、該反応基とヌクレオチド配列自身の間に切断可能実体を有することを特徴とする、および
-第2の官能基を脱保護し、前記固相支持体の該第2の官能基を第2のプライマーの反応基と反応させる工程を含む。
-それぞれが異なる保護基を有する2つの官能基を含む固相支持体を提供する工程、前記官能基は分枝リンカーを介して固相支持体に連結され、前記官能基の一つは切断可能プライマーを介して固相支持体に連結される、
-第1の官能基を脱保護し、該第1の官能基を第1のプライマーの反応基と反応させる工程、および
-第2の官能基を脱保護し、前記固相支持体の該第2の官能基を第2のプライマーの反応基と反応させる工程を含む。
-厳密に1つの官能基を有する固相支持体を提供する工程、
-前記官能基を脱保護する工程、および
-該官能基を、同一の反応基を含む第1および第2の配列特異的プライマーの混合物と反応させる工程を含み、前記プライマーの少なくとも1つは、切断可能部分を介してその反応基に連結されることを特徴とする。
-厳密に1つの官能基を有するビーズを提供する工程、および
-前記官能基を脱保護し、該官能基を、切断可能部分によって連結された第1および第2の増幅プライマーを表すオリゴヌクレオチドと反応させる工程を含む。
- WO 92/002528
- WO 07/082713
- US 5,258,506
- Olejnik, Jerzy; Krzymanska-Olejnik, Edyta; Rothschild, Kenneth, J., Nucleic Acids Research 26(15) (1998) 3572-3576.
- Hausch, F., Jaeschke, A., Nucleic Acids Research 28 (2000) e35.
- Hausch, F., Jaeschke, A., Tetrahedron 57 (2001) 1261-1268.
- Wenzel, T., Elssner, T., Fahr, K., Bimmler, J., Richter, S., Thomas, I., Kostrzewa, M., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22 (2003) 1579-1581.
- Dell'Aquila, Christelle; Imbach, Jean-Louis; Rayner, Bernard, Tetrahedron Letters 38(30) (1997) 5289-5292
- Ordoukhanian, Phillip; Taylor, John-Stephen. Journal of the American Chemical Society 117(37) (1995) 9570-1.
- Saran, Dayal; Burke, Donald, H., Bioconjugate Chemistry 18(1) (2007) 275-279.
- Piggott, Andrew, M.; Karuso, Peter, Tetrahedron Letters 46(47) (2005) 8241-8244。
上述のように、本発明の固相支持体は1つまたは複数のビーズであり得る。本発明のビーズは、以下の工程
a) それぞれのビーズが少なくとも一組の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに前記プライマーの少なくとも1つが切断可能リンカーを介してビーズに結合することを特徴とする、複数のビーズを提供する工程、
b) 試料から目的の核酸分子を捕捉する工程、
c) 前記複数のビーズをクローン的に単離する工程、
d) 前記少なくとも1つのプライマーを切断する工程、
e) 前記核酸をクローン的に増幅して、多数の増幅産物を生成する工程、
f) 前記増幅産物を分析する工程
を含む、目的の多数の核酸分子を分析する方法に使用され得る。
前記ビーズの作製は詳細に上述される。
次いで、標的分子を切断可能プライマーおよび切断可能でないプライマーを含むビーズにハイブリダイズさせる。適切なバッファ系および適切なハイブリダイゼーション温度に関して、適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野に周知であり、特別に使用される増幅プライマーの長さおよび配列などの具体的な条件にしたがって最適化され得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、可能な限り多くの標的核酸を捕捉するために増幅される1つまたは複数の配列と比較して、過剰モルのビーズを使用してなされる。特に、1:5〜1:100、好ましくは1:10〜1:50の過剰モルが特に有利であることが明らかになった。多数の異なる標的配列が検出および/または分析される場合、その後異なる多数のプライマー対を有するビーズのライブラリーを使用する必要がある。
分析される複数の核酸分子中に存在する配列バリエーションについての定量的データを得るために、クローン的な単離が前もって必要である。原則的に、2つの異なるクローン的な単離の形態がある。
切断可能リンカーを介して結合する前記プライマーを含むビーズは、次いで、切断可能プライマーとビーズを結合するリンカーを切断するために、切断条件に曝露される。前記複数のビーズのマイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞への分配によりクローン的な単離が達成される場合、切断可能リンカー分子は、酸、塩基、光または当業者に周知の任意の他の手段により切断され得る。好ましくは、さらなる試薬の添加が回避されるので、リンカーは光切断可能リンカーである。
次いで、核酸増幅反応を実施するために、反応混合物を適切な熱サイクルプロトコルに曝露する。依然として固定された(切断可能でない)増幅プライマーは標的核酸分子および増幅産物にハイブリダイズして、標的核酸分子および増幅産物はビーズの表面に保持される。ビーズから切断された増幅プライマーは、効果的な増幅反応を実行できるように溶液中を自由に移動し得る。
油中水エマルジョンを生成することにより工程c)のクローン的な単離が達成される場合、最初に、増幅産物を有する複数のビーズをマイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞に分配する。続いて、生成された増幅産物の分析のための二つの代替的な態様が存在する。
第1の態様において、それぞれのビーズに結合したDNAを配列決定反応に供し得る。好ましくは、前記配列決定反応は、プライマー伸長反応の形成されるDNA鎖への特定のデオキシヌクレオシドの取り込みがモニタリングされることを特徴とする、合成反応による配列決定である。最も好ましくは、合成反応による前記配列決定は、ピロリン酸の生成の検出により前記取り込みがモニタリングされる、ピロリン酸配列決定反応である(EP 932 700、US 6,210,891)。
-標的を直接ビーズに添加し得ること
-目的の遺伝子またはアンプリコンの前増幅が必要ない
-配列特異的捕捉ビーズのプールを供給する可能性があること、
である。配列特異的捕捉ビーズのプールは、腫瘍学関連遺伝子および他の遺伝子の遺伝子発現などの具体的な適用に分類され得る。
第2の代替的な態様において、依然としてビーズに結合している増幅されたDNAを、適切な検出手段により直接分析し得る。すなわち、アンプリコンの生成がエンドポイント測定の主題であることを特徴とするPCRアッセイを実施する。
Tong,Anthony,K.; Li,Zengmin; Jones,Gregg,S.; Russo,James,J.; Ju,Jingyue. Nature Biotechnology 19(8)(2001)756-759
Kokoris,Mark; Dix,Kim; Moynihan,Kristen; Mathis,Janette; Erwin,Barb; Grass,Paul; Hines,Brian; Duesterhoeft,Andreas,Molecular Diagnosis 5 (2000)329-340
Sun,Lan; Yu,Chenxu; Irudayaraj,Joseph,Analytical Chemistry (Washington,DC,United States)79(11)(2007)3981-3988
Ng,Patrick; Tan,Jack,J.,S.; Ooi,Hong,Sain; Lee,Yen,Ling; Chiu,Kuo,Ping; Fullwood,Melissa,J.; Srinivasan,Kandhadayar,G.; Perbost,Clotilde; Du,Lei; Sung,Wing-Kin; Wei,Chia-Lin; Ruan,Yijun,Nucleic Acids Research 34(12)(2006)e84
Finkel,N.,H.,Lou,X.,Wang,C.,He,L.,Anal. Chem. 76 (2004)352A-359A
Braeckmans,K.,Smedt,S.,C.,D.,Leblans,M.,Pauwels,R.,Demeester,J.,Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002)447-456
工程c)のクローン的な単離が、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内への前記複数のビーズの分配によって達成された場合、PCR反応工程は、上記で開示したように適切な検出形式を用いて、工程e)中、リアルタイムで既にモニターされ得る。換言すると、工程e)およびf)は、リアルタイムPCR分析を行なうことにより同時に行なわれる。
多数の核酸分子を直接分析する方法に加えて、本発明は、さらに、本発明の方法によって作製されるライブラリーを提供する。ライブラリーは、増幅の出発材料として、例えば、ゲノムDNA、全細胞cDNA、ゲノムDNAライブラリー、cDNAライブラリー、またはプラスミドライブラリーを使用することによって作製され得る。ライブラリーは、例えば、起源が生物学的または合成の任意の核酸集団に由来するものであり得る。
a) 各ビーズが少なくとも1対の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに、前記プライマーの少なくとも一方が、切断可能なリンカーによってビーズに結合されていることを特徴とする複数のビーズを提供する工程
b)試料から目的の核酸分子を捕捉する工程
c)前記複数のビーズをクローン的に単離する工程
d)前記少なくとも1つのプライマーを切断する工程
e)前記核酸をクローン的に増幅し、それにより多数の増幅産物を作製する工程
f)前記多数の増幅産物を、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内にクローン的に(clonally)保存する工程
を含む、目的の多数の核酸分子の増幅のための方法に関する。
(i)配列決定
本発明による配列決定分析は、種々の異なる応用に使用され得る。
本発明によるPCR態様は、絶対的または相対的核酸定量に使用され得る。
プライマーおよび光切断可能なプライマーの調製
オリゴヌクレオチドの合成は、ABI 394合成装置において、1μmol規模で4回で行なった。市販のtac CPG(Proligo)を支持体物質として使用した。標準的な合成のための他の化学薬品は、すべてGlen Researchから入手した。Proligo製のtert.ブチルフェノキシ-アセチル保護基を有するホスホロアミダイト(「tac」または「Expedite」モノマーとして知られる)を使用した。キャッピング試薬として、テトラヒドロフラン中のtertブチルフェノキシアセチル無水酢酸(tac2O)を使用した。
− 5’アミノ修飾剤C6:6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト
− スペーサーホスホロアミダイト18:18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト
− 光切断可能なスペーサー:[4-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ブチルアミドメチル-1-(2-ニトロフェニル)-エチル]-2-シアノエチル-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト
− ビオチンdTホスホロアミダイト:(5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト)
− ビオチンホスホロアミダイト:(1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト)
− フルオレセインホスホロアミダイト:(1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-チオ尿素-(ジ-O-ピバロイル-フルオレセイン)-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト)
− フルオレセインdTホスホロアミダイト:(5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト)
5’-AmMC6・・・5’-アミノ修飾剤C6
isp18・・・内部スペーサー18、ヘキサエチレングリコール
PCL・・・光切断可能な2-ニトロベンジルリンカー
FAMdT・・・フルオレセインデオキシチミジン
TB = ビオチンデオキシチミジン
MvaI制限部位に下線を付している
ビーズの調製および光切断
それぞれ固定リンカーおよび光切断可能なリンカーを含むアミノ修飾オリゴヌクレオチド(配列番号1〜9)を、標準プロトコルに従って、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)官能基化セファロースビーズ(Roche/454-Life Sciences,Branford,CT,USA)にコンジュゲートした。化学反応機構を図2に示す。
光切断反応の分析
(図3に対応)
この実施例には、セファロースビーズに固定化されたフルオレセイン修飾オリゴヌクレオチドプローブの光切断の検出を記載する。
光活性化ビーズPCR
(図4および5に対応)
この実施例では、ビーズPCRおよび光切断可能なビーズ固定化プライマーを用いた特異的PCR産物の検出を記載する。ビーズPCRおよび標準対照PCRのための鋳型は、人工の239bpアンプリコンであった。アンプリコンは、Mva IおよびNla III制限部位を含むような様式で設計した。ビーズPCRまたは対照PCR後のこのアンプリコンの制限エンドヌクレアーゼ処理は、図4で予測されるような異なる長さの断片の特徴的なパターンをもたらすことが予測される。
・ 1サイクル(94℃で4分間)-ホットスタート開始;
・ 40サイクル(94℃で30秒間、58℃で60秒間、68℃で90秒間)-変性、アニーリング、重合;
・ 25サイクル(94℃で30秒間、58℃で6分間)-変性、重合;
・ 10℃で保存。
光活性化ビーズエマルジョン-PCR
(図6に対応)
この実施例では、ビーズエマルジョンPCRおよび光切断可能なビーズ固定化プライマーを用いた特異的PCR産物の検出を記載する。
・ 1サイクル(80℃で5分間)-変性;
・ 1サイクル(0.1℃/秒で70℃まで低下、70℃で1分間)-アニーリング;
・ 1サイクル(0.1℃/秒で60℃まで低下、60℃で1分間)-アニーリング;
・ 1サイクル(0.1℃/秒で50℃まで低下、50℃で1分間)-アニーリング;
・ 1サイクル(0.1℃/秒で20℃まで低下、20℃で5分間)-アニーリング。
・ 1サイクル(94℃で4分間)-ホットスタート開始;
・ 40サイクル(94℃で30秒間、58℃で60秒間、68℃で90秒間)-変性、アニーリング、重合;
・ 25サイクル(94℃で30秒間、58℃で6分間)-変性、重合;
・ 10℃で保存
鋳型としてcDNAを用いた光活性化ビーズエマルジョン-PCR
(図7に対応)
この実施例では、ビーズエマルジョンPCRおよび光切断可能なビーズ固定化プライマーを用いたヒトcDNA由来の特異的PCR産物の検出を記載する。
マルチプレックス光活性化ビーズ-PCR
(図8および9に対応)
多数の鋳型DNAの捕捉、DNA 増幅、および対応する増幅鋳型に結合された1組の異なるビーズの回収を含む以下の手順を単一のチューブで行なった。
この実施例では、懸濁液中で光活性化ビーズPCRを用いた多数の特異的PCR産物の同時検出を記載する(図8)。
この実施例では、エマルジョン中で光活性化ビーズPCRを用いた多数の特異的PCR産物の同時検出を記載する(図8)。
シングルプレックス(singleplex)光活性化ビーズエマルジョンPCRを用いた核酸配列決定
以下の実験は、ピロリン酸配列決定(Margulies,M.,et al.,Nature 437 (2005)376-80)に基づいたハイスループット配列決定システムを使用し、ビーズエマルジョンPCR後に得られた標的配列の特異的検出を試験するために行なった。
以下の実験は、ピロリン酸配列決定(Margulies,M.,et al.,Nature 437 (2005)376-80)に基づいたハイスループット配列決定システムを用いたマルチプレックスビーズエマルジョンPCR後に得られた標的配列の同時検出およびデコードを試験するために行なった。
Claims (20)
- a) 各ビーズが少なくとも1対の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに、前記プライマーの少なくとも1つが光切断可能なリンカーによってビーズに結合されることを特徴とする複数のビーズを提供する工程
b) 試料から目的の核酸分子を捕捉する工程
c) 前記複数のビーズをクローン的に単離する工程
d) 前記少なくとも1つのプライマーを光誘導切断する工程
e) 前記核酸をクローン的に増幅し、それにより多数の増幅産物を作製する工程
f) 前記増幅産物を分析する工程
を含む方法。 - 工程c)が、エマルジョンの作製を含み、各ビーズが単一のミセル内に封入されている、請求項1記載の方法。
- 工程f)が、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内への前記複数のビーズの分配および前記増幅産物の検出を含む、請求項2記載の方法。
- 工程f)が、さらに、前記増幅産物の配列決定反応を含む、請求項3記載の方法。
- 前記配列決定反応が合成反応による配列決定である、請求項4記載の方法。
- 前記増幅産物の作製がモニターされる、請求項3記載の方法。
- 前記増幅産物が、特異的二本鎖DNA結合蛍光実体または配列特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される、請求項6記載の方法。
- 前記増幅産物が、温度勾配に供することにより分析される、請求項7記載の方法。
- 工程c)が、マイクロタイタープレートまたはピコタイタープレートの空洞内への前記複数のビーズの分配を含む、請求項1記載の方法。
- 工程e)およびf)がリアルタイムPCRによって同時に行なわれる、請求項1記載の方法。
- 切断可能なリンカーによってビーズに結合されている前記少なくとも1つのプライマーが検出可能なタグを有する、請求項6〜10いずれか記載の方法。
- 前記検出可能なタグが、質量タグ、色標識、e-タグおよび抗体によって検出可能なハプテンからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、好ましくは、前記標識されたプライマーが伸長されていない限り消光される蛍光標識であることを特徴とする、請求項12記載の方法。
- 切断可能なリンカーによってビーズに結合されている複数のプライマーの各メンバーが異なる検出可能なタグを有することを特徴とする、請求項11〜13いずれか記載の方法。
- 定量的変異分析のための請求項4または5記載の方法の使用。
- 遺伝子発現のモニタリングのための請求項4または5記載の方法の使用。
- 対立遺伝子特異的増幅を行なうことによる定量的変異分析のための請求項6〜11いずれか記載の方法の使用。
- 遺伝子発現のモニタリングのための請求項6〜11いずれか記載の方法の使用。
- 相対的または絶対的核酸定量のための請求項6〜11いずれか記載の方法の使用。
- 切断可能なリンカーによってビーズに結合されている複数のプライマーの各メンバーが異なる検出可能な標識を有することを特徴とする、請求項17〜19いずれか記載の方法の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP09002627.9 | 2009-02-25 | ||
EP09002627 | 2009-02-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010193884A true JP2010193884A (ja) | 2010-09-09 |
JP5457222B2 JP5457222B2 (ja) | 2014-04-02 |
Family
ID=40552066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010034500A Active JP5457222B2 (ja) | 2009-02-25 | 2010-02-19 | 小型化ハイスループット核酸分析 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20100248237A1 (ja) |
EP (1) | EP2224014B1 (ja) |
JP (1) | JP5457222B2 (ja) |
CN (1) | CN101845494B (ja) |
CA (1) | CA2694745C (ja) |
ES (1) | ES2430853T3 (ja) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014534811A (ja) * | 2011-10-14 | 2014-12-25 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company | 矩形波サーマルサイクリング |
JP2015524262A (ja) * | 2012-07-18 | 2015-08-24 | ディーエヌエー エレクトロニクス エルティーディー | 感知装置および方法 |
WO2016151719A1 (ja) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | 株式会社日立製作所 | 核酸反応デバイス |
JP2017507656A (ja) * | 2014-02-26 | 2017-03-23 | ヴェンタナ メディカル システムズ, インク. | 生物学的試料分析のための光選択的方法 |
JP2017515469A (ja) * | 2014-04-21 | 2017-06-15 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸をバーコーディングするためのシステムおよび方法 |
JP2017209049A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 |
JP2017209051A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の検出方法、標的生体分子検出用基板、及び標的生体分子検出装置 |
JP2017209048A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の濃度算出方法、標的生体分子濃度算出用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子濃度算出装置 |
US10596541B2 (en) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for barcoding nucleic acids |
WO2020213700A1 (ja) * | 2019-04-19 | 2020-10-22 | 学校法人日本大学 | 核酸配列等の簡便検出法 |
US11001883B2 (en) | 2012-03-05 | 2021-05-11 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for epigenetic sequencing |
US11746367B2 (en) | 2015-04-17 | 2023-09-05 | President And Fellows Of Harvard College | Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2530167A1 (en) | 2006-05-11 | 2012-12-05 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices |
WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
EP4047367A1 (en) | 2008-07-18 | 2022-08-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting target analytes with droplet libraries |
US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
WO2011047087A2 (en) | 2009-10-13 | 2011-04-21 | Nanostring Technologies, Inc. | Protein detection via nanoreporters |
US9650629B2 (en) * | 2010-07-07 | 2017-05-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Clonal pre-amplification in emulsion |
EP2675819B1 (en) | 2011-02-18 | 2020-04-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
EP3907297A1 (en) | 2011-04-15 | 2021-11-10 | The Johns Hopkins University | Safe sequencing system |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
US9855559B2 (en) | 2011-12-30 | 2018-01-02 | Abbott Molecular Inc. | Microorganism nucleic acid purification from host samples |
RU2636465C2 (ru) | 2012-02-09 | 2017-11-23 | Лайф Текнолоджис Корпорейшн | Способ конъюгирования полимерной частицы |
GB2519906B (en) | 2012-08-13 | 2017-02-08 | Univ California | Methods for detecting target nucleic acids in sample lysate droplets |
US10221442B2 (en) * | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
MX364957B (es) * | 2012-08-14 | 2019-05-15 | 10X Genomics Inc | Composiciones y metodos para microcapsulas. |
US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10400280B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN104956225B (zh) | 2012-10-29 | 2018-10-02 | 约翰·霍普金斯大学 | 卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试 |
US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CA2894694C (en) | 2012-12-14 | 2023-04-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN105102697A (zh) * | 2013-02-08 | 2015-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 多核苷酸条形码生成 |
CN105492607B (zh) * | 2013-06-27 | 2019-07-02 | 10X基因组学有限公司 | 用于样品处理的组合物和方法 |
WO2015069798A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | The Regents Of The University Of California | Single-cell forensic short tandem repeat typing within microfluidic droplets |
KR102596508B1 (ko) | 2014-04-10 | 2023-10-30 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용 |
JP6838969B2 (ja) | 2014-06-26 | 2021-03-03 | 10エックス ジェノミクス, インコーポレイテッド | 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法 |
EP3160654A4 (en) * | 2014-06-27 | 2017-11-15 | The Regents of The University of California | Pcr-activated sorting (pas) |
AU2015339148B2 (en) | 2014-10-29 | 2022-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
CN107208143A (zh) * | 2014-11-20 | 2017-09-26 | 安普里怀斯公司 | 用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒 |
MX367432B (es) | 2015-01-12 | 2019-08-08 | 10X Genomics Inc | Procesos y sistemas para la preparación de bibliotecas de secuenciación de ácido nucleico y bibliotecas preparadas con estos. |
US11111519B2 (en) | 2015-02-04 | 2021-09-07 | The Regents Of The University Of California | Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities |
WO2016137973A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | 10X Genomics Inc | Partition processing methods and systems |
CN107532202A (zh) | 2015-02-24 | 2018-01-02 | 10X 基因组学有限公司 | 用于靶向核酸序列覆盖的方法 |
EP3317426B1 (en) | 2015-07-02 | 2020-01-15 | Life Technologies Corporation | Conjugation of carboxyl functional hydrophilic beads |
US10150992B2 (en) * | 2015-07-06 | 2018-12-11 | Life Technologies Corporation | Substrates and methods useful in sequencing |
WO2017027653A1 (en) | 2015-08-11 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
CN105297143A (zh) * | 2015-09-22 | 2016-02-03 | 江苏大学 | 基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法 |
ES2926495T3 (es) | 2015-12-04 | 2022-10-26 | 10X Genomics Inc | Métodos y composiciones para el análisis de ácidos nucleicos |
WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
EP3467121A4 (en) | 2016-05-25 | 2020-02-12 | Nikon Corporation | METHOD FOR IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL, BALLS FOR USE IN IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL, BALL SET, AND DEVICE FOR IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL |
US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN110214186B (zh) | 2017-01-30 | 2023-11-24 | 10X基因组学有限公司 | 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统 |
CN116064732A (zh) | 2017-05-26 | 2023-05-05 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
MX2020001575A (es) | 2017-08-07 | 2020-11-18 | Univ Johns Hopkins | Materiales y métodos para evaluar y tratar el cáncer. |
US10501739B2 (en) | 2017-10-18 | 2019-12-10 | Mission Bio, Inc. | Method, systems and apparatus for single cell analysis |
EP3625361A1 (en) | 2017-11-15 | 2020-03-25 | 10X Genomics, Inc. | Functionalized gel beads |
US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
EP3775271A1 (en) | 2018-04-06 | 2021-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
WO2020005503A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Illumina, Inc. | Flow cells |
US11085036B2 (en) | 2018-10-26 | 2021-08-10 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for DNA processing |
CN113262730B (zh) * | 2021-03-29 | 2022-11-22 | 上海迪赢生物科技有限公司 | 一种基于簇式阵列的高通量自动化基因合成装置 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20070044677A (ko) * | 2005-10-25 | 2007-04-30 | 주식회사 엘지화학 | 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법 |
JP2007526772A (ja) * | 2004-02-27 | 2007-09-20 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | インサイチュー配列決定用ポロニー蛍光ビーズ |
WO2007111937A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Applera Corporation | Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) * | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
IE61148B1 (en) * | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
US5118801A (en) * | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
US5521301A (en) * | 1988-12-12 | 1996-05-28 | City Of Hope | Genotyping of multiple allele systems |
US5639611A (en) * | 1988-12-12 | 1997-06-17 | City Of Hope | Allele specific polymerase chain reaction |
US5137806A (en) * | 1989-12-11 | 1992-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules |
AU635105B2 (en) * | 1990-01-26 | 1993-03-11 | Abbott Laboratories | Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
US5693502A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-02 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5639603A (en) * | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
DE4234086A1 (de) * | 1992-02-05 | 1993-08-12 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen |
EP0655090B1 (en) * | 1992-04-27 | 2000-12-27 | The Trustees Of Dartmouth College | Detection of gene sequences in biological fluids |
US5641658A (en) * | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
US6090592A (en) * | 1994-08-03 | 2000-07-18 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
DE69534217T2 (de) | 1994-12-09 | 2006-01-12 | Wakunaga Seiyaku K.K. | Verfahren zur hemmung von nichtspezifischer hybridisierung in primerverlängerungsreaktionen |
CA2176193A1 (en) | 1995-05-22 | 1996-11-23 | John Wesley Backus | Methods for polymerase chain reaction preamplification sterilization by exonucleases in the presence of phosphorothioated primers |
US5773258A (en) * | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
CA2658290C (en) * | 1996-06-04 | 2012-04-10 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring hybridization during pcr using fluorescent dye specific to double-stranded dna |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
ATE204290T1 (de) | 1996-11-06 | 2001-09-15 | Sequenom Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur immobilisierung von nukleinsäure auf festträgern |
US6426184B1 (en) | 1998-02-11 | 2002-07-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Method and apparatus for chemical and biochemical reactions using photo-generated reagents |
ATE542916T1 (de) | 1999-08-18 | 2012-02-15 | Illumina Inc | Methoden zur erzeugung von oligonukleotidlösungen |
AU2001241723A1 (en) | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Affymetrix, Inc. | Methods for multi-stage solid phase amplification of nucleic acids |
CA2417986C (en) | 2000-08-11 | 2013-11-26 | University Of Utah Research Foundation | Single-labeled oligonucleotide probes |
EP1275735A1 (en) | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
WO2004038038A2 (en) | 2002-10-23 | 2004-05-06 | University Of Utah Research Foundation | Amplicon melting analysis with saturation dyes |
AU2004254552B2 (en) | 2003-01-29 | 2008-04-24 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
WO2005010145A2 (en) * | 2003-07-05 | 2005-02-03 | The Johns Hopkins University | Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations |
US7956011B2 (en) | 2005-05-04 | 2011-06-07 | The Institute Of Cancer Research: Royal Cancer Hospital | Materials and methods for the photodirected synthesis of oligonucleotide arrays |
GB0601031D0 (en) | 2006-01-18 | 2006-03-01 | Novartis Ag | Organic compounds |
WO2007136736A2 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Codon Devices, Inc. | Methods for nucleic acid sorting and synthesis |
DK2518162T3 (en) * | 2006-11-15 | 2018-06-18 | Biospherex Llc | Multi-tag sequencing and ecogenomic analysis |
US9347092B2 (en) * | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
US8083633B2 (en) | 2009-03-27 | 2011-12-27 | GM Global Technology Operations LLC | 8-speed hybrid transmission |
-
2010
- 2010-02-19 JP JP2010034500A patent/JP5457222B2/ja active Active
- 2010-02-22 US US12/709,782 patent/US20100248237A1/en not_active Abandoned
- 2010-02-24 ES ES10001883T patent/ES2430853T3/es active Active
- 2010-02-24 CA CA2694745A patent/CA2694745C/en active Active
- 2010-02-24 EP EP10001883.7A patent/EP2224014B1/en active Active
- 2010-02-25 CN CN201010124293.6A patent/CN101845494B/zh active Active
-
2013
- 2013-01-22 US US13/746,812 patent/US8822158B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007526772A (ja) * | 2004-02-27 | 2007-09-20 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | インサイチュー配列決定用ポロニー蛍光ビーズ |
KR20070044677A (ko) * | 2005-10-25 | 2007-04-30 | 주식회사 엘지화학 | 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법 |
WO2007111937A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Applera Corporation | Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing |
Cited By (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014534811A (ja) * | 2011-10-14 | 2014-12-25 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company | 矩形波サーマルサイクリング |
US10669575B2 (en) | 2011-10-14 | 2020-06-02 | Becton, Dickinson And Company | Square wave thermal cycling |
US11047003B2 (en) | 2012-03-05 | 2021-06-29 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for epigenetic sequencing |
US11001883B2 (en) | 2012-03-05 | 2021-05-11 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for epigenetic sequencing |
US10316363B2 (en) | 2012-07-18 | 2019-06-11 | Dnae Group Holdings Limited | Sensing apparatus for amplification and sequencing of template polynucleotides and array for amplification of template polynucleotides |
JP2015524262A (ja) * | 2012-07-18 | 2015-08-24 | ディーエヌエー エレクトロニクス エルティーディー | 感知装置および方法 |
US10557168B2 (en) | 2012-07-18 | 2020-02-11 | Dnae Group Holdings Limited | Sensing apparatus for amplification and sequencing of template polynucleotides and array for amplification of template polynucleotides |
JP2017507656A (ja) * | 2014-02-26 | 2017-03-23 | ヴェンタナ メディカル システムズ, インク. | 生物学的試料分析のための光選択的方法 |
JP2017515469A (ja) * | 2014-04-21 | 2017-06-15 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸をバーコーディングするためのシステムおよび方法 |
US10596541B2 (en) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for barcoding nucleic acids |
US11052368B2 (en) | 2014-04-21 | 2021-07-06 | Vilnius University | Systems and methods for barcoding nucleic acids |
WO2016151719A1 (ja) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | 株式会社日立製作所 | 核酸反応デバイス |
US11746367B2 (en) | 2015-04-17 | 2023-09-05 | President And Fellows Of Harvard College | Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications |
JP2017209048A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の濃度算出方法、標的生体分子濃度算出用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子濃度算出装置 |
JP2017209051A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の検出方法、標的生体分子検出用基板、及び標的生体分子検出装置 |
JP2017209049A (ja) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 株式会社ニコン | 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 |
WO2020213700A1 (ja) * | 2019-04-19 | 2020-10-22 | 学校法人日本大学 | 核酸配列等の簡便検出法 |
JP7448239B2 (ja) | 2019-04-19 | 2024-03-12 | 学校法人日本大学 | 核酸配列等の簡便検出法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130190191A1 (en) | 2013-07-25 |
CA2694745C (en) | 2015-05-05 |
ES2430853T3 (es) | 2013-11-22 |
JP5457222B2 (ja) | 2014-04-02 |
US8822158B2 (en) | 2014-09-02 |
CN101845494A (zh) | 2010-09-29 |
EP2224014A1 (en) | 2010-09-01 |
US20100248237A1 (en) | 2010-09-30 |
EP2224014B1 (en) | 2013-07-17 |
CA2694745A1 (en) | 2010-08-25 |
CN101845494B (zh) | 2015-11-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5457222B2 (ja) | 小型化ハイスループット核酸分析 | |
JP5453132B2 (ja) | ハイスループット核酸分析のためのビーズ | |
US10995369B2 (en) | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries | |
EP1594981B1 (en) | Double ended sequencing | |
JP2003521252A (ja) | ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法 | |
US9109222B2 (en) | Nucleic acid sample preparation methods and compositions | |
CN113528628A (zh) | 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法 | |
JP2022533916A (ja) | 自家発光に基づく単一チャネルシーケンシング法 | |
JP4865721B2 (ja) | 核酸分析方法 | |
CN117881796A (zh) | 使用靶向表观遗传测定、邻近诱导标签化、链侵入、限制或连接来检测分析物 | |
JPH08154679A (ja) | 遺伝子の変異を同定する方法およびその試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120120 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130716 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130716 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130911 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131211 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140106 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140109 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5457222 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |