JP2015524262A - 感知装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
dNTP→dNMP+PPi+zH+ (方程式I)
ここで、dNTPは、ヌクレオシド三リン酸であり、dNMPは、ヌクレオシド一リン酸であり、zは、ヌクレオチドのターンオーバー(turnover)につき生成されたプロトンの平均数を記載する整数または分数であり、H+は、プロトンであり、およびPPiは、ピロリン酸塩(脱離基または反応生成物)である。
PPi→2Pi+zH+ (方程式II)
ウェルまたはチャンバーにおける少なくとも1つのISFETを有するチップ;
前記チップの表面上で鋳型ポリヌクレオチドを増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段;および
前記ウェルまたはチャンバーにおいて、増幅された鋳型ポリヌクレオチドを配列決定するための配列決定手段、を含む。
複数のウェルに鋳型を提供する工程であって、各ウェルがISFETにさらされる、工程;
随意に、鋳型を増幅させる工程;
少なくとも1つの鋳型を各ウェル内に固定化する工程;その後、
各ウェル内でクローン集団を作り出す工程;およびその後、
ウェルにおいて鋳型コロニーを配列決定する工程、を含む。
複数のウェルに複数の鋳型を提供する工程であって、各ウェルがISFETにさらされる、工程;
各ウェルにおいて固体基板上の鋳型をクローン的に増幅させる工程;および
ウェルにおいて増幅された鋳型を配列決定する工程、を含む。
複数のISFETを有する半導体チップ;
複数のウェルを定義するマイクロ流体構造であって、各ウェルがISFETの少なくとも1つにさらされる、マイクロ流体構造;
鋳型ポリヌクレオチドを増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段であって、各ウェル内でクローン集団を作り出すようにウェルが配される、増幅手段;および
各ウェルにおいて鋳型コロニーを配列決定するための配列決定手段、を含む。
複数のISFETを有する半導体チップ;
複数のウェルを定義するマイクロ流体構造であって、各ウェルがISFETの少なくとも1つにさらされる、マイクロ流体構造;
鋳型ポリヌクレオチドをウェル内に固定化する及び増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段;および
各ウェルにおいて増幅された鋳型ポリヌクレオチドを配列決定するための配列決定手段、を含む。
1つの実施形態では、dATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびdUTPの各々に対して1つの供給源があり得、それによって、DNAまたはRNAの鋳型は、同じ装置によって配列決定されることが可能となる。ヌクレオチド源または供給源はまた、好ましくは、前記ヌクレオチド用のポンプを含む。適切なルーティング(routing)機構および制御機構が知られている;例えば、US 2010/031398A1における図8および付随の記載を参照し、これらは、引用によって本明細書に組み込まれる。
0.4〜2の間のウェルに対して1つの鋳型の比率で、幾つかの実施形態では、約1つのウェルに対して1つの鋳型の比率で、ウェルに鋳型を提供する工程、
鋳型の増幅中に隣接するウェルを単離するためにウェルにシールを提供する工程、
増幅された鋳型の配列決定前にシールを除去する工程、をさらに含む。
各ウェルに単一の鋳型結合部位を提供する工程;
鋳型の増幅中に隣接するウェルを単離するためにウェルにシールを提供する工程;および
増幅された鋳型の配列決定前にシールを除去する工程、をさらに含む。
および前記ウェルまたはチャンバーにおいて増幅された鋳型ポリヌクレオチドを配列決定するための配列決定手段を含む。
複数のISFETを有する半導体チップ;
複数のウェルを定義するマイクロ流体構造であって、各ウェルがISFETの少なくとも1つにさらされる、マイクロ流体構造;
鋳型ポリヌクレオチドをウェル内に固定化する及び増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段;および
各ウェルにおいて増幅された鋳型ポリヌクレオチドを配列決定するための配列決定手段、を含む。
複数のウェルに複数の鋳型を提供する工程であって、各ウェルがISFETにさらされる、工程;
各ウェルにおいて固体基板上の鋳型をクローン的に増幅させる工程;および
ウェルにおいて増幅された鋳型を配列決定する工程、を含む。
FETは、化学的な感応層の表面と反応培地(即ち、電解質界面)との間の荷電イオンの交換をもたらすことによって機能する:
最も好ましくは、加熱手段は、オンチップの加熱要素、および随意に、オンチップの温度センサー及び/又はオンチップの温度制御回路も含む。さらに、ヒーターは、チップへと統合された抵抗加熱要素であることが好ましい。
ヒーターの材料は、アルミニウム、銅、タングステン、または他の一般的な金属組成物または合金の1つ以上の金属である。材料の選択は、チップの製造プロセスに大きく依存する。
一実施形態では、ヒータードライバーは、少なくとも1つの個々のドライバーステージを含み、これは、ヒータードライバーの選択レジスタ(HDRV)を設定することによって、選択的にオン/オフにされ得る。(上にRとして表わされる)ヒーター経路はチップにわたって分布される。このような構成では、1つのドライバーステージのみが、ヒータードライバーのオペアンプ(opamp)の負フィードバックへの「SENSE」接続を閉じることによって、真の閉ループにおいて実行される。それ故、各ヒーター経路にわたって流れる電圧は、ヒーター経路の残りが開ループの方法で実行されるため、ミスマッチが原因でわずかに異なる(図11を参照)。
好ましくは、チップは、1つ以上の温度センサーを含み;より好ましくは、チップは、チップにわたって均一に分布された温度センサーのアレイを含む。温度センサーは、基板におけるPN接合であり得るか、または絶対温度比例センサー(Absolute Temperature sensor)を実施するためのより複雑な回路を使用し得る(その各々は、電気工学の分野で既知である)。1つのチップ当たりの温度センサーの数は、ヒーターおよびISFETセンサーの数に依存する。1つの実施形態では、温度センサーと、ヒーターと、ISFETセンサーとの間の比率は、1:1:1であり得る。好ましい実施形態では、温度センサーの数は、ヒーターの数より少ない、ISFETセンサーの数よりも少ない。
センサーチップは、DNAセンシングのためにチップ表面をさらすためのカスタマイズされた開口部(例えばウェル、チャンバー)を有するリードフレームまたは積層基板上の従来ICパッケージフォーマットにおいてパッケージにされ得る。パッケージのタイプは、CLCC、PLCC、TSSOP、QFN、BGA、SOICなどの、任意の主流の又はカスタマイズされたフォーマットであり得る。パッケージのサイズの、材料、設計の選択は、感知装置の用途および最終組み立てに依存している。
シーリングキャップまたはシーリング手段として本明細書で言及される、除去可能なシールは、反応物を密封する(含有する)のに適している。したがって、これは、環境および隣接するウェルから反応物およびその試薬を密封する(含有する)手段を提供する。この除去可能なシールは、最も好ましくは、増幅反応物のために提供される。これはまた、配列決定の反応物(したがって、増幅および配列決定の反応物のいずれか又はその両方)に使用され得るが、最も好ましくは、増幅反応物を密封することに使用される。
幾つかの実施形態では、任意のオリゴヌクレオチドが、増幅前にウェルまたはビーズに固定化されることを除いて、増幅および配列決定の過程で使用される試薬が、装置の物理的な部分を形成しないことが認識されるだろう。
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次に、各ウェルからの結果が分析され得、重なる部分が、全ゲノムまで提供するように合わせられ得る。
参照ISFETが、装置内に提供され得る。この目的のために、対照ウェルが存在し得るか、そうでなければ空のウェルが存在し得る。空のウェルは、多くの理由で生じ得、それらは、意図的に空にされるか、または固定化を避けるように設計されるかのいずれかであり得る。さらに、平均で1ウェル当たり1つの鋳型のみが使用され、多数のウェルがチップ上に提供される場合、配列決定する(および随意に、配列決定前に増幅させる)ために固定化された鋳型を有さないウェルもあるべきである。
効果的な配列決定のために、各ウェルにおける配列決定の反応物が、核酸鋳型の1つの種のみを含むことが望ましい。増幅された鋳型(アンプリコン)が配列決定に使用されると、各々のクローン的な増幅反応が、単一の核酸鋳型で開始されることが望ましい。
この特定の実施形態では、感知装置の各ウェルは、複数の万能プライマーによって修飾され、提供される鋳型の数は制限される。即ち、万能プライマーは、ウェル壁の表面に、及び/又はウェルに含まれるビーズの表面に固定化された。鋳型は、以前に記載されたように、増幅および配列決定のために調製され、これには、万能アダプターを鋳型に末端結紮する(end ligating)工程を含む。
別の実施形態では、特有の鋳型の分布は、ウェルにおいて捕捉部位(即ち、固定化されたオリゴヌクレオチド)の数を管理することによって改善され得る。この場合、鋳型は、ウェル/結合部位の数を超えて好適に提供される。捕捉部位の数を1ウェル当たり1つに制限することによって、あらゆるウェルが、その中に結合された単一の鋳型のみを有することを確かなものとすることが可能である。捕捉部位は、固定化されたオリゴヌクレオチド、好ましくは、万能プライマーである。
さらに別の実施形態では、鋳型の分布は、鋳型のサブグループ(即ち、一定の比率)にのみ存在するように予想されるが、そうではないかもしれない、定義された配列に特異的な捕捉部位(即ち、固定化されたオリゴヌクレオチド)を使用することによって改善され得る。そのような特異的な捕捉部位は、(万能プライマーと万能アダプターとの間のハイブリダイゼーションを介して)与えられたサンプルおいて鋳型のすべての種に無差別に結合する、上に記載された前の実施形態で使用されたような、万能プライマーとは対照的である。例は、細菌の16SrRNAまたは23SrRNAの指紋領域に特異的なプライマーを含む。これらの指紋領域内で保護された領域に相補的なウェルにおけるプライマーは、細菌から鋳型を選択的に結合するが、すべての結合された鋳型が、必ずしも同一またはコピーである必要はない。
増幅に必要とされる試薬は、当該技術分野に周知であり、前に言及された。
1)対象(鋳型)の核酸を含むサンプルが得られ、サンプルは、調製され、好ましくは断片化される;
2)調製されたサンプルは、複数(少なくとも2つだが、何千または何百万の可能性もある)のウェルに加えられ、ウェルは、鋳型の増幅に適したプライマーを含む;
3)ウェルはまた、ポリメラーゼおよびヌクレオチド源(例えばdNTP)を含み、これらは、鋳型を用いて加えられ得るか、または既に存在し得る;
4)ウェルは、随意に、1つ以上のビーズを含み得るが、プライマーの少なくとも1つは、ウェル内の表面上(ウェルまたはチャンバーの内部表面、または存在するならばビーズ上のいずれか)のオリゴヌクレオチドを介して(直接的または間接的に)固定化されなければならない;
5)鋳型の増幅は、等温増幅に対して、摂氏60−65度で、またはPCRに対して適温で生じる;
6)一旦十分なレベルの増幅が達成されると(これは、好ましくは、単一のサイクル数または時間を含む、多くの手段によって、好ましくは、我々の初期のqPCRの刊行物でのようにISFETによって決定され得る)、必要とされる信号強度に依存して、増幅試薬およびあらゆる非結合(即ち、固定化されなかった)の鋳型は、固定化された鋳型を残して、洗浄によって取り除かれる;
7)個々のdNTPの波は、ウェル上に又はウェルへと通され、各ISFETは、各波に対応するそのウェルでプロトン放出があるかどうかを検出し、その結果、プロトン放出(したががって、ヌクレオチド挿入)は、固定化された鎖に基づいた成長する(growing)(新生)鎖の配列に相互に関連し、したがって、(dNTPがポリメラーゼによって加えられている新生鎖である、その相補体(compliment)を介して)固定化された鎖の配列が提供される;
8)ISFETデータの照合が始まり、配列が決定される。
A)核酸増幅のために、核酸鋳型を、ポリメラーゼ、dNTPおよびプライマーを含む増幅試薬と組み合わせる工程であって、それによって混合物を形成する、工程;
B)イオン感知性装置中の複数のウェルに工程A)における混合物を提供する工程であって、ここでイオン感知性装置が、ISFETセンサー、ヒーターおよび温度制御を含み、ウェルの各々が、少なくとも1つのISFETセンサーに接している、工程;
C)ウェルにおいて核酸増幅を行う工程;
D)ウェルにおいて増幅された鋳型の配列を同定する工程。
A)核酸鋳型を、ポリメラーゼ、dNTP、および第1および第2のプライマーを含む増幅試薬と混合する工程であって、ここで、第1プライマーが、第1一本鎖の核酸鋳型の種に結合することができ、第2プライマーが、第2一本鎖の核酸鋳型に結合することができ、第2一本鎖の核酸鋳型の種が、第1一本鎖の核酸鋳型の種に相補的である、工程;
B)各ウェルが平均で核酸鋳型の1つの単一のコピーを含むように、イオン感知性装置上で、工程A)における混合物を複数のウェルと接触させる工程であって、ここで、各ウェルが、固体支持体の表面上で固定化されたオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの配列が、第1プライマーの少なくとも一部分と同一であり、オリゴヌクレオチドが、第1一本鎖の核酸鋳型の種に結合することができる、工程;
C)ウェルをシーリングキャップで覆う工程;
D)核酸増幅反応を行う工程であって、それにより、核酸鋳型が、第1および第2のプライマーによって増幅され、ここで、第1一本鎖の核酸鋳型の種が、優先的に生成され、第1プライマーおよび固体支持体上で固定化されたオリゴヌクレオチドに結合することができる、工程;
E)第2一本鎖の核酸鋳型の種を形成するために、オリゴヌクレオチドを拡張する工程であって、ここで、第2一本鎖の核酸鋳型の種の配列が、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた第1一本鎖の核酸鋳型の種に相補的である、工程;
F)工程C)からシーリングキャップを除去する工程;
G)固定化された核酸鋳型を変性させる工程であって、ここで、第2一本鎖の核酸鋳型の種のみが固体支持体に結合される、工程;
H)配列決定プライマーおよびポリメラーゼをウェルに加える工程であって、ここで、列決定プライマーが、第2一本鎖の核酸鋳型の種の3’領域にハイブリダイズする、工程;
I)1つのヌクレオチドをウェルに加える工程;
J)もしヌクレオチドが加水分解される且つ組み込まれる場合に、プロトン放出から結果として生じるpHの変化を検出する工程;
K)組み込まれていないヌクレオチドを除去するためにウェルを洗浄する工程;
L)核酸鋳型の配列を描写するために、工程I)−K)を繰り返す工程。
Claims (21)
- 複数の鋳型ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、該方法は、
複数のウェルに鋳型を提供する工程であって、各ウェルがISFETにさらされる、工程;
鋳型を増幅させる工程;
少なくとも1つの鋳型を各ウェル内に固定化する工程;
各ウェル内でクローン集団を作り出す工程;およびその後
ウェルにおいて鋳型コロニーを配列決定する工程、を含むことを特徴とする、方法。 - 複数の鋳型ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、該方法は、
複数のウェルに複数の鋳型を提供する工程であって、各ウェルがISFETにさらされる、工程;
各ウェルにおいて固体基板上の鋳型をクローン的に増幅させる工程;および
ウェルにおいて増幅された鋳型を配列決定する工程、を含むことを特徴とする、方法。 - 前記ウェルにおける前記鋳型を含む加水分解反応物の副産物を検出するために、ISFETからの出力信号をモニタリングする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- サンプルにおける核酸が、複数の鋳型ポリヌクレオチドを作り出すために、増幅前に断片化されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 0.4〜2の間のウェルに対して1つの鋳型の比率で、好ましくは、約1つのウェルに対して1つの鋳型の比率で、ウェルに鋳型を提供する工程、
鋳型の増幅中に隣接するウェルを単離するためにウェルにシールを提供する工程;および
増幅された鋳型の配列決定前にシールを除去する工程、を含むことを特徴とする、請求項1乃至4に記載の方法。 - 単一を固定化するために単一の鋳型結合部位を各ウェルに提供する工程;
鋳型の増幅中に隣接するウェルを単離するためにウェルにシールを提供する工程;および
増幅された鋳型の配列決定前にシールを除去する工程、を含むことを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。 - 単一の鋳型結合部位が、ビーズ上にあり、好ましくはここで(a)ビーズが、1つのビーズを結合するのに十分大きな結合部位のみによって各ウェルの表面に結合されるか、または(b)ビーズが、そのような1つのビーズだけが各ウェルに適合できるようなサイズであるかのいずれかであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 鋳型を各ウェルに引きつけるために各ウェルにさらされた電極上の電荷を制御する工程をさらに含み、好ましくはここで、各ウェルにおける個々の電極上の電荷が、そのウェルの表面に対する鋳型結合の検出後に取り除かれるか又は逆にされることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
- ウェル内に固定化された配列特異的なオリゴヌクレオチドが、標的鋳型のタイプの1つ以上の鎖を単一の固体基板に結合することを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
- ウェル内に固定化されたオリゴヌクレオチドが、好ましくは、オリゴヌクレオチドをワックスでコーティングすることによって隔離され、好ましくはここで、固定化されたオリゴヌクレオチドの隔離は、好ましくはウェルから非結合の鋳型を洗浄した後に、ワックスを加熱することによって除去されることを特徴とする、請求項1乃至9のいずれかに記載の方法。
- 各ウェルにおいて結合された鋳型のクローン的な増幅のための更なる結合部位を有する複数のビーズを、各ウェルに提供する工程をさらに含み、該工程が、好ましくは、ウェルから非結合の鋳型を洗浄した後に行われることを特徴とする、請求項1乃至10のいずれかに記載の方法。
- 複数の鋳型ポリヌクレオチドの増幅および配列決定のための感知装置であって、該感知装置は、
複数のISFETを有する半導体チップ;
複数のウェルを定義するマイクロ流体構造であって、各ウェルがISFETの少なくとも1つにさらされる、マイクロ流体構造;
鋳型ポリヌクレオチドを増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段であって、各ウェル内でクローン集団を作り出すようにウェルが配される、増幅手段;および
各ウェルにおいて鋳型コロニーを配列決定するための配列決定手段、を含むことを特徴とする、感知装置。 - 複数の鋳型ポリヌクレオチドの増幅および配列決定のための感知装置であって、該感知装置は、
複数のISFETを有する半導体チップ;
複数のウェルを定義するマイクロ流体構造であって、各ウェルがISFETの少なくとも1つにさらされる、マイクロ流体構造;
鋳型ポリヌクレオチドをウェル内に固定化する及び増幅させるための、および室温に対して高い温度で鋳型ポリヌクレオチドの増幅を行うのに適切な少なくとも1つの加熱手段を含む、増幅手段;および
各ウェルにおいて増幅された鋳型ポリヌクレオチドを配列決定するための配列決定手段、を含むことを特徴とする、感知装置。 - 各ウェル内に固定化された少なくとも1つのオリゴヌクレオチドがあり、このオリゴヌクレオチドが、ポリヌクレオチドに結合されないが、鋳型ポリヌクレオチドに結合するように適していることを特徴とする、請求項12に記載の感知装置。
- マイクロ流体構造の表面を覆うように配された除去可能なシールをさらに含み、それ故、各ウェルを隣接するウェルから実質的に単離することを特徴とする、請求項12または13に記載の感知装置。
- 除去可能なシールが、鉱油などの液体であることを特徴とする、請求項15に記載の感知装置。
- 除去可能なシールが、可撓性膜などの固体であり、好ましくは、感圧接着剤などの接着剤を含むことを特徴とする、請求項15に記載の感知装置。
- 各ウェル内の表面が、オリゴヌクレオチドを固定化する手段によって修飾されることを特徴とする、請求項12乃至17のいずれかに記載の感知装置。
- 単一のオリゴヌクレオチドのみが、サンプルにおいて鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズするために前記ウェルの各々で利用可能であることを特徴とする、請求項12または13に記載の感知装置。
- ビーズが、オリゴヌクレオチドの固定化のための表面を提供し、好ましくはここで、ビーズは、ストレプトアビジンコーティングされたポリスチレンビーズであることを特徴とする、請求項18または19に記載の感知装置。
- 加熱手段が、オンチップの加熱要素、および随意に、オンチップの温度センサー及び/又はオンチップの温度制御回路も含み、好ましくはここで、オンチップのヒーターが、チップへと統合された抵抗加熱要素であり、好ましくは、抵抗加熱要素が、チップにおける1つ以上の金属層からの経路として形成されることを特徴とする、請求項12乃至20のいずれかに記載の感知装置。
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