CN107254510A - 一种用于模板多核苷酸扩增的阵列和传感装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于模板多核苷酸扩增的阵列和传感装置。用于模板多核苷酸扩增的阵列包括：多个阱，每个阱与ISFET相接触；多个捕获微珠，每个捕获微珠包括单独的模板结合点，其中所述阱与捕获微珠是尺寸对应的，仅一个捕获微珠适合于每个阱；可拆卸密封，所述密封安排用于覆盖所述阱并将每个阱与相邻的阱充分隔离；和加热元件。可以防止在扩增期间反应之间的蒸发和交叉污染。

Description

一种用于模板多核苷酸扩增的阵列和传感装置

本申请是申请号为201380038217.5、申请日为2013年7月18日、名称为“传感装置及方法”的中国专利申请的分案申请。

背景技术

在过去的二十年中，伴随着现有可获得的装置仪器的测量范围的增加，在核酸分析，特别是核酸扩增和DNA测序技术领域已有了快速发展。检测和分析核酸序列的传统方法主要依赖于荧光核酸染料、荧光标记的寡核苷酸探针、荧光或放射性标记的核苷酸。

随后，一种利用基于半导体的检测系统，例如离子敏场效应晶体管(ionsensitive field effect transistor)(ISFET)分析核酸合成和测序的新方法已被开发，参见例如我们的PCT公布文本WO 03/073088。一种离子敏场效应晶体管为基础的平台，不同于传统的基于荧光的核酸分析系统，检测不需要昂贵的光学仪器或危险的放射性同位素，因此使得该平台低成本、安全和简单替换(simple alternative)以用于测序和核酸扩增分析。

具体地，已经采用测量溶液中离子浓度的ISFTE通过检测由反应引起的氢离子(H⁺，质子)浓度变化以检测核苷酸结合到核酸链中。

在核酸聚合反应过程中释放出氢离子。例如，如下化学式I显示通过DNA聚合酶调解单个核苷酸水解促进氢离子释放：

dNTP→dNMP+PPi+ZH⁺ (化学式I)

其中dNTP为三磷酸核苷，dNMP为一磷酸核苷，z为描述每个核苷酸转交(nucleotide turnover)产生质子的平均数的整数或分数，H⁺为质子和PPi为焦磷酸盐(离去基团或反应产物)

可以通过将焦磷酸盐水解形成两个正磷酸盐(Pi)驱动所述反应以进一步产生更多的氢离子。焦磷酸酶促进这种二次化学反应，且描述于化学式II中：

PPi→2Pi+zH⁺ (化学式II)

现有的“合成测序(sequencing-by–synthesis)”方法的工作流程可以大体上分为模板制备、测序和检测，以及数据分析。所述第一步骤，模板制备，通常包括无性系扩增所述模板以获得足够数量的扩增模板以确保在测序步骤中检测核苷酸合并信号(incorporation signal)。目前，这种无性系扩增步骤通常在与测序反应相分离的隔间中进行，典型的在分隔装置(separate machine)中进行。然而，这种两个步骤的空间上的分离需要熟练技工，按时安排大量人手(high levels of hands on time)，引入增加误差并可能增加样品损失，因此降低了对测序的检测敏感性并提高成本。

通常练习(standard practice)是用来扩增所述核酸以方便准确的测序。公知各种各样扩增核酸的方法。实际上，PCT公布文本(WO2008/107014)披露了一种使用固态(Solid-State)pH传感器，例如ISFET，监测qPCR的方法。反应监测是在靶向(核酸)序列存在下，当扩增进行超过了用于克服样品的缓冲能力的循环阈值时，借助检测质子释放所引起的pH变化。其并没有披露通过合成测序(sequencing-by-synthesis)进行序列检测，仅检测了扩增的自身活性(amplification activity)。WO2008/076406A2也公开了在ISFET背景下的各种各样的扩增方法，例如桥式扩增。

使用ISFET用于测定的测序方法也是公知的。US2010/031398A1披露了一种在测序方法中使用的装置，该装置包括一组微孔和传感器，其可以是ISFET，所述传感器具有浮栅结构(floating gate structure)，该浮栅结构相应地(in turn)具有与分析物分离的设置在浮栅上方的保护材料层。保护材料具有达到约的厚度。同时提供了制备方法。然而，这些测序方法和关于DNA的预制备[无性系]的特定过程(distinct process)一样操作。

因此，本发明一个目标是提供一种用于扩增和测序的离子敏感装置，以及用于核酸扩增和测序的方法，其克服了或减轻了现有测序方法中存在的不足。

本发明的进一步目标是提供用于扩增和测序的离子传感装置，其克服了来自于需要将扩增和随后的测序两者在没有任何空间隔离下相结合所引起的困难。

发明内容

为此在本发明的第一个方面提供了一种传感装置，该传感装置包括用于集成样品中的模板多核苷酸的扩增和测序的芯片(chip)，所述装置包括：

-芯片，所述芯片在阱(well)或室(chamber)中有至少一个ISFET；

-扩增装置，所述扩增装置位于所述芯片的表面上用于扩增所述模板多核苷酸，且该扩增装置包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增；以及

-测序装置，所述测序装置用于测序位于所述阱(well)或室(chamber)中的所述扩增模板多核苷酸。

根据本发明的第二个方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括：

向多个阱提供所述模板，每个阱与ISFET相接触；

任选地，扩增所述模板；

使每个阱中的至少一个模板固定；然后

在每个阱中创建无性系种群；以及然后

测序所述阱中的所述模板菌落。

根据本发明的第三个方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸序列的方法，该方法包括：

向多个阱中提供所述多个模板，每个阱与ISFET相接触；

在每个阱的固体衬底上无性系地扩增所述模板；以及

测序所述阱中的所述扩增模板。

根据本发明的第四个方面，提供了一种用于多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，所述装置包括：

-半导体芯片，所述半导体芯片具有多个ISFET；

-微流体结构，所述微流体结构定义了多个阱，其中每个阱与ISFET中的至少一个相接触；

-扩增装置，所述扩增装置用于扩增所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增；以及

-其中设置所述阱以在每个阱中创建无性系种群(clonal population)；

-测序装置，所述测序装置用于在每个阱中测序模板菌落。

根据本发明的第五个方面，提供了一种用于对多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括：

-半导体芯片，所述半导体芯片具有多个ISFET；

-微流体结构，所述微流体结构定义了多个阱，每个阱与ISFET中的至少一个相接触；

-扩增装置，所述扩增装置用于固定和扩增所述阱中的所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增；以及

-测序装置，所述测序装置用于测序所述阱中的所述扩增的模板多核苷酸。

在阱内的扩增期间，特别优选提供可拆卸密封。这样有助于封闭(例如抑制和隔离)在相邻的阱中发生的扩增反应。可拆卸密封帽防止了在扩增期间反应之间的蒸发和交叉污染，因此为最大化的扩增效率提供了最佳条件。可拆卸密封帽可以为液体或固体材料。液体密封帽可以是矿物油或硅油。固体密封帽可以为耐热硅垫或热塑性弹性材料(TPE)。

此处提供用于扩增和测序两个阶段都适用的试剂并论述作为各扩增和测序装置的一部分用于递送它们的装置。尽管如此，应该理解的是，基础试剂包括所述模板多核苷酸、具有适当缓冲器的液体环境、核苷酸(用于扩增和/或测序)源和用于各反应的合适的聚合酶。

用于测序所述阱或室中的扩增模板多核苷酸的测序装置包括用作插入物的核苷酸源，例如dNTPs。而且本发明因此提供装置以实现这个目的。优选这些装置包括核苷酸源，优选三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates)(dNTPs)。优选所述源包括4个以上的不同的供应物(supplies)，每个dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP)有一个。在一个实施方式中，可以为每个dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP提供一个供应物，这样允许DNA或RNA模板通过相同的设备测序。优选源或供给物还包括用于所述核苷酸的泵。合适的路线(routing)和控制机制(control mechanisms)为已知；参见例如US2010/031391A1中图8和附随的描述，特此纳入参考。

用于热循环和等温扩增的合适的扩增聚合酶包括但不限于Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Phusion聚合酶、Vent聚合酶、Bst聚合酶、没有外切酶活性的(exo-Klenow)聚合酶、phi29DNA聚合酶，以及它们的突变体和衍生物。可以在添加所述样品或模板核苷酸之前，例如通过印刷或测定点位(spotting)在芯片上提供所述扩增Pols(聚合酶)。优选地，在这种情况下，在所述扩增完全后还灭活它们。可选择地，在需要时可以添加它们到在所述芯片中/上的所述扩增位点。为此当需要时考虑合适的泵、路线和控制装置。

合适的测序聚合酶(不限于RNA或DNA聚合酶两者)包括但不限于没有外切酶活性的片段DNA聚合酶I、T4没有外切酶活性的(exo-)、Therminator、Bst聚合酶、phi29DNA聚合酶以及它们的突变体和衍生物。可以在添加所述样品或模板核苷酸之前，例如通过印刷或测定点位(spotting)在芯片上提供所述测序Pols(聚合酶)。优选地，在这种情况下，在扩增期间还灭活它们并当扩增完成时恢复活性。可选择地，在需要时可以添加它们到测序位点(例如所述阱)。为此如果需要考虑合适的泵、路线和控制装置。

扩增可以是借助桥式扩增(bridge amlification)、聚合酶连锁反应、核酸依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)(NASBA；Deiman B等，2002)、链置换扩增(Strand-displacement amplification)(SDA；Andra S C，2001)、滚环扩增(Rollingcircle amplification)(US5714320)，和环介导等温扩增(Loop Mediated IsothermalAmplification)(LAMP)，这些全是本领域所熟知的技术。

优选地，所述ISFET监控(momitors)所述扩增反应。在任何情况下放置所述ISFET以便可能在阱处或在阱中检测测序，这样当在所述阱处也发生扩增时，还可以采用所述ISFET监控扩增。在另一个选择中，可以在扩增期间关闭所述ISFET以节省能量。监控所述扩增反应允许系统确定当在阱中出现合适的大量无性系模板时，可以向控制器反馈确定结果以改变或停止在阱或所有阱中的扩增过程。

在本发明的进一方面，提供了一种测定模板核酸的序列的方法，该方法包括扩增样品中的模板核酸和测序在现有装置中的扩增核酸。其他优选的方法步骤为本文中如上且一般性描述的，然而更优选的是，在扩增前断裂样品中的核酸以分解其为有效的尺寸部分(sized portions)。例如，可以按这种方式测序大的DNA分子，甚至整个基因组。

优选地，在同一个阱或室中扩增和接着测序样品中的核酸。

在一些实施方式中，所述传感装置具有至少一个固定在每个阱中的寡核苷酸，其中寡核苷酸与多核苷酸不结合但适合结合到模板多核苷酸。

在一些实施方式中，所述传感装置包括设置的可拆卸密封以覆盖微流体结构的表面，这样本质上使每个阱与相邻的阱隔离。

在一些实施方式中，固体可拆卸密封为柔性膜或粘合剂例如压敏材料粘合剂。

在一些实施方式中，设置所述装置，这样每个模板的扩增发生在与该模板测序相同的阱中。

在一些实施方式中，采取方法对所述传感装置的每个阱的表面修饰以固定寡核苷酸。还可优选的是一种传感装置，在该装置中在每个阱中仅可获得单一的寡核苷酸以与样品中的模板多核苷酸杂交。在一些实施方式中，可以使用微珠作为用于固定扩增核酸的表面。

所述装置可以包括加热装置，其中所述加热装置为集成在芯片中的电阻加热单元，在一些实施方式中从一个以上的金属层形成的路径。

在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括步骤如下：

-向所述阱提供所述模板，按照模板与阱的比率为1:0.4-2，优选约为1:1；

-向所述阱提供密封以在所述模板的扩增期间隔离相邻的阱；

-在所述扩增模板测序前去除所述密封。

在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括以下步骤：

在每个阱中提供单一的模板结合位点；

向所述阱提供密封以在所述模板的扩增期间隔离相邻的阱；以及

在所述扩增模板测序前去除所述密封。

所述单一的模板结合位点可以在微珠上，在一些实施方式中，其中或者(a)通过仅足够大到结合一个微珠的结合位点，将所述微珠结合到每个阱的表面，或者(b)筛选所述微珠以便于仅一个这样的微珠可以适应进入每个阱。

在又一个实施方式中，所述方法可以进一步包括在与每个阱相接触的电极上控制电荷，以吸引模板到每个阱的步骤，在一些实施方式中其中在每个阱中的单个电极上的电荷被去除或在检测结合到该阱表面的模板时被反转。

在一个实施方式中，优选所述寡核苷酸为序列特定以便将一个以上的目标模板型链结合到单个固体衬底。

在一些实施方式中通过用蜡覆盖所述寡核苷酸可以隔绝固定在所述阱表面或者在所述阱内的所述寡核苷酸。在一些实施方式中在从阱中清洗未结合的模板后可以通过加热蜡去除隔绝的固定的寡核苷酸。

优选所述方法进一步包括向每个阱提供多个具有进一步结合位点的微珠的步骤，所述结合位点用于结合在阱中的所述模板的无性系扩增。

优选所述方法进一步包括在测序前从所述阱中清洗去除未结合的模板的步骤。

根据本发明的又一方面，提供了一种传感装置，该传感装置包括用于集成模板多核苷酸的扩增和测序在样品中的芯片，该装置包括芯片，该芯片在阱或室中具有至少一个ISFET；扩增装置，该扩增装置用于在所述芯片表面上扩增模板多核苷酸且包括至少一个加热装置，该加热装置适于在高于室温的温度下引导扩增模板多核苷酸；以及测序装置，该测序装置用于测序在所述阱或室中的扩增的模板多核苷酸。

根据本发明的又一方面，提供了一种测定模板核酸的序列的方法，该方法包括扩增样品中的模板核酸测序且随后测序扩增的核酸，使用根据任一前述权利要求的所述装置。

根据本发明的又一的方面，提供一种用于对多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括：

-半导体芯片，所述半导体芯片具有多个ISFET；

-微流体结构，所述微流体结构定义多个阱，每个阱与ISFET中的至少一个相接触；

-扩增装置，所述扩增装置用于固定和扩增在所述阱内的所述模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增；以及

-测序装置，所述测序装置用于测序在所述阱中的所述扩增的模板多核苷酸。

根据本发明的又一方面，提供了一种测定多个模板多核苷酸的序列的方法，该方法包括：

向多个阱提供多个模板，每个阱与ISFET相接触；

在每个阱中在固体衬底上无性系扩增所述模板；以及

测序所述阱中的扩增的模板。

附图说明

图1是pH检测系统的剖面图；

图2是在同样的阱中集成核酸扩增和测序的一种实施方式的示意图；以及

图3是CMOS与ISFETS、温度传感器、加热器、信号处理电路和模拟向数字转换一起制造的IC的一种实施方式的示意图；

图4是阱结构的一种实施方式的剖面图；

图5是可拆卸密封的不同实施方式的示意图；

图6是根据本发明的一种实施方式的芯片的俯视图，显示出了平行线式加热元件、温度传感器和ISFET传感器；

图7是在图6的线AA截取的芯片的剖视图，显示出了平行线式加热元件、温度传感器和ISFET传感器；

图8是显示说明相对于ISFET感测器的各种各样设置的加热元件的实施例；

图9是根据本发明的一种实施方式的芯片的俯视图，显示出了像素化(pixelated)的加热元件、温度传感器和ISFET传感器；

图10是在图6的线BB截取的芯片的剖视图，显示出了像素化的加热元件、温度传感器和ISFET传感器；以及

图11是根据本发明的一种实施方式的加热器驱动电路的示意图。

附图标记说明

71.阱/室

72.顶层金属电阻加热器 81.ISFET传感器

73.ISFET传感栅 82.集成测序芯片

74.第二金属层 83.温度传感器

75第三金属层

76.多晶硅栅

77.栅极氧化层

78.介电层

73.P-衬底

具体实施方式

本发明的发明人已设计了结合两者(靶向核酸的扩增和测序)的方法与装置，因此提供了一种集成设备。这种设计的一个优势为其能够加速输出的供应(provision)，也就是说所述靶向核酸的序列。另一个优势为集成系统解决了(addresses)许多习惯通过手工过程和实验室工具解决的挑战。另外，这种集成可以加快工作流程的速度以最小化的动手时间并减少样品损失。此外，以进一步自动化的集成系统，将可能把用于测序的应用从实验室的专业科学家转移到为专业人员、护士或技术人员使用的更商业化的环境。

然而，在结合扩增和测序的步骤中的困难是对于每个的最佳条件可能非常不同，且在仪器间几乎不存在可以实现的协同。通常这些步骤的每一步需要复杂的仪器，每台仪器被机械上、电气上和生化上优化以实现它的功能。例如，用于扩增的乳液PCR需要混合油和含有未标记核苷酸的水性液体以及生物化学品/装置以检测仅有单一的无性系种群的微珠。相反地该测序步骤需要具有标记的核苷酸的生物化学品和装置以检测荧光性。而且在测试中使用的带有仪器提供的全部功能的一次性部分常常相当简单(例如载玻片)。

在一个方面中，本发明提供了一种方法和装置，为了降低确定的仪器的复杂性和通过使用重叠化学和装置(overlapping chemistry and apparatus)以结合过程步骤，该方法和装置给一次性部分带来功能。

应该理解的是，术语核酸包括多核酸，例如DNA或RNA且以单链(single stranded)或双链(double stranded)形式，视情况而定，其中任意一种为优选的。

特此将我们的公开的WO2008/107014的内容纳入参考，其在多核酸的扩增方面是有用的。

虽然根据上述优选的实施方式已描述了本发明，但是应当理解的是，这些实施方式仅用于说明，且权利要求并不限于这些实施方式。本领域技术人员能够根据公开的内容做出修改和变型，这些修改和变型应考虑落入随附的权利要求的范围。不论是以单独的形式还是以与本文中公开或说明的任何其他特征的任何适当的结合的形式，可以将本说明书中公开或说明的每个特征并入本发明。

本发明提供了一种用于半导体测序的离子敏感装置和方法。该方法(approach)能使得无性系扩增和无性系扩增的核酸(例如DNA)的测序两者在同样的阱中发生。因此，优选提供一种充分集成的装置，提供用于样品测序(sample-to-sequencing)结果系统的装置。

所述装置允许核酸模板(包括通过分离产生的多个不同核酸模板，或其他物质)的同时无性系扩增(优选PCR、桥式扩增或等温扩增)。所述无性系扩增可以发生在阱中，该阱在感测平台(sensing platform)上被空间隔离(即慎重的(discreet))。本发明进一步提供了用于被空间隔离(例如微阱)和密封的多个核酸模板实现扩增的装置，接下来在同一个阱中准备所述扩增的多个DNA用于随后的经合成的测序反应。其中使用多个不同的核酸模板，本发明还提供了用于在每个为了扩增的阱中分配单一模板的装置。本发明还提供了用于在每个为了扩增的阱中分配单一物种的模板的装置。

半导体芯片

通过在化学敏感层的表面和反应介质(即酶/电解液界面)之间产生电荷离子(charged ions)交换的FET功能：

例如，包括氮化硅是有益的，因为与不具有氮化硅可获得的相比它提供了对pH变化的增加的且更加快速的敏感性。此外，氮化硅帮助保护FET免受水合作用以及电荷迁移的影响。

非-能斯特响应(non-Nernstian response)考虑了FET的即刻敏感性(immdiatesensitivity)，所述响应起因于带电离子在绝缘门(insulating gate)氮化硅表面处的快速的质子依赖性的结合与释放，这将导致跨越氮化硅层的电压下降(voltage drop)中的可重复性变化。跨越氮化硅层的电压下降的变化与pH的变化有关。使用测试电路(instrumentation circuitry)监测所述电压下降，从而允许检测单独的核苷酸插入。测量的电压被称为临界电压(threshold voltage)。

在图1中显示的一种实施方式中，离子敏感装置21可以为在CMOS微芯片24上的多个ISFET，随即具有通过歧管26限定的微流体阱25。该CMOS微芯片还可以包含一个以上的加热器22和温度传感器23。向与ISFET相接触的阱中添加核酸合成反应混合物，该核酸合成反应混合物包含核酸模板、一种或多种聚合酶以及一种或多种核苷酸。每个ISFET输出通过信号处理器监控的电信号。优选ISFET包括钝化层和/或传感层。这些可以官能化以对质子敏感。该传感层可以由金属氧化物或金属氮化物制备，金属氧化物和金属氮化物可以选自由Al₂O₃、SiO₂、Si₃N₄、Al₂O₃、Ta₂O₅、HfO₃、WO₃、以及超能斯特(super-Nernstian)材料组成的组或者这些材料的混合物或者具有不同材料层的层压结构，每层厚度范围为1nm-50nm。但核苷酸水解并结合到生长(growing)的核酸链时，将释放质子并通过信号处理器检测作为ISFET电输出中的变化。ISFET的电信号中的变化在核酸合成期间表示核酸的结合。该装置可以包含可拆卸的密封帽27。可以将固体密封帽耦合到机械执行器，该机械执行器用以提升至打开位置和降低到密封位置(参见下文对用于阱的不同类型密封帽的进一步描述)。

优选地，从ISFET信号与参考信号之间的差异每个ISFET产生一个标准化的输出信号。更优选地，所述参考信号源自于位于不同阱中的芯片上的ISFET或FET，其中在混合物中缺少dNTP、酶或引物中的至少一个，这样将没有反应进行。因此，在芯片上的任何常见的漂移(drift)或噪音将通过接收(taking)这些信号间的差异而被消除。

图7示出了与反应混合物相接触的ISFET，其带有浮栅和由氮化硅制备的传感层(sensing layer)。

优选该装置包括微流体结构，其可以与芯片集成或连接到芯片。微流体处理流体的精确控制和操纵，该流体被几何上约束到较小的规模，通常为μl或pl体积且本领域熟知用于此用途的设备。该微流体结构可以提供输送和容纳(contain)液体的阱、通道(channels)和歧管。简单结构的实施例可以是带有被提供用于定义通道和阱的洞穴(cavities)的成型塑料件。可选择地，该结构可以为带有部分穿孔的平面衬底以定义通道和阱的面，由此形成衬底。该衬底与定义阱或通道的底部的芯片表面连接。PCT/GB2013/050832公开了这样的结构，涉及传感器盒的部分在此纳入参考。还可以以半导体铸件组合该结构，作为在半导体层和金属接线层的上方的附加层，借此通过刻蚀穿过微流体层定义阱和通道。GB1218356.2公开了这样的结构，此处纳入参考。还可以考虑该衬底或结构为微流体设备的部分，或形成全部微流体设备。像这样，在一些实施方式中，可以考虑本发明的装置包括微流体设备。

所述阱的作用是容纳溶剂且将反应副产物接触到ISFET的感测层103。用于全面基因组测序的所述阱的数量可以约为10^8以上，或者用于一般细菌鉴定的所述阱的数量可以约为至少100。优选至少100个阱，更优选至少1000个阱，最优选的至少100,000个阱。

可以借助于泵/压力源和一个或多个控制试剂流入的可控阀将液体可拆卸密封(密封帽)引入装置(例如微流体设备)。在US7948015B2和US2010/0301398A1中描述了这种装置的一个实施例(泵/压力源和控制阀)，特此纳入参考。

在特别优选的实施方式中，使用油(优选矿物油)作为可拆卸密封，此处还涉及作为密封帽，该油可以通过有机溶剂和预置的测序缓冲液的多轮交替清洗被去除。醇如甲醇、异丙醇、乙醇、异丁醇为合适的有机溶剂。其他例如乙醚可以使用。可以在US7842457B2中找到用于去除矿物油的有机溶剂的实施例，特此纳入参考。

在一种优选的实施方式中，使用了微珠(bead)101。它们可以起到用于捕获测序用的模板的表面的作用，在测序案例中我们可以称它们为捕获微珠，他们还可以在扩增模板的定位(location)上，例如进入阱有帮助。此处所使用的微珠可以由许多公知材料制造。这些材料的实施例包括：无机物、天然聚合物、和合成聚合物。这些可以包括但不限于纤维素、纤维素衍生物、玻璃石英(glass silica)、交联葡聚糖(例如Sephadex TM)以及琼脂糖凝胶。在US7842457B2中进一步描述的另外的实施例，特此纳入参考，且为本领域技术人员所熟知。适于共价附着的微珠可以为自然带磁或不带磁。在一种优选实施方式中，该微珠为涂覆有链霉亲和素的聚苯乙烯微珠。该微珠还优选为聚苯乙烯。

一般而言，术语捕获和固定可以互换使用。作为本发明申请的目的，我们已使用捕获位点以覆盖固定的寡核苷酸，捕获位点依次遮盖附着到表面上的引物(或探针)。

优选地，所述捕获微珠和阱尺寸为相对尺寸这样仅一个微珠可以适合所述阱，尽管所述阱可以容纳其他组分，例如试剂、填充微珠和连续固定给定模板的副本的微珠。

可以凭借化学基团或者通过附着在所述载体表面上的深一层的寡核苷酸将寡核苷酸附着到所述固体载体上(例如微珠或阱的壁)。可以通过本领域所公知的手段实现寡-核酸或多-核酸附着到所述微珠。例如，核酸的共价化学附着到微珠可以使用标准偶联剂例如水溶性碳化二亚胺实现，可以通过磷酰胺酶结合(phosphoamidate bond)，将标准偶联剂用于链接DNA序列的5’-磷酸盐与涂覆胺的微珠。同时在现有技术中有用于术语寡核苷酸的各种各样定义，在本申请的上下文中，应被采用指核酸的短的延伸(short stretch)，该核酸可以附着到固体载体上以担当用于结合(固定)在阱中的核酸模板的链接。该术语寡核苷酸和引物可交换使用。寡核苷酸与模板核酸杂交。

理想上被扩增和测序的模板将为ssDNA或RNA。当与固定的寡核苷酸杂交时这是优选的，然而，可以设想双链DNA，其中双链DNA含有产生自例如限制性酶消化的“粘性端(sticky ends)”。特定方向的粘性端将与固定在微珠或固体载体上的寡核苷酸杂交且可以添加连接酶以在模板和寡核苷酸之间形成共价键。

所述核酸模板可以为任意适合尺寸以进行体外扩增。在优选的实施方式中，所述模板的长度约为20-500个碱基对。

可以在扩增之前、期间或之后将所述模板附着(例如通过结扎(ligation)或共价连接)到在阱内的固体载体上。该模板或扩增模板是在一些步骤中流到阱且创建核酸的无性系种群是在阱中，每个阱一个群体(colony)。如以下将要更多描述的，可以通过在阱中固定单一模板且扩增模板或者在阱中固定同样的模板的种群创建这个种群。这与在阱外建立结合到微球的无性系种群并将该微珠输送至阱中的现有技术形成对照。

还特别优选的是，所述装置，例如所述芯片或微流体结构，包括一个或多个阱以及在“同一个阱中”发生的扩增和测序反应(为每个模板)。

所述加热方法包括加热器。优选有温度传感器。还优选地，其还可能包括控制器，该控制器提供了在温度传感器和加热器之间的控制回路。例如在使用用于扩增的Bst聚合酶时，该加热方法升高温度至50℃左右，优选升高至60℃或甚至65℃，对于使用Bst聚合酶的等温扩增60-65摄氏度是最优选。设想更高的温度，例如升高至70、80或甚至90℃，在需要热循环的一些例子中84-98℃为特别优选。重要的是，为相关聚合酶优化温度，或者至少不高于相关聚合酶变形的临界值。

所述芯片可以与外部热环境接触，在外部热环境中发生主动加热和冷却并传递通量循环(flux cycle)到所述芯片。

在芯片上加热

最优选地，所述加热方法包括芯片上加热元件以及，任选地，还包括芯片上温度传感器和/或芯片上温度控制电路。此外，还优选所述加热器为集成在所述芯片中的电阻加热元件。

在一种实施方式中，每个阱可以有分配的一个加热器和一个传感器。作为选择，一个加热器可以足够加热包含10-100个阱的区域。将加热器/传感器安排到阱依赖于阵列中阱的密度。在另一个实施方式中，该加热器可以为平行的金属线，这些金属线沿着阱的纵列排布且位于阱的下方或在阱之间。在另一个实施方式中，该加热器可以为晶体管并且可以同时具有加热和温度传感功能(加热器-传感器混合体)。仍在另一个实施方式中，可以通过热电效应(珀耳帖效应(Peltier effect))提供加热，例如与半导体芯片的表面相连接的热电加热泵。在本发明中所描述的加热元件在带有模拟和数学控制电路(图3)的传感系统中实施。可以在US7888015B2中找到芯片上加热器、温度传感器和温度控制电路的进一步描述。

在一些实施方式中，所述芯片为CMOS(互补金属氧化物半导体)芯片。在一种实施方式中，所述CMOS芯片的金属层的顶部金属可起加热器的作用。优选地，顶部金属起电阻式加热器的作用，其中电阻式加热器可以包括均匀分布跨越整个芯片的平行线性加热元件如图6和图8中示例说明的，或者跨越部分芯片的平行线性加热元件。加热元件的平均分布能够使跨越芯片表面的均匀加热成为可能。电阻式加热元件可以为蛇形、U形、环形、螺旋形、多边形或直线(如图8中实施例所示)。在一些实施方式中，该芯片包括像素化的电阻式加热元件的阵列，其中像素化的电阻式加热元件可以采用环形形状、螺旋形形状或多边形形状。

在一些实施方式中，所述芯片包括护圈(guard ring)。所述芯片的所述护圈(即静电屏蔽)可以起到加热器的作用。一般地，通过电路整个屏蔽路径与电源供应相连以提供屏蔽，但是在加热期间重新配置该路径以连接驱动电路使电流通过所述路径。

相对于ISFET传感器、传感阵列的尺寸和芯片表面设计一个或多个加热元件的定位，这样产生的热量可以提供跨越模具表面(die surface)的均匀的加热并到达每个单独的ISFET传感器。在这样的实施方式中，所述加热元件在CMOS芯片的金属层的顶层金属层的平面中。作为选择，如果跨越模具表面的温度梯度为所需的，可以打开和关闭每个单独的加热元件以获得效果。这样的属性可以使，例如，需要不同的退火温度的反应混合物的PCR扩增在芯片上同时进行。

跨越所述芯片的加热元件的布置取决于每个芯片上ISFET的数量和密度，以及最靠近每个阱的ISFET传感器的数量。在一个实施方式中，一行(或列)ISFET传感器和阱夹在(sandwiched between)两个平行的加热元件之间。在另一个实施方式中，多行(或列)ISFET传感器和阱夹在(sandwiched between)两个平行的加热元件之间。类似地，加热元件可以围绕一个或多个ISFET传感器和/或阱。

跨越所述芯片的平行的加热元件的数量和长度取决于所述芯片的尺寸，例如，对于5mm×5mm的芯片，所述加热区域可以由每个加热元件的平均热电阻(mean heaterresistance)为50欧姆的8个平行的加热元件组成，仅通过加热器产生4W/cm2加热功率。

可以提供用于加热器的加热驱动器。这个加热驱动器可以采用8位的POW寄存器的值(8-bit POW register value)作为其输入并转化其为跨越加热器的恒定输出电压。在一种实施方式中，所述加热器通过连续控制POW值在0和255之间可以按A类模式(Class Amode)驱动。在另一种实施方式中，所述加热器通过控制占空度(duty cycle)(PWM模式)或通过控制将加热器打开(位流模式(Bitstream mode))的脉冲流的密度可以按D类模式(Class D mode)驱动。这种设计的主要优势是为加热器被控制提供灵活性以便在不同热环境中获得目标温度曲线。

加热器材料

加热器金属的材料为铝、铜、钨或其他常规金属组合物或合金中的一种或多种。材料的选择高度依赖于芯片的制备工艺。

加热器驱动电路

在一个实施方式中，加热器驱动器包括至少一个独立的驱动阶段(driverstage)，其可以通过设置加热器驱动器选择寄存器(heater driver selection register)(HDRV)选择性地打开/关闭。加热器路径(在上面以R表示)分布跨越芯片。在这种配置中，只有一个驱动阶段在真正的闭环中通过关闭与加热器驱动器的运算放大器的负反馈相连的“SENSE”运行。因此跨越每个加热器路径运行的电压由于不匹配将会略有不同，当加热器路径的剩余部分将以开环的方式运行时(参见图11)。

在另一个实施方式中，所有的加热器路径为闭环。这样做的好处是让所有N型金属-氧化物-半导体(NMOS)晶体管驱动器通过由数字模拟转换器(DAC)产生的相同的电源电压驱动。通过仔细分选(sizing)驱动器晶体管，VDS可以设置的非常小，因此在加热器驱动器上的功率损耗可以被最小化。

温度传感电路和温度控制

优选地，所述芯片包括一个或多个温度传感器；更优选地，所述芯片包括均匀分布在芯片上的温度传感器阵列。温度传感器可以是在衬底上的PN结或使用更复杂的电路以实施正比于绝对温度传感器(Proportional To Absolute Temperature sensor)(任意一种为电气工程领域所知晓)。每个芯片的温度传感器的数量依赖于加热器和ISFET传感器的数量。在一个实施方式中，温度传感器、加热器和ISFET传感器之间的比率可以分别为1:1:1。在一种优选实施方式中，温度传感器的数量少于ISFET传感器的数量，其少于加热器的数量。

相对于加热器和ISFET传感器的位置安置温度传感器。优选地，该温度传感器位于远离加热器的位置。更优选地，该温度传感器位于不靠近所述加热器的位置，例如直接在加热器的下面。

在本发明的一些实施方式中，通过芯片上的温度传感器报告的温度被发送至外部的微控制器，为了获得目标温度，在外部微控制器中以闭环方式执行PID(比例微分积分，proportional-integral-derivative)控制运算法以控制在芯片上的加热器。

集成测序芯片的封装

传感器芯片可以在引线框架或层压衬底上按传统IC封装格式封装，引线框架或层压衬底具有设定的开口(例如阱、室)以与用于DNA传感的芯片表面接触。包装物的类型可以为任意的主流或定制的格式，例如CLCC、PLCC、TSSOP、QFN、BGA、SOIC等。包装物的尺寸、材料、设计的选择取决于传感设备的应用和最终的装配(final assemble)。

可以理解的是，装置可以包括热循环仪(thermocycler)。在扩增期间，该热循环仪的温度在变性、杂交和退火温度(分别为T1、T2和T3)之间交替。在通过提供充足的冷却液流量和/或风扇转速以获得一系列的冷却斜率(cooling ramp rate)的同时，通过提供所需的充足功率以获得一系列的加热斜率(heating ramp rate)，优选的实施方式提供这样的装置。一些因素影响加热和冷却速度的设计。其中之一为加热器的电阻，其决定了芯片上加热器的轨迹的路线和布局。芯片的封装设计还可以在加热和冷却的斜率中起作用。

优选地，用于扩增的聚合酶为Taq聚合酶。其还优选对扩增和测序两者都有用的聚合酶为Bst聚合酶。

可拆卸密封

该可拆卸密封，此处被称为密封帽或密封装置，适合于密封(容纳)反应。因此提供了一种密封(容纳)反应和来自环境及相邻阱的反应的试剂的装置。为扩增反应最优选提供可拆卸密封。其还可以用于测序反应(并因此单独或同时用于扩增和测序反应)，但最优选在密封扩增反应中使用。

所述可拆卸密封可以为液体，例如油、或蜡。如此处所描述的，这可以通过泵应用。其可以通过清洗去除，例如用适合的溶液，如文中别处所描述的。可选择地，该可拆卸密封可以为固体，例如盖子。这可能由玻璃或其他惰性材料制备，例如上述提及的，或耐热硅垫，或热塑性弹性材料(TPE)。可以通过位于芯片上方应用，优选通过以合适的控制器操作的电机驱动(driven)来降低密封到微流体结构和任选的检测正确位置的传感装置的上表面上。优选地该密封包括用于可变形的衔接微流体结构的兼容表面(compliant surface)。固体可拆卸密封可以通过如上述举例说明的使用者或电机去除。

关于在测序阶段使用可拆卸密封，其为优先选择。在不需要之处，可以有核苷酸和清洗的连续交替流动。这些优先在室温下进行，在一些实施方式中，升高合并的速率，并因此提高测序的速率是期望的，这样可以使用升高的温度(高于室温，即24℃)。在那些例子中，对于测序步骤，可拆卸密封可以是有用的。在测序的升高的温度下，可以理解的是优选固体的可拆卸密封。然而，不包括可拆卸密封的一个原因为其可能降低整体工作流程的速率。用于测序阶段的固体可拆卸密封还可能最小化离子扩散。

如果扩增和测序两者都需要可拆卸密封，则设想液体和固体的可拆卸密封的组合。例如，液体密封装置(可拆卸密封)可用来密封扩增反应，同时液体或固体的密封装置(可拆卸密封)可以用于密封测序阶段。

在一些实施方式中，测序反应在环境温度(例如室温)下进行，液体试剂优选在投递至所述芯片前被外部加热。这种方法是有效的且还有利于测序，因为它为聚合酶/反应提供了更优化的条件并且还增加了测序期间的结合比率。

还优选地的是，加热装置适合于热循环。实际上，热循环为优选的方法，其中可以设想用于变性、退火和延伸的步骤。

模板多核苷酸的扩增发生在所述芯片的表面上。可以理解的是，这可以包括许多分离的表面。还可以理解的是，这可以被认为是在一个或多个表面的内部(in)、上方(on)或表面(at)发生的。在一种实施方式中优选的是，扩增发生在与芯片相邻的设备中，然而在另一个优选实施方式中，这可以在一个或多个(如别处所描述的，但是优选数千个以上)适宜的阱(discreet well)，例如微阱中发生。

在前述实施方式中，核酸的不同片段的扩增可以全部发生在一个室中并随后流向芯片上的阱中。

在后续的实施例中，优选在每个适宜的阱(discreet well)(这样，优选地，每个阱中有平均一个模板)中扩增个别的片段。因此优选地，模板的扩增和随后的扩增的模板的测序发生在相同的阱中。

可以理解的是，在样品中含有模板。该样品为液体且可以包括适宜的缓冲液。如前述提及的，样品中的核酸模板可以被分离为适合于体外扩增的核酸模板的更小片段。在优选实施方式中，该模板的尺寸约为100-500bp。尽管通过扩增生产的模板的精确副本被称为扩增模板，应该理解的是，在模板和扩增模板之间没有结构上的差别，一个仅是另一个的副本。术语扩增模板和扩增子(amplicon)可互换使用。术语扩增和无性系扩增也可互换使用。无性系(Clonal)和无性系地(Clonally)涉及与给定模板本质上相同的副本的核酸种群，从而给定的模板典型地唯一的源自其他模板或核苷酸片段。

术语模板、核酸模板、模板核酸和模板多核苷酸可互换使用。同时在现有技术中可能有术语模板的各种各样的定义，为了本申请的目的，其应该是指可能是在扩增期间可能被复制或在测序期间可能被测序的一段核酸(a length of nucleic acid)。也就是说，模板为在扩增和测序的过程中可能受聚合酶作用的一段核酸。优选该模板核酸为DNA或RNA且可以为单链或双链。如果为双链，可以理解的是，必须存在链的至少部分分离以允许相关酶作用。可选择地，可以使用带有链替换活性的聚合酶。优选该模板为单链。术语靶向(target)和模板单链可以可互换使用，但本质上与用于扩增和随后测序的核酸有关。该核酸在长度上可以仅是一些碱基且上限可以为许多更高的数量级，唯一的限定为关于空间的考虑，例如，阱的尺寸(如果使用)及动力学限制。在模板被称为物种的地方，其是指不同于许多不同模板的种群的特定的或唯一的模板。例如经受过分离的核酸样品将包含许多更小的核酸模板片段或换句话说，核酸模板的许多物种。如进一步的实施例，阱可能含有许多单一物种的核酸模板，在其中的案例存在一个具体核酸的多个副本。

测序步骤确定模板多核酸(或它们的至少一部分)的碱基的序列同源性(sequenceidentity)。这些可以包括从头测序(de novo sequencing)，此处缺乏测序的模板的先前验知识(prior knowledge)。可选择地，可以进行靶向测序和重测序，其中例如，确定具体SNP的同源性。

可以认为该芯片被“集成”。这是因为其允许在相同的芯片上扩增和随后的测序。该加热装置还可以被提供作为该芯片的基础部分。

参见附图4，现在将更详细地描述一种传感装置的阱结构的实施例。设置在CMOS芯片上的传感层15被暴露在阱的底表面。二氧化硅阱侧壁4可以由TiN或Al层14a覆盖。TiN或Al层涂覆有AgCl，在与阱接触的表面上，以形成参比电极14。参比电极偏向传感层之上流体的电位电压设置ISFET的操作点，这样可以测量因流体中质子的释放造成的流体电位的变化。优选设置TiN或Al的层在阱中足够低这样当阱包含反应混合物时可掩盖参比电极。优选地，如在实施方式中所示，用疏水性材料层13覆盖阱壁的顶部表面。合适的疏水性材料包括但不限于有机聚合物或无机物或纳米材料，例如PMMA、PE、PP、Su-8、或光阻材料、聚对二甲苯(parylene)或其可以为超疏水TiO2纳米颗粒涂层。在密封过程中该疏水材料帮助破坏阱间液体表面张力因此去除微小空隙，该空隙可能形成和导致交叉污染或液体从阱中蒸发。阱的密封将在下面详细地论述。

如图5中所示，现将进一步详细地描述可拆卸密封的实施方式。在图5所示的每个实施方式中都包括一个流通池(flow cell)。该流通池可以与传感装置集成作为单一单元(例如实施方式A、B和D)或者其可以形成单独的分离组件(例如实施方式C)。

图5的实施方式A显示了具有集成的流通池1的传感装置。该流通池包括射流阀(fluidic valves)5，提供进口和出口，液体可以通过它们流入和流出阱。每个阱包括传感层3。阱壁4可以由SiO₂制得。实施方式A的阱2没有密封。

实施方式B示出了实施方式A的传感装置，其中阱包括用可拆卸液体密封7密封的扩增反应6。该液体密封优选为油，例如矿物油和更优选石蜡油或硅油。该可拆卸液体密封可以通过泵或压力源和一个或多个控制试剂流入的控制阀经流通池引入到传感装置中。在US7948015B2和US2010/0301398A1描述了这种泵/压力源和控制阀的实施例，特此纳入参考。

将油用作可拆卸密封，该油可以通过有机溶剂和包含合适的清洗剂的预置的测序缓冲液的几轮交替清洗去除，这些清洗剂可以为任意的非离子或非离子与阴离子型的混合物或阳离子型或其可以为硅树脂清洗剂。醇如甲醇、异丙醇、乙醇、异丁醇为合适的有机溶剂。其他例如乙醚也可以使用。可以在US7842457B2中找到用于去除矿物油的有机溶剂的实施例，特此纳入参考。

实施方式C显示了传感装置和被举起至打开位置的分离的流通池。使用压敏胶(PSA)8密封实施方式C的阱。在轻微压力的作用下PSA在粘结剂和被粘结物(在这个案例中为阱壁垒的顶面)之间形成结合。在本领域PSA的特性适公知。在阱的顶部应用PSA层，这样在PSA和阱壁顶面之间建立接触。向PSA施加压力，这样在PSA和阱壁的顶面之间形成粘结结合。可以通过任何形式的外部压力施加压力，例如通过使用滚筒或降低与机械制动器相连的夹具。还可以通过降低在传感装置上的流通池9至关闭位置应用压力。这可以使用机械制动器实现。

优选地，所述PSA的粘结强度足够低，这样当需要时可以轻而易举地去除该PSA。优选地，所述PSA的粘结强度在0.1-10N/cm2之间。更优选地，粘结强度在0.1-5N/cm2之间。

实施方式D显示了具有集成的流通池12的传感装置，该流通池12包括在流通池12的流体入口和出口阀之间的柔性非粘性薄膜(flexible non-sticky membrane)10。该薄膜优选为耐热硅橡胶垫或热塑性弹性体。连接到机械执行器的块状材料11可以被降低至在薄膜上应用均匀的压力。这将使得薄膜推靠到微流体阱的顶部表面推动以便于密封所述阱。为了拆卸该密封，从薄膜上提起该块状材料，使得该薄膜回到其原始位置，提升上述阱(raised above the wells)。

生物和化学反应

可以理解的是，在一些实施方式中，在扩增和测序过程中所使用的试剂并不形成装置的物理部分，例外是扩增前固定在阱或微珠(bead)中的任意寡核苷酸。

在一些实施方式中，这些试剂可以形成装置(作为可能，例如在外壳中提供)的部分或，与装置一起，形成成套工具(kit)。像这样，本发明还提供了成套工具，该配套元件包括用于模板的扩增和测序以及，任选地，文中描述的微珠的试剂和装置。

微流体设备的体积(volume)可以为1pl-10μl范围或大于10μl。在一个实施方式中，加热装置可以允许扩增反应在微流体设备中进行，在微流体器件中可以获得用于热循环和等温扩增反应的最佳温度和条件，及引物或寡核苷酸的杂交。

可以理解的是，样品中的核酸模板需要在它们与用于扩增和测序的传感装置接触前制备。制备样品的步骤可以包括，但不限于，细胞溶解、核酸物质(例如DNA)的纯化、所需区域(desired region)的预扩增、扩增子净化、扩增子的断裂(例如通过超声、雾化或者通过使用限制酶)、断裂的最后修复以及通过连接的通用衔接附着(universal adaptorattachment via ligation)。当是用于制备用于扩增或测序的核酸样品的过程的单独步骤的组合时，所有单个步骤均为本领域所熟知。

在一些实施方式中，离子敏感装置的阱包括固定的寡核苷酸或结合到核酸模板的化学基团。该寡核苷酸或化学基团可以被固定在例如微珠的固体载体上和/或固定在阱的壁上。该固定寡核苷酸或化学基团充当用于核酸模板的“捕获位点”。捕获位点代表固定在能够结合到(即“杂交”)或“捕获”核酸模板的固体载体上的寡核苷酸。

寡核苷酸可以通过结合到载体表面上的化学基团附着到固体载体(例如微珠或阱的壁)上。可以通过本领域所知晓的装置将核酸附着到微珠。例如，可以使用标准的偶联剂例如水溶性碳化二亚胺完成核酸与微珠的共价化学附着，该偶联剂可以通过亚磷酰胺键(phosphoamidate bond)用于将DNA序列的5’-磷酸盐与涂覆胺的微珠连接。可选地，使用类似的化学过程可以将特定的寡核苷酸与微珠连接。

通过硅烷化、活化和耦合过程可以将寡核苷酸固定在阱壁上。可以通过诱导SiO2的水解进行阱壁(SiO2)的硅烷化处理(Silanisation)。可以通过使用硅烷例如(3-缩水甘油)醚氧丙基三甲氧基甲硅烷(3-GPS)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷((3-Amino propyl)triethoxysilane)、氨基苯基三甲氧基甲硅烷(aminophenyl trimethoxysilane)、(3-疏基丙基)三甲氧基甲硅烷(3-MPTS)或卤化乙酰氨基硅烷(haloacetamido silanes)实现硅烷化处理。优选地，所述硅烷化处理仅限定到SiO2表面且不在传感层上以避免关于ISFET性能的任何复杂性(complexities).

可以通过与但不限于二硫二吡啶(dithiobispyridine)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、EDC或其他碳化二亚胺(carbodimides)中的一种反应活化阱的硅烷化(silanised)表面。优选地，活化是通过具有低缓冲能力的化合物以便不在反应期间吸收释放的质子。

然后可以将寡核苷酸连接到表面。寡核苷酸容易与活化的硅烷化表面反应以在阱表面上变为固定。在固定之前，寡核苷酸可以是以官能团修饰的5’，官能团例如胺、-疏基、丙烯酰胺基、羧基、羟基、叠氮化物(azide)或甚至生物素化物。

对固体表面的硅烷化过程的更多细节，可以在下面的参考文献中找到：

1,Bhatia,S.K.；Shriver-Lake,L.C.；Prior,K.J.；Georger,J.H.；Calvert,J.M.；Bredehorst,R.；Ligler,F.S.Anal.Biochem.1989,178,408-413.

2,Lee,Y.W.；Reed-Mundell,J.；Sukenik,C.N.；Zull,J.E.Langmuir 1993,9,3009-3014.

3,Shriver-Lake,L.C.In Immobilized Biomolecules in Analysis；Cass,

4,Kallury,K.M.R.；Krull,U.J.；Thompson,M.Anal.Chem.1988,60,169-172.

5,Lyubchenko,Y.L.；Blankenship,R.E.；Gall,A.A.；Lindsay,S.M.；Thiemann,O.；Simpson,L.；Shlyakhtenko,L.S.Scanning Microsc.Suppl.1996,10,97-107.

6,Vandenberg,E.；Elwing,H.；Askendal,A.；Lundstrom,I.J.Colloid InterfaceSci.1991,147(1),103-118.

7,Leyden,E.D.Silanes,Surfaces and Interfaces；Gordon and Breach:NewYork,1986.

附着在阱壁上的寡核苷酸的密度可以大约为每平方厘米上1微摩(micro Molar)至1皮摩(pico Molar)的范围。获得该密度极大地依赖于硅烷化过程。可以通过将硅烷化的阱壁与树枝状大分子(dendrimeric molecules)或超支化聚合物进一步地反应提高该寡核苷酸的密度，树枝状大分子或超支化聚合物可以提供进一步的功能化的硅烷化表面。

优选地，在上面所描述的寡核苷酸固定期间，保护参比电极的敏感的Ag/AgCl层。这可以是通过用保护层覆盖电极的Ag/AgCl，保护层例如蜡，其可以在测序期间使用装置前被去除。

理想扩增和测序的模板为ssDNA或RNA，然而，可以设想双链DNA，其中双链DNA含有来自于例如消化的限制性酶的“粘性末端(sticky ends)”。特别定向的粘性末端将杂交到固定在微珠或固体载体上的寡核苷酸，并且可以添加连接酶以在模板和寡核苷酸之间形成共价键。

可以将该模板在扩增前附着到固体载体上，或者可以在扩增期间附着。

核酸模板102可以为DNA或RNA，例如但不限于纯化的基因组DNA(一般包括cDNA)或mRNA。核酸模板可以为天然或非天然产生且可以从各种各样的来源获得，例如但不限于，体液或组织、细菌、病毒、或cDNA库。对于RNA，优选在扩增之前将RNA逆转录为DNA的初始步骤。

对于从头测序(de novo sequencing)，核酸模板可以使用本领域所公知的标准样品制备/DNA库构建方法制备107(例如来自新英格兰生物实验室(New England biolabs)的NEBNext快速DNA库准备集合4(NEBNext Fast DNA library Prep Set 4))。简单地，核酸被断裂、末端修复、连接通用衔接及用可选的4-8周期的预扩增清理。对于基因特定的扩增和测序，其可以包括特定别的突变或SNP，可以断裂核酸接着被清理。对于从头测序或基因特定测序两者，特定的断裂尺寸会被强化。

断裂的核酸模板105与扩增试剂混合，该扩增试剂包括dNTP、聚合酶以及第一104和第二106引物，该第一和第二引物具有对相关模板(the template of interest)的5’和3’区域的互补序列且每个可能含有唯一的通用衔接序列。将混合物加入到有限稀释的阱108(为了说明目的)，这样每个阱平均含有单份的模板。可以将断裂的核酸模板通过例如液体流的方法投递到阱中，这样每个阱平均含有单份的模板。在每个阱中获得单份的模板的方法将在后续进一步详细地描述。

可以使用热循环(例如各种使用热循环的聚合酶链式反应(PCRs))或等温扩增方法(例如滚环、链置换扩增(SDA))无性系扩增109模板。

对于PCR，根据所需的分析(analysis desired)的应用和水平使用最佳缓冲条件进行大于10周期(cycle)、20周期、30周期或40周期的扩增。例如，靶向序列分析如用于基因型分型、识别SNPs、或更简单测序应用的可能需要更少的周期。

对于在阱中进行的扩增，将在阱中提供固定的寡核苷酸以结合扩增子。在PCR的变性阶段期间，分离双链扩增子以形成单链DNA；因此在复性阶段(annealing stage)，部分单链DNA将以链特殊方式杂交到固定的寡核苷酸。在一种实施方式中，可以改变第一和第二引物的比率以偏向链特殊单链DNA(ssDNA)的产品，因此增加了ssDNA杂交到固定寡核苷酸110的可能性(例如，如果优选第二引物特殊ssDNA，第一引物和第二引物的比率可以设置为大于1:1、1:4、1:8或者大于1:50)。

然后，使用杂交的ssDNA作为模板，固定寡核苷酸可以作为引物以延伸核酸。变性、复性和延伸的重复循环被用于(无性系)增加阱中模板的复制数量，且这些副本被固定在固体载体上，即位于阱中的表面。

在一些实施方式中，扩增模板的量可以通过ISFET传感器监控，ISFET传感器检测阱中质子的积累量。

优选地，一旦获得理想的无性系扩增模板的量，则去除112密封帽。然后优选清洗阱以去除阱中试剂，该试剂例如缓冲化合物、引物、dNTPs、聚合酶、质子和未固定到固体载体的核酸模板。

使用固定的单链DNA作为用于随后测序反应的优选(扩增)的模板。因此，用例如使模板变质(denature)(链分离)的碱性溶液清洗所述阱以确保仅ssDNA保持固定在载体上。

在一种优选方法中，通过将测序引物杂交到固定的单链核酸(在这个实施例中，ssDNA)的3’区域模拟测序，且然后测序聚合酶(例如Bst聚合酶或其他热稳定聚合酶)结合到测序引物/-单链核酸(ssDNA)模板复合体。

紧接着加入核苷酸，大部分脱氧核苷酸，其中每个核苷酸(例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP)被引入到分离的阱中。如果在特别的阱中互补碱基111存在于模板中，那么将通过聚合酶(在这个实施例中，Bst)杂交该核苷酸并被掺入114从测序引物的3’端延伸。

核苷酸的掺入将导致作为副产品的质子113的产生，其通过ISFET传感器检测并发送积极的响应。在另一方面，缺乏核苷酸的掺入将无法形成质子且因此将无信号产生。通过重复每次添加一个核苷酸的过程，其中每个核苷酸的添加跟着不含有核苷酸的洗涤缓冲液的流动，描绘了完整的序列。

像这样，单一核苷酸的进化波(progressive waves)，优选每个波紧接着步骤以去除所有未结合的核苷酸(“清除步骤”)，例如清洗。检查每个ISFET的信号形式并，最后，确定每个阱中的扩增模板的序列。依次地，可以分析来自每个阱的结果且如果相关，匹配重叠部分以提供完整的基因组。

在本领域中描述的以用于DNA测序的离子敏感装置检测pH变化的方法且此处作为参考引入(参见，例如，专利申请号US811459；US7686929；US7888015；EP2129792；WO06/005967；US2010/0255595；and GB1112140.7；Rothberg JM等，自然475:348-52(2011))。Rothberg的另一个公开为US2010/137143。我们拥有的公开包括WO 2008/07014andWO2003/073088。

在各种实施方式中，固定在固体载体上的寡核苷酸的序列具有与核酸模板的5’或3’的序列互补。优选地，该寡核苷酸具有与用于无性系扩增的第一或第二引物的全部或部分相同的序列，优选与第一和第二引物中任一通用衔接序列相同。在一种优选的实施方式中，在5’末端将该寡核苷酸结合到生物素并且每个阱含有一个以上的结合到生物素链接的寡核苷酸的链霉亲和素珠(Streptavidin bead(s))，生物素链接的寡核苷酸包含有通用衔接序列。可选择地，通用衔接寡核苷酸可以连接到阱内部的表面。可以在改性表面上使用寡核苷酸的其他共价附着(covalent attachment)(例如对未改性玻璃SiO₂上紫外光交联)。

第一和第二引物可能仅含有对通用衔接的互补序列，但还可以含有对相关的靶向基因的互补序列。

在具体的实施例中使用油(优选矿物油)作为可拆卸密封，此处还被称为密封帽，可以通过有机溶剂和预置的测序缓冲液的几轮交替清洗去除该油。醇如甲醇、异丙醇、乙醇为适合的有机溶剂。优选使用异丁醇。

在一种优选实施方式中，单链核酸模板的单一副本首先被杂交到含有寡核苷酸的微珠，然后随着扩增试剂和引物被引入阱中。优选地，然后在阱中无性系扩增初始模板。最终结果为在微珠上捕获互补链的无性系扩增种群。

可以在装置内提供参比ISFET(reference ISFET)。为此，可以有对照阱(controlwell)或否则空白阱。可以有很多原因来产生空白阱，可以有目的地被空白或被涉及以避免固定。此外，如果平均每个阱仅使用1个模板，并且在芯片上提供大量的阱，那么还应该有一些其内不具有固定的模板以测序的阱(并在测序前任选地扩增)。

优选地，测序聚合酶优选Bst，且在阱中培育核酸。

优选通过流动(flowing)或测定点位(spotting)样品到每个阱内以分布核酸模板。为确保每个阱中平均获取仅单一的核酸模板，可以稀释样品。可以使用UV降解不靠近传感器的核酸模板，即在阱的顶部上方明显可见的核酸模板(当沿着包含阱的平面芯片的平面看时)。这将对降解dsDNA特别有用，dsDNA直到变性以提供ssDNA才在阱中复性(与用于固定的寡核苷酸)。因此，该UV或等效物作为去除不在阱中的DNA或任何不在阱中的dsDNA的清洗步骤的替代选择。

扩增的模板最优选的为dsDNA。对于测序测序步骤，模板将优选为ssDNA形式。如果提供双链DNA或RNA，视用于扩增或测序的情况设想适合链分离、溶解和/或变性。

此处涉及的寡核苷酸为用于在阱中或在芯片表面上固定的寡核苷酸。这是将其区别于引物或探针的接头(linker)(需要在一端被固定的中的至少一个以防止扩增或测序的复合体被清洗掉)。

如果没有密封帽存在(包括如果一个被去除)，那么会有液体恒定流入或流出所述阱。

当允许固定模板使用相邻的引物(adjacent primers)扩增以形成无性系扩增模板的固定化聚簇(cluster)时，优选固相扩增例如桥式扩增。桥式扩增通常包括在阱中至少两个固定的寡核苷酸的种群(populations)(例如在阱的壁上或者在位于的微珠的表面上)。例如可以设计第一和第二寡核苷酸分别杂交到模板的5’和3’。该方法包括在每个阱中平均引入一个模板，其中例如将模板的5’杂交到第一寡核苷酸并将模板的3’杂交到第二寡核苷酸，形成桥。在核苷酸和聚合酶存在下，核酸由第二寡核苷酸的3’开始延伸。变性、杂交和延伸的反复循环将导致一群扩增模板。

但是一般而言，由于所有无性系扩增模板是固定的对于固相扩增不需要密封帽(可拆卸密封)，且在阱的上面将有试剂的恒定流动。

核酸模板的扩增和测序反应优选在相同的阱中进行。

在优选实施方式中，该半导体芯片和微流体结构均为一次性的。具有一次性传感装置的优势为通过消除在使用间的交叉污染的任何可能性以最大化测序的精确性。进一步的优势是提供用于临时性隐藏或隔离在阱中的表面上固定的寡核苷酸的装置的能力。如果传感装置不是一次性的则其是不可能的。以下将进一步详细描述这样的用于临时性隐藏在阱中的表面上固定的寡核苷酸的装置，但可能包括在阱的表面上的蜡层(wax layer)。

使用传感装置的实施方式

对于有效测序，可取的是在每个阱中的测序反应包括核酸模板的唯一物种。当扩增模板(扩增子)被用于测序时，可取得是每个无性系扩增反应开始于单一的核酸模板。

有限稀释方法

在这种具体实施方式中，传感装置的每个阱用多个通用引物改性且限制所提供的模板的数量。也就是说，通用引物已经被固定到阱壁的表面和/或包含在阱中的微珠的表面。如前面所描述的，已制备用于扩增和测序的模板，包括衔接通用接头到模板的末端的步骤.

当将样品流入阱中时，通过在通用接头和通用引物之间的杂交将核酸模板结合到阱。

作为结果的阱的种群可以被分为三种类：不包含核酸模板的阱；包含一个核酸模板的阱；以及含有2以上核酸模板的阱。这些类别的分布可以通过泊松分布(Poissondistribution)模拟。不同类别的阱的预期分布取决于模板数量与阱数量之间的比率。在模板多于阱的地方，分布将偏向于阱有2个以上的核酸模板。在阱多于模板的地方，分布将偏向于阱不含有模板。

基于泊松分布模型，已计算出提供给阱的模板的数量(计数模板副本)与阱的数量之间的最佳比率为1:1。在这个最佳比率下，仅具有一个单个模板的阱的数量为阱的总数的37％。该比率可以在2:5和2:1之间，这样具有单个副本的阱的百分数仍为约25％。通过经浓缩或稀释调整样品中的模板的数量可以调整该比率。

应当指出的是，比率的变化没有成正比于分布偏差(distribution bias)的变化。像这样，比率上的显著变化对于看到分布上的微小变化偏差是必要的。因此，仅对确定样品中模板副本计数的粗略估计(rough estimate)以获得最佳分布偏差(distribution bias)是必要的。

在一种给定样品中，模板副本计数将落入预期的范围内。该范围被称为自然样本变化(natural sample variability)。在模板副本计数被认为超出可接受的变化的情况下，存在确定、或“控制”模板副本计数的方法。一个这样的方法为在扩增和测序之前进行附加的扩增步骤，其中试剂(例如引物)的浓度为限制因素。因此，在这个附加扩增步骤之后，可以设置该核酸模板副本计数为基于限量溶剂的浓度的预定量。

用于控制模板副本计数的另一种方法为向样品添加已知数量的捕获位点，例如在微珠上，并随后清洗去除过量的核酸模板。然后可以在溶液中释放结合到微珠的模板以获得预定量。

一旦核酸模板在阱中杂交，则可以通过清洗步骤去除任何未杂交的模板。然后用扩增反应混合物填满阱。用于PCR或其他扩增技术所需要的试剂为本领域所熟知且在前面已提及。一旦反应混合物在阱中，则以可拆卸密封密封该阱。然后在密封阱中进行扩增反应，密封防止阱之间模板的任何交叉感染。在扩增期间，该扩增模板杂交到固定的通用引物并因此固定在阱中。一旦扩增反应完成，密封被去除并且清洗阱以去除任何未结合的模板。该模板可以任选地经历变性步骤以确保用于测序反应的所有模板为单链。在应用变性步骤的地方，还需要额外的清洗步骤以去除参与变性步骤的任何试剂。

随着用于测序的扩增模板已准备好，将DNA聚合酶流入池中且允许结合到模板。然后将多轮单个核苷酸从阱上流过，并在每轮核苷酸之间有清洗步骤。ISEET检测随着每轮流入阱中的核苷酸是否存在pH的变化，pH的变化示意核苷酸插入新生链中。然后编译从每个阱获得的模板的序列以形成样品中的原始核酸(nuleic)模板的序列。

区分从没有模板的阱或有两个以上模板的阱得到的测序是可能的，因此，必要时放弃这些，在实时数据处理期间或者后处理期间。没有模板结合到阱的阱将没有模板扩增因此将没有扩增模板。像这样，从这些阱中将没有获得测序结果。有2个以上模板的阱将在扩增步骤后具有扩增模板的2以上物种的副本。像这样，在测序期间，这些阱可能为超出预期的多轮核苷酸提供插入反应的指示。此外，相比于带有扩增模板的一个物种的阱，在这些阱中，对每个插入反应的pH变化将更弱。

单一捕获位点

在另一个实施方式中，唯一模板(unique tempales)的分布可以通过控制阱中的捕获位点(即固定的寡核苷酸)的数量改善。在该情况中，以超过阱/结合位点的数量充分地提供模板。通过限制捕获位点的数量为每阱一个将可能确保每个阱将仅具有与其结合的单个模板。该捕获位点为固定的寡核苷酸，优选为通用引物。

在一种实施方式中，在每个阱中，存在包含单个固定的寡核苷酸的单个微珠。这可以通过使用相对于阱足够大的捕获微珠获得，这样每个阱可以仅持有单个的捕获微珠。

可选择地，可以设置阱的表面仅持有单个微珠。例如，在表面上具有特定于微珠材料的络合剂的区域的尺寸可以仅容纳单个捕获位点。该微珠可以包括茜素(Alizarin)且在阱表面上的区域可能为铝，通过沉积铝或刻蚀阱表面直至铝层而形成。作为第二个实施例，可以对电极(优选参比电极)充电以吸附微珠(可以反向充电)，电极的面积仅足够容纳单个捕获微珠。

在已提供有已固定在阱表面的寡核苷酸的阱的地方(优选通用引物)，该寡核苷酸将需要从样品中的模板隔离开，这样模板从阱上流过时它们无法杂交。替代地，在阱中可获得的唯一捕获位点将会在微珠上。可以通过用容易去除的的材料(例如蜡)覆盖阱的内表面以隔离该寡核苷酸。

一般而言，蜡可以用灭活蛋白质代替。

在一种优选实施方式中，可以以在阱的内表面上有蜡涂层或层提供传感装置的阱，该蜡可以为石蜡。然后通过本领域所熟知以及前述描述的方法向每个阱添加单个微珠。当寡核苷酸或捕获位点需要在扩增期间获得与产生的扩增模板杂交时，仅暂时性分离寡核苷酸或捕获位点。该蜡涂层(其还可以被称为层)将足够深以遮盖寡核苷酸。同时，该阱不应该充满蜡涂层或层因为这将消除阱。蜡涂层或层的适宜厚度可以在10nm-100nm范围内。该蜡涂层可以通过蒸发或、喷墨分配器(inkjet dispenser)或者通过蜡溶液从微流体装置上流过以应用。

可选择地，通过可逆性末端终结(reversible terminator)或其他用于阻断杂交或扩增的公知技术可以创造出最初不可获得的多重捕获位点，然后当去除未结合模板时被去除。或者可以是单个结合位点比额外结合位点具有不同的结合化学过程(公知)，这意味着仅单个位点适合于捕获最初的副本，反之其他位点适合于捕获扩增子。

在提供传感装置的阱的地方，在阱壁的表面上没有固定的寡核苷酸，没有必要在阱壁内部涂覆蜡。可以在扩增微珠上供应用于扩增模板的替代的额外位点，优选地该位点足够小以适于在阱中的捕获位点的周围并且提供高表面积与体积比。该捕获位点涉及已结合到单个模板的微珠，限制到每个阱一个。该“扩增”微珠可以在模板杂交到捕获微珠后和在经清洗步骤去除任何未结合的模板后向每个阱供应。该“扩增”微珠可以为10nm-100nm。

与前述描述的一样，样品中的核酸模板已经被制备用于扩增和测序，优选包括末端衔接模板和通用接头的步骤。

模板从阱上流过，这样将单个模板结合到每个阱中的单个微珠。通过清洗步骤去除任何未结合、过量的模板。在一种优选实施方式中，然后通过应用加热熔融蜡涂层，优选通过传感装置的加热装置制作，且任选地通过清洗步骤从阱中去除蜡。在扩增过程期间，作为阱加热的结果，可以留下该蜡涂层以熔融。

用含有用于扩增反应所必要的试剂的扩增反应混合物填充满阱。一旦反应混合物在阱中，用可拆卸密封密封该阱。

然后在密封阱中进行扩增反应，该可拆卸密封防止阱之间模板的任何交叉污染。在扩增期间，该扩增模板杂交到固定的寡核苷酸(优选通用引物)且因此固定在阱中。一旦完成扩增反应，去除密封且清洗阱以去除试剂或任何未结合模板。该模板可以任选地经历变性步骤以确保所有用于测序反应的模板为单链。在应用变性步骤的地方，还需要额外的清洗步骤以去除任何涉及变性步骤的试剂。

随着扩增模板已为测序准备好，将DNA聚合酶流入阱中并允许结合到模板。然后从阱上流过多轮单个核苷酸，在每轮核苷酸之间有清洗步骤。ISEET检测随着每轮流入阱中的核苷酸的任何pH变化，pH的变化示意核苷酸插入新生链中。然后编译从每个阱获得的模板的序列以形成样品中的原始核酸(nuleic)模板的序列。

在另一个实施方式中，在每个阱中提供带有单个捕获微珠的芯片。可以提供与该芯片分离的“扩增”微珠，作为配套元件的部分。

在进一步的实施方式中，除了ISFET外，还可以确定通过在每个阱中添加FET将单个模板结合到阱中。该FET将起测量结合电荷的作用。在每个阱中使用参比电极以在阱中局部(locally)应用(applied)正电荷。可以单独控制电极。正电荷可以从在阱上方的溶液中吸引负电荷模板进入阱中。在第一个模板结合到固定的寡核苷酸(通用引物)时，通过FET检测结合电荷。监控FET的输出信号的控制器可以由参比电极切断电极电位以预防下一个模板(further templates)被吸引进入阱中，该FET可以为ISFET或可以在阱中还有另一个晶体管，优选地测量结合到FET表面的DNA的电荷。该FET表面可以含有固定的通用引物，但数量有限且当模板杂交到这些引物时，FET检测单个分子的电荷且FET可以引发ISFET参比电压以在特定的阱中关闭。这样可以为无性系扩增步骤的制备创造出模板的单个副本。

一旦所有单个阱具有结合到阱的单个模板，通过清洗的步骤可以去除任何未结合、过量的模板。然后用包含所必要的试剂的扩增反应混合物填充满该阱。然后用可拆卸密封密封该阱。

然后在密封阱中进行扩增反应，该可拆卸密封防止阱之间的模板的任何交叉污染。在扩增期间，扩增模板杂交到固定的寡核苷酸(优选通用引物)且因此固定在阱中。一旦完成扩增反应，去除密封并清洗阱以去除任何未结合的模板以及用于扩增的试剂。该模板可以任选地经历变性步骤以确保所有用于测序反应的模板为单链。在应用变性步骤的地方，还需要额外的清洗步骤以去除任何涉及变性步骤的试剂。

随着扩增模板已为测序准备好，与DNA聚合酶的结合一起测序引物在模板上杂交。然后从阱上流过多轮单个核苷酸，在每轮核苷酸之间有清洗步骤。ISEET检测随着每轮流入阱中的核苷酸的任何pH变化，pH的变化示意核苷酸插入新生链中。然后编译从每个阱获得的模板的序列以形成样品中的原始核酸模板的序列

序列特定捕获

在另一个实施方式中，模板的分布可以通过使用针对于确定的序列的捕获位点(即固定的寡核苷酸)改进，这是预料的，但可能不仅存在于模板的子群(sub-group)(即确定比例)中。当在上面描述的先前的实施方式中使用时，这样特定的捕获位点与任意地结合到给定样品中的模板的所有物种(通过通用引物和通用接头之间的杂交)的通用引物形成对比。实施例包括特定于细菌的16SrRNA or 23S rRNA指纹区的引物。尽管并非所有结合的模板必须是相同的或副本，但阱中的引物与这些指纹区域内的保守区域互补将选择性地与源自细菌的模板结合。

可选择地，该引物可以是针对被添加到单个起始模板的标签，在此情况下通过仅捕获源子单个起始片段的扩增子在阱中创建单克隆种群(monoclonal population)。在这个实施方式中使用的样品的准备可以不需要将模板与通用引物末端衔接。该模板可以与特定的接头衔接，称为“条形码”。条形码可以通过各种已知手段包括在样品制备中，包括衔接或通过在扩增引物中简单地包含条形码序列。通过标记扩增子的初始物种(initialstarting species)，条形码确保扩增子自排序进入在ISFET上的单克隆簇中。

通过限制每个阱以包含用于特定序列的寡核苷酸，可能会确保仅包含定义的序列的模板将结合到每个阱，由此去除在阱之间的模板的交叉污染的风险。因此，在扩增期间可能就不需要可拆卸密封了。

尽管每个阱将具有特定的引物，但聚集多个阱成为区域，阱的每个区域具有特别类型的引物(例如细菌引物或病毒引物)，这样单个芯片可以包含多个不同序列的特定引物。在给定区域中的引物因此可以全部是与条形码或保守区域互补，而且此外，区域中的每个阱将与不同靶向碱基或靶向序列是互补的以检测变异(variant)。因此在芯片的给定区域中的反应活性可以表明菌属的普遍存在而且随后的测序可以确定细菌的种类或物种的等位基因变异(allele variant)。

在上述任一实施方式中，可以在阱外扩增模板以创建扩增模板的数个混合种群。

将扩增模板流入阱中以允许模板在阱中杂交。只有包含了与序列特定的引物互补的定义的序列的模板将结合到阱。在模板在阱中杂交后，通过清洗步骤去除任何未杂交的模板。然后可选择地用包括必须试剂的扩增反应混合物填充满该阱以提升信号强度。用于扩增的所需试剂为本领域所熟知且在前述已经提及。

在任选的扩增步骤期间，扩增模板杂交到固定的寡核苷酸(‘引物)并固定到阱。清洗该阱以去除扩增反应的试剂和任何未结合的模板。该模板可以任选地经历变性步骤以确保用于测序反应的所有模板为单链。在应用该变性步骤的地方，同时还需要额外的清洗步骤以去除任何涉及变性步骤的试剂。

随着模板已为测序准备好，将DNA聚合酶流入阱中并允许结合到模板。然后从阱上流过多轮单个核苷酸，在每轮核苷酸之间有清洗步骤。ISEET检测随着每轮流入阱中的核苷酸的任何pH变化，pH的变化示意核苷酸插入新生链中。然后编译从每个阱获得的模板的序列以形成样品中的原始核酸模板的序列

下面给出了本发明的一种非常具体的实施方式且，尽管优选，主要提供用作范例的目的。其涉及一种扩增在阱中发生的实施方式，但是其可以等同地应用到扩增发生的其他地方。

1)取包括相关核酸(模板)的样品和制备样品，优选断裂的；

2)将制备的样品添加到多个(至少2个，但或许1000个或数百万个)阱，该井包含适用于模板扩增的引物；

3)该阱还包含聚合酶及核苷酸的源(例如dNTPs)-这些可以随模板添加或可以早已存在；

4)该阱可以任选地包含一个以上的微珠，但引物中的至少一个必需通过位于阱内表面上(或者阱或室的内表面，或者如果存在微珠则在微珠上)的寡核苷酸被固定(直接或间接)；

5)对于等温扩增模板的扩增发生在60-65℃或者对于PCR在合适的温度；

6)一旦获得扩增的充足水平(可以由装置的数量而定，包括单循环的次数或时间，优选通过如在我们早期qPCR出版物中的ISFET)，取决于所需的信号强度，通过清洗清除扩增试剂和任何未结合(即没有固定)的模板，保留(leaving)固定的模板；

7)单个dNTP的波被通过或通入阱中并且每个ISFET检测对应每个波是否在该阱有质子释放，以致质子释放(因为核苷酸插入)与基于固定的链的增长(新生)链的序列相符，因此提供固定的链的序列(通过它的编译(compliment)，通过聚合酶将dNTP添加到新生链)；

8)发生ISFET数据的核对并确认序列。

还提供了一种扩增核酸模板的方法，接着对扩增模板测序，该方法包括以下步骤：

A)将核酸模板与扩增试剂结合以形成混合物，所述试剂包括聚合酶、多个dNTP和用于核酸扩增的引物；

B)在离子敏感装置中向多个阱提供A)中的混合物，其中离子敏感装置包括ISFET传感器、加热器和温度控制，而且其中每个阱中与至少一个ISFET传感器相接触；

C)在阱中进行核酸扩增；

D)确认阱中的扩增模板的序列。

本发明还提供了扩增核酸模板的方法，接着对扩增模板测序，其中扩增和测序两者在芯片上的同一个阱中进行，该方法包括以下步骤：

A)将核酸模板和扩增试剂混合，扩增试剂包括聚合酶、多个dNTP以及第一和第二引物，其中第一引物能够结合到第一单链核酸模板物种，并且第二引物能够结合到第二单链核酸模板，其中第二单链核酸模板物种与第一单链核酸模板物种为互补；

B)在离子敏感装置上将A)中的混合物与多个阱接触，这样每个阱平均包括核酸模板的一个单个副本，其中每个阱包括固定在固体载体表面的寡核苷酸而且其中寡核苷酸的序列与第一引物的至少部分相同，其中寡核苷酸能够结合到第一单链核酸模板物种；

C)用密封帽覆盖阱；

D)通过用第一和第二引物扩增核酸模板进行核酸的扩增反应，且其中优选产生第一单链核酸模板物种以及第一单链核酸模板物种能够结合到第一引物和固定在固体载体上的寡核苷酸；

E)延伸寡核苷酸以形成第二单链核酸模板物种，其中第二单链核酸模板物种的序列与杂交到寡核苷酸的第一单链核酸模板物种为互补；

F)去除来自C)的密封帽；

G)将固定的核酸模板变性，其中仅第二单链核酸模板物种结合到固体载体；

H)向阱中添加测序引物和聚合酶，其中测序引物杂交到第二单链核酸模板物种的3’区域；

I)向阱中添加一个核苷酸；

J)如果核苷酸被水解和结合(incorporated)则检测由质子释放引起的pH变化；

K)清洗阱以去除未结合的核苷酸；

L)重复I-K以构建(delineate)核酸模板的序列。

优选地，装置包括ISFET传感器、加热器和温度控制，且其中每个阱与至少一个ISFET传感器相接触。

应该理解的是，在上述论述中已公开了一些步骤且技术人员将理解这些步骤可以被结合和一些步骤被省略，作为适当地提供创建或集合模板的种群方法或装置(在相关区域至少是相同的)，在阱中固定模板。这些步骤的顺序可以改变并且每个步骤的程度可以再合理范围内变化以便在给定时间和费用及条件下获得所需序列结果。根据结构和所需条件已描述装置和方法以在大量阱中获得相关结果，但技术人员应该理解该由于在元素和统计变化中的误差、质量变化将不会在每个阱中获得这个结果。

Claims (16)

1.一种用于模板多核苷酸扩增的阵列，该阵列包括：

多个阱，每个阱与ISFET相接触；

多个捕获微珠，每个捕获微珠包括单独的模板结合点，其中所述阱与捕获微珠是尺寸对应的，仅一个捕获微珠适合于每个阱；

可拆卸密封，所述密封安排用于覆盖所述阱并将每个阱与相邻的阱充分隔离；和

加热元件。

2.根据权利要求1所述的阵列，其中，每个微珠包括单独的固定的寡核苷酸。

3.根据权利要求2所述的阵列，其中，所述寡核苷酸为捕获位点，用于捕获测序用模板。

4.根据权利要求1或2所述的阵列，其中，所述微球是链霉亲和素珠，所述寡核苷酸是生物素链接的寡核苷酸。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的阵列，其中，所述微珠由含有无机物、天然聚合物和合成聚合物的组中的任意一种制造。

6.根据权利要求5所述的阵列，其中，所述微珠由含有纤维素、纤维素衍生物、玻璃石英、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶和聚丙烯的组中的任意一种制造。

7.根据权利要求6所述的阵列，其中，所述琼脂糖凝胶为Sephadex(R)。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的阵列，其中，所述微珠适合于共价附着。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的阵列，其中，所述微珠为磁性的。

10.根据权利要求1所述的阵列，其中，所述微球带有约束到所述微球表面的化学基团以能够附着寡核苷酸。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的阵列，其中，所述可拆卸密封为液体，优选为矿物油。

12.根据权利要求1-10中任意一项所述的阵列，其中，所述可拆卸密封为柔性膜。

13.根据权利要求12所述的阵列，其中，所述微球包含粘结剂。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的阵列，其中，所述加热元件为电阻式加热元件。

15.根据权利要求1-14中任意一项所述的阵列，其中，所述阵列包含温度传感器。

16.一种用于多个模板多核苷酸的扩增和测序的传感装置，该装置包括：

半导体芯片，所述半导体芯片具有多个ISFET；

微流体结构，所述微流体包含多个权利要求1-15中任意一项所述的阵列，其中每个阱与ISFET中的至少一个相接触；

扩增装置，所述扩增装置用于扩增模板多核苷酸，且包括至少一个加热装置，所述加热装置适于在高于室温的温度下引导模板多核苷酸的扩增，其中设置所述阱以在每个阱中创建无性系种群；以及

测序装置，所述测序装置用于测序每个阱中的模板菌落。