CN108025304B - 含有具有空间分离的珠保留和信号检测段的珠孔几何结构的流体装置和相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种流体装置，其包括多个反应孔，所述反应孔典型处于密集阵列中并且具有与至少一个信号检测段流体连通并且空间分离的至少一个珠保留段。相应的珠保留段可以被配置成保持可以具有与其附连的试剂的单个珠。

Description

含有具有空间分离的珠保留和信号检测段的珠孔几何结构的 流体装置和相关方法
相关申请
本申请要求2015年7月22日提交的美国临时申请序列号62/195,381的优先权的权益，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
联邦支持声明
本发明利用在由DOD国防部高级研究计划局(Defense Advanced ResearchProjects Agency，DARPA)授予的批准号HR0011-12-2-0001下的政府支持做出。政府具有在本发明中的某些权利。
发明领域
本发明涉及流体装置。
背景
聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)的片段的高度敏感的方法。PCR具有许多应用，例如检测痕量核酸以确定导致疾病的生物的存在、基因表达、基因分型、基因改造或修饰、和法庭科学应用。PCR扩增提供了对大范围分析物浓度的杰出的靶标鉴别和量化。然而，借助PCR的许多分析物的同时和定量的分析已经被证实是极其挑战性的。基于嵌入染料荧光的检测仅能够确定总dsDNA浓度，并且因此使用这种检测方法不能进行在单个反应容器中的多个模板的同时分析。荧光探针技术(即TaqMan、分子信标、或其他化学反应)可以用于低水平的反应多重化，因为每种靶标可以使用不同颜色的荧光探针作为信号报告蛋白而扩增。探针也是序列特异性的，降低来自引物二聚体形成或非特异性扩增的假阳性。用常规微量滴定板或微流体实时PCR(rt-PCR)进行多重化的典型方法上使用少量的反应孔，每个反应孔均含有三种不同颜色的探针。然而，通常认为设计多重化引物和探针集合是挑战性的，因为它们需要额外水平的仔细设计和优化以确保彼此的相容性。借助这种方法的多重化由于的仪器和染料之间的光谱重叠而最终限于四色检测，而一种颜色通常为内部标准品染料预留。
图1A和1B示出了常规的圆柱形或锥形珠孔。形状和/或有限的体积可能会就溶液体积限制为珠附近的区域。珠背景荧光(对于聚苯乙烯珠来说明显的，尤其是在短波长下)或荧光染料编码(用于多重化测定)生成明显的背景信号，而这样的明显的背景信号可以明显降低测定信噪比。此外，一些检测染料与珠结合并且提供高的背景信号(在阳离子和/或疏水染料和羧基官能化的聚苯乙烯珠的情况中尤其是这样)。此外，在测定读数(readout)期间珠也可以在珠孔中移动不希望的量，使得它们的背景荧光的背景减法是显著的。
发明实施方案概述
本发明的实施方案提供了新型珠孔几何结构，其可以从孔中的溶液的相邻区域中分离相应的珠以提高针对孔中的测定信号检测的信噪比。
本发明的实施方案涉及流体装置，其包括多个反应孔，其特征在于所述反应孔具有至少一个珠保留段和与所述至少一个珠保留段流体连通的至少一个空间上分离的信号检测段。
所述装置可以是微流体芯片并且所述反应孔可以作为反应孔的阵列而提供。
反应孔可以具有1aL至约1μL之间、任选约10aL至约1μL之间或任选约1fL至约1μL之间的体积容量。
所述至少一个珠保留段可以被调整尺寸并且被配置成仅保持相应的单个珠。
所述至少一个分离的信号检测段中的至少一个可以具有端部，所述端部与所述至少一个珠保留段中的一个或多个的距离L为靶标珠直径的.3X至约100X之间、通常1至100μm之间、任选1至10μm之间。
可以将所述至少一个珠保留段调整尺寸并且配置成保持具有在约10nm至约1mm之间、典型在约100nm至约1mm之间的直径的微球形珠。
所述至少一个珠保留段可以具有的宽度介于被保持在其中的相应珠的直径的约101％至约195％之间。
所述分离的至少一个信号检测段可以包括细长通道，所述细长通道的宽度小于相邻珠保留段的宽度。
所述至少一个珠保留段可以是单个珠保留段。
所述至少一个珠保留段可以是多个珠保留段。
所述至少一个分离的信号检测段可以是多个分离的信号检测段。至少一对相邻的珠保留段可以通过所述至少一个信号检测段的细长通道隔开。所述细长通道可以具有与所述相邻的一对珠保留段的宽度和深度相比较窄并且较浅的宽度。
所述至少一个珠保留段可以是多个珠保留段，并且所述珠保留段各自具有共同的尺寸。
所述至少一个珠保留段可以是多个珠保留段，并且所述珠保留段中的至少一个具有与至少另一个不同的尺寸。
相应珠孔的反应体积可以是被调整尺寸并且被配置成通过相应珠保留段保持的珠的体积大约2X至200X之间那么大。
所述珠孔可以以在约6,000孔/cm2至约2,000,000孔/cm2之间的密度提供。
所述珠孔的所述保留段和/或所述信号检测段可以具有逐渐变小的和/或直的壁。
所述至少一个信号检测段中的一个或多个可以具有与所述至少一个珠保留段隔开一定距离并且与所述至少一个珠保留段流体连通的环形流体通道。
所述珠孔可以具有通过具有更窄宽度的直线流体通道流体连接的第一和第二隔开的端部。
所述第一端部可以具有圆形周长并且限定第一珠保留段，并且所述第二端部可以具有圆形周长并且限定第二珠保留段。
与所述第二端部相比，所述第一端部的直径和/或深度可以较大或较小。
其他实施方案涉及使用具有以上特征中的任何一种的装置通过对来自反应孔的至少一个信号检测段的编码的珠信号和/或测定信号进行电子检测来对分析物进行处理、检测或分析的方法。
所述对测定信号进行电子检测可以被配置成检测来自相应反应孔的所述至少一个信号检测段的阳性测定信号。
任选地，所述对信号进行电子检测可以在反应之后进行而不需要在反应之前的基线读数。
任选地，所述对信号进行电子检测可以被配置成在进行测定之前检测来自相应反应孔的所述至少一个信号检测段的编码的信号。
可以对含有多于一种类型的珠的阵列进行所述对信号进行电子检测，每种珠类型以独特识别标志(任选不同强度水平的荧光染料的组合)编码并且每种类型以不同的试剂官能化以允许检测不同的分析物或不同的化学反应。
另外的其他实施方案涉及制造微孔的方法。所述方法包括向至少一个基板中或上形成多个紧密相距的反应孔，所述反应孔具有至少一个珠保留段和与所述至少一个珠保留段流体连通的至少一个分离的信号检测段。相邻反应孔的珠保留段的中心线可以隔开1至20μm之间的距离，并且所述至少一个信号检测段从所述至少一个珠保留段的中心线延伸一定距离L，所述距离L是靶标珠的直径的.3X至100X之间、任选1μm-20μm以上之间、典型为1mm以下。
其他实施方案涉及分析系统。所述系统包括控制器，与所述控制器通信的检测器，和图像处理器，所述图像处理器具有被配置成鉴别在保持反应孔的装置的所述反应孔的信号检测段中存在的信号的模块。所述反应孔具有至少一个珠保留段和至少一个分离的信号检测段，所述信号检测段从所述至少一个珠保留段延伸一定距离并且与所述至少一个珠保留段流体连通。所述模块被配置成鉴别与从所述至少一个珠保留段延伸一定距离的信号检测段相关的阳性测定信号，并且任选地，其中所述鉴别在反应之后进行而不需要在所述反应之前来自所述检测器的基线读数。
所述模块可以被配置成基于鉴别的阳性测定信号或者在进行测定之前或期间进行珠解码。
所述模块可以被配置成鉴别在单个反应孔的第一和第二分离的珠保留段中保持的至少两个珠。所述孔可以具有与所述珠保留段之一或二个流体连通的至少一个信号检测段。
相邻反应孔的珠保留段的中心线可以隔开1至20μm以上之间的距离。
所述至少一个信号检测段可以从相应反应孔的所述至少一个珠保留段的中心线延伸一定的距离L，所述距离L是靶标珠的直径的.3X至200X之间、任选1-20μm以上之间。
要指出的是，针对一个实施方案描述的本发明的多个方面可以结合在不同的实施方案中，尽管未针对其具体描述。也就是说，全部实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留改变任何最初提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以独立于和/或结合任何其他一个或多个权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以该方式要求保护。在以下给出的说明书中详细地解释了本发明的这些和其他目的和/或方面。本领域普通技术人员将会根据对以下优选实施方案的附图和详细描述的阅读而理解本发明的另外的特征、优点和详情，这样的描述仅是说明本发明。
附图简述
结合在说明书中并且构成说明书的一部分的附图说明了本发明的实施方案，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。
图1A是现有技术珠孔阵列的顶视图。
图1B是在图1A中所示的常规珠孔的侧透视图。
图2A是根据本发明的实施方案的示例性珠孔阵列的顶视图。
图2B是在图2A中所示的珠孔的侧透视图。
图3A是根据本发明的实施方案的另一种示例性珠孔阵列的顶视图。
图3B是在图3A中所示的珠孔的侧透视图。
图4A是根据本发明的实施方案的又一种珠孔的顶视图。
图4B是在下图4A中所示的珠孔的侧透视图。
图5A是根据本发明的实施方案的具有阻挡的另一种示例性珠孔的顶视图。
图5B是根据本发明的实施方案的具有阻挡的又一种示例性珠孔的顶视图。
图6A是根据本发明的实施方案的示例性微流体芯片的顶视图。
图6B和6C是根据本发明的实施方案的用于在图6A中所示的微流体芯片的示例性可连接基板的顶视图。
图6D是根据本发明的实施方案的示出任选的间隔体的微流体芯片的截面图。
图6E是根据本发明的实施方案的示出在相邻反应孔之间使用密封剂的示例性微流体芯片的截面图。
图7A是在30个PCR循环之后孔阵列的一部分的荧光显微图像。
图7B是来自12个阳性和3个阴性反应孔的荧光信号的图表。1拷贝/50fL反应的较高有效浓度得到≈11个循环的早期Ct。
图8A是在Si晶片中的连接的珠和反应孔DRIE的明视场显微图像。
图8B示出了与在图8A中所示的相似的阵列的明视场显微图像并且示出加载有根据本发明的实施方案的珠。
图8C是示出根据本发明的实施方案的在加载有3.3μm直径Promag珠的阵列中的珠的高背景荧光的荧光显微图像。
图9A和9B是根据本发明的实施方案的来自第10次循环(在扩增之前被检测，图9A)和第30次循环(在扩增之后，图9B)的荧光图像。
图10A示出了仅针对用于30次rt-PCR循环的六个阳性孔(实线描记图)和三个阴性孔(虚线描记图)的对珠孔区域的平均的原始荧光信号的图表。
图10B是针对根据本发明的实施方案的这些相同珠，仅根据信号检测段(狭缝)孔区域平均的原始荧光信号的图表。
图11A示出了在密封之前在相应孔中的珠的图像，并且图11B示出了在密封之后数分钟的图像。
图12A和12B示出了具有通过注塑成型制造并且加载有珠的珠孔阵列的聚合物装置的实例。在图12A中示出了具有珠的装置的SEM，并且在图12B中示出了加载的阵列的荧光显微图像。
图13A和13B是示出根据本发明的实施方案的利用热压纹制造的阵列的SEM图像，其使用了DRIE蚀刻的硅模具(图13A)进行制造以在塑料/聚合基板中制造牛眼形(bullseye-shaped)孔(图13B)。
图14A-14D是根据本发明的实施方案的具有两个或多个珠保留几何结构的反应孔的实例的顶示意图。
图15A-15C是根据本发明的实施方案的具有多于两个珠保留几何结构的反应孔的实例的顶示意图。
图16是根据本发明的实施方案的分析系统的示意图。
图17-19表示本发明的实施方案的示例性方法的流程图。
发明实施方案详述
现在将在下文中参照其中示出本发明的实施方案的附图和实施例描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施并且不应被解释为限于在本文中给出的实施方案。相反，提供这些实施方案以使得本公开将会是全面且完整的，并且将会向本领域技术人员充分传达本发明的范围。
相似的数字始终是指相似的元件。在附图中，为了清楚，可以将某些线、层、组件、元件或特征的厚度放大。在文字和附图中，针对“图”的缩写“FIG.”和“Fig.”可以可互换地使用。
仅出于描述具体实施方案的目的而在本文中使用的术语并非意在限制本发明。如在本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也意在包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。要进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包含”和/或“包括”规定所述的特征、步骤、操作、元件、和/或组件的存在，但是不排除添加一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、组件、和/或它们的组的存在。如在本文中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列举项的任何一个和全部组合。如在本文中所使用的，短语如“在X至Y之间”和“在约X至Y之间”应当被解释为包括X和Y。如在本文中所使用的，短语如“在约X至Y之间”意指“在约X至约Y之间”。如在本文中所使用的，短语如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非另外定义，在本文中使用的全部术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。要进一步理解的是，术语，如在常用词典中所定义的那些，应当被解释为具有与它们在说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度正式的意义来解释，除非在本文中明确地那样定义。为了简洁和/或清楚，可以不对公知的功能或结构详细描述。
应理解的是，当提到元件在另一个元件“上”、与另一个元件“附连”、与另一个元件“连接”、与另一个元件“偶联”、与另一个元件“接触”等时，其可以直接在另一个元件上、与另一个元件附连、与另一个元件连接、与另一个元件偶联或与另一个元件接触，或者也可以存在介于中间的元件。相反，当例如提到元件“直接在”另一个元件“上”、与另一个元件“直接附连”、与另一个元件“直接连接”、与另一个元件“直接偶联”或与另一个元件“直接接触”时，不存在介于中间的元件。本领域技术人员还要理解的是，提及与另一个特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与所述相邻特征重叠或位于所述相邻特征以下的部分。
为了方便描述可以在本文中使用空间相关术语如“在......以下”、“在......下方”、“下部”、“在......之上”、“上部”等，以描述如在附图中所示的一个元件或特征与另外一个或多个元件或一个或多个特征的关系。应理解的是，除了在附图中描绘的方向之外，空间相关术语意在包括装置在使用或操作中的不同方向。例如，如果将在附图中的装置倒置，则被描述为在其他元件或特征“以下”或“之下”的元件之后定向在另外的元件或特征“之上”。因此，示例性的术语“在......以下”可以包括“在......之上”和“在......以下”的方向二者。可以将装置另外定向(旋转90度或在其他取向上)并且相应地解释空间相关的描述符。类似地，在本文中仅出于解释目的而使用术语“向上”、“向下”、“竖直”、“水平”等，除非具体地另外指出。
应理解的是，尽管可以在本文中使用术语“第一”、“第二”等以描述多种元件，这些元件不应被这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件与另一个元件进行区分。因此，以下讨论的“第一”元件也可以被称为“第二”元件，而不违背本发明的教导。操作(或步骤)的顺序不限于在权利要求或附图中给出的顺序，除非具体地另外指出。
术语“微芯片”和“微流体芯片”可互换使用并且是指基本上平面的、薄的装置。微流体芯片可以是刚性的、半刚性的或柔性的。术语“薄”是指10mm以下如在10mm至0.1mm之间、并且可以是约3mm、约2.5mm、约2mm、约1.5mm、约1mm、或约0.5mm的厚度尺寸。微芯片典型具有小于约6英寸、更典型在约1英寸至6英寸之间的宽度和长度。然而，在一些实施方案中，微芯片可以更长，如长度和/或宽度在一英尺以上。微芯片可以具有小于长度尺寸的宽度尺寸。在一些实施方案中，微流体芯片可以具有约2.13英寸(54mm)的宽度尺寸和约3.4英寸(85.5mm)的长度尺寸。微芯片可以包括微米尺寸和/或纳米尺寸的流体通道。
术语“主要尺寸”是指流体通道的宽度和/或深度尺寸。
就流体通道而言，术语“微米尺寸”和“微流体”是指具有亚毫米或更小尺寸的宽度和/或深度的流体流动通道(例如，术语包括微米和纳米尺寸通道)并且包括具有至少一个宽度和/或深度在数毫米以下、典型小于900微米且大于1nm的尺寸范围内的区段的通道。
珠孔阵列的珠孔的通道可以具有侧壁和形成为一个或多个基板的底板，从而具有开放的上表面和封闭的下表面以及在它们之间延伸的侧壁。可以使用一个或多个间隔体、顶部基板、膜或盖。顶部基板、膜或覆盖可以密封、覆盖或封闭反应孔的一个或多个流体通道和/或阵列的上表面。
术语“约”是指可以在+/-20％以下如+/-10％之间变化的参数。
术语“珠”是指适用于反应孔的固相部件，如粒子、颗粒或微球，典型是磁性微球，其可以是一种或多种多孔的、表面多孔的、或无孔材料，如聚合物、光致抗蚀剂、塑料、玻璃、二氧化硅、金属或半金属氧化物(包括但不限于氧化铝、氧化钛、氧化锆或其他氧化物)、量子点、金属粒子等。
术语“回路”是指完全地硬件实施方案或将软件和硬件组合的实施方案。
在样品中的分析物可以是来自例如包括多种混合物(包括合成的和生物大分子、纳米粒子、小分子、DNA、核酸/多聚核酸、肽、蛋白等)的样品的任何目标分析物。分析物可以是一种或多种分析物分子。样品或样品的分析物可以包括一种或多种极性代谢物，如氨基酸或带电分子、分子、肽、和蛋白。样品和/或分析物可以另外或备选地包括从生物流体、血液、血清、尿液，干燥血液、细胞生长培养基、裂解细胞、饮料或食物中提取的分子。样品可以另外或备选地包括环境样品，如水、空气或土壤。
术语“寡核苷酸”是指至少约五个核苷酸至约500个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)的核酸序列。在一些实施方案中，例如，寡核苷酸可以是约15个核苷酸至约50个核苷酸，或约20个核苷酸至约25个核苷酸，其例如可以用作聚合酶链式反应(PCR)扩增测定中的引物和/或用作杂交测定中或微阵列中的探针。本发明的寡核苷酸可以是天然的或合成的，例如，如在本领域内公知的DNA、RNA、PNA、LNA、修饰的主链等，或它们的任何组合。
探针和引物，包括用于扩增和/或检测的那些探针和引物，是任何适合长度的寡核苷酸(包括天然存在的寡核苷酸如DNA和合成和/或修饰的寡核苷酸)，但是典型长度为5、6、或8个核苷酸，多至长度为40、50或60个核苷酸，或更多。可以将这样的探针和或引物固定在固体载体上或与固体载体偶联(固体载体比如是珠、芯片、针、或微量滴定板孔)，和/或与可检测基团偶联或用可检测基团标记，可检测基团比如是荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素、或酶。
聚合酶链式反应(PCR)可以根据已知技术进行。参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188。通常，PCR包括，首先，将核酸样品(例如，在热稳定DNA聚合酶的存在下)与针对待检测的特定序列的每条链的一个寡核苷酸引物在杂交条件下进行处理，从而合成与每个核酸链互补的每个引物的延伸产物，并且引物与特定序列的每条链充分互补以与其杂交，从而由每个引物合成的延伸产物当与其互补序列分离时可以充当用于另一个引物的延伸产物的合成的模板，并且之后这些变性条件下处理样品以在存在待检测的一个或多个序列的情况下将引物延伸产物与其模板分离。循环重复这些步骤直到得到所需的扩增程度。通过向反应产物中加入能够与反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，所述探针携带可检测标记物，并且之后根据已知技术检测，或者通过在凝胶上的直接可视化，可以进行扩增的序列的检测。也可以通过将嵌入染料加入至反应混合物中并且监测将会与双链DNA的总质量成比例的荧光信号强度来检测扩增的序列。尽管针对PCR反应描述了根据本发明的实施方案，但应理解的是，可以使用其他核酸扩增方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，包括等温扩增技术如滚环扩增或环介导的等温扩增(LAMP)，并且也可以使用核酸测序方法。
DNA扩增技术，如前述的，可以包括使用探针、一对探针、或两对探针，所述探针与含有目标多态性或突变的DNA特异性结合，但是在相同杂交条件下不与不含有目标多态性的DNA结合，并且所述探针充当用于在扩增反应中的DNA或其一部分的扩增的一个或多个引物。这样的探针在本文中有时被称为扩增探针或引物。
术语“试剂”是指加入至系统中从而产生化学反应或者加入以查看是否发生反应的任何物质或化合物，包括引物、核酸模板和扩增酶。扩增试剂是指除了引物、核酸模板和扩增酶之外的通常用于扩增的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂连同其他反应组分一起放置并且容纳在反应容器(试管、微孔等)中。
如在本文中所使用的术语“磁性”包括铁磁性、顺磁性和超级顺磁性性质。
通常，用于检测含有目标多态性或突变的寡核苷酸探针是与编码所述突变或多态性的DNA结合、但是在相同杂交条件下不与不含有突变或多态性的DNA结合的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针用适合的可检测基团如以下给出的那些可检测基团标记。这样的探针在本文中有时被称为检测探针或引物。
参照图2A、2B、3A、3B、4A和4B，它们示出了具有用于改进的信号检测的几何结构的珠孔10的实例。如在图1A和1B中所示，常规珠孔10具有被配置成保持珠的圆形周长(典型是圆柱形或锥形的孔)。相比之下，根据本发明的实施方案的珠孔10含有具有与邻近珠保留段11的信号检测段15流体连通的珠保留段11的几何结构。
珠孔10可以以紧密相距的珠孔10的相对密集的阵列10a设置。珠孔10可以在行和列上对齐或者彼此偏置。孔10可以以规则的重复形式、不规则的重复形式、或其他形式设置。术语“密集”意指流体分析装置的占用空间可以具有约100-6000之间的孔10/mm2和/或10,000至5,000,000之间的孔10/cm2，典型约6,000至约2,000,000之间的孔10/cm2，更典型约500,000至约2,000,000之间的孔10/cm2。
相邻孔10的一些或全部可以具有1μm-10mm之间的分隔距离，如约1μm，2μm，3μm，4μm，5μm，6μm，7μm，8μm，9μm，10μm，11μm，12μm，13μm，14μm，15μm，16μm，17μm，18μm，19μm，20μm，100μm，200μm，300μm，400μm，500μm，600μm，700μm，800μm，900μm，1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm，或甚至更大以及在这些之间的任何分数，即测量相应的相邻珠保留段11的中心线到中心线的距离。
孔10的一些或全部可以全部是与扩增试剂配合的反应孔10。孔10的一些或全部可以具有亚pL的反应体积。
信号检测段15可以任选包括短和/或细长流体通道15ch，其将信号检测段15e的末端与珠保留段11连接。信号检测段15可以包括与珠保留段11隔开一定距离“L”的末端15e，典型隔开靶标珠的直径的30％至约10,000％(.3X至约100X)之间，更典型靶标珠的直径的约.3X至约20X之间。在一些实施方案中，L可以在靶标珠的直径的1X至5X之间。例如，对于3.2μm直径的珠来说，长度L可以在约1至约640μm之间，更典型在1至32μm之间，并且在具体的实施方案中可以在约3.2至16μm之间。为了清楚，具有字母“X”的数字是指倍数，一倍(1X)、十倍(10X)等。
在一些实施方案中，L可以在约1μm至10mm以上之间，典型多至约1mm或约100μm，更典型在1至20μm之间，如约1μm，约2μm，约3μm，约4μm，约5μm，约6μm，约7μm，约8μm，约9μm，约10μm，约11μm，约12μm，约13μm，约14μm，约15μm，约16μm，约17μm，约18μm，约19μm，和约20μm。可以从珠保留段11的中心线或从将珠保留段11与信号检测段15e的末端连接的通道15c上画出的使珠保留段的直径完整的线测量长度L。
图2A和2B示出，可以将信号检测段15配置为典型具有比珠保留段11的宽度小25％-75％的宽度的窄通道或“狭缝”。
图3A和3B示出，信号检测段15可以具有曲率半径小于珠保留段11的曲率半径的弓形的端部15a。珠保留段和弓形末端15e的中心线之间的距离“d”可以与以上讨论的长度“L”相同。
图4A和4B示出，信号检测段15可以具有含有包围内部向上突出部件19的环形通道17的末端。突出部件19可以具有足以在信号检测段15的环形通道17中的流体上方延伸的高度。这种构造可以限定包括具有环形形状的部分的光学可检测信号。
珠孔10的新的几何结构被认为是改善了在基于微珠阵列的技术中的检测。这些孔几何结构可以被配置成使得孔11的一个区域用于磁性加载和珠保留，并且孔15的另一个区域可以(主要或仅仅)用于信号的检测。在一些实施方案中，在孔10的珠区域11中加载珠25(在图2A、3A和4A的每一个中，以孔之一中的实心圆举例示出)之后，可以使用对本领域技术人员来说已知的方法(如不可溶混流体密封或顶住另一个表面如衬垫或其他基板)在孔10中分离小体积的试剂流体。
尽管在图2A、2B、3A、3B、4A和4B中示出了一些示例性实施方案，但是其他实施方案可以包括其他几何结构，所述其他几何结构典型被配置为使得珠保留区域11具有开口直径为珠25的直径的约101-195％之间、并且在一些实施方案中可以为约105％至150％之间的口袋或储罐。在珠保留区域11中的孔的深度可以为珠直径的约50％至185％之间。
图5A和5B示出，孔10可以包括可以阻挡珠保留段11中的珠25的物理阻挡物16。阻挡物16可以允许流体从珠保留段进入信号检测段15。在抑制或防止珠25迁移离开保留区域11的同时，阻挡物16可以处于横跨上表面，向孔10的底部向下延伸一定距离和/或浸没在孔中的流体液面以下。阻挡物16可以完全或部分横跨反应孔10的相对的侧壁延伸。
与在珠保留段11处的孔相比，在一些或全部信号检测区域15处的孔10的深度可以是相同的、更深的或更浅的。深度可以随着通道15ch远离珠保留段11而减小。深度可以随着通道15ch远离珠保留段11前往信号检测段15的末端而增加。孔10的壁可以在向孔10内的方向上向外或向内逐渐变小。
不同的孔10可以具有不同的体积容量、几何形状形式和/或尺寸。
在一些实施方案中，信号检测段或区域15可以具有通道15ch，如靶标珠不能通过物理方式进入其中的口袋或狭缝或其他几何形状。区域11、15二者液体连接，从而从珠25中释放的试剂和/或分析物可以在孔10的整个共用溶液体积中扩散或混合。通过将珠25与检测区域11空间分隔，可以降低或消除珠荧光对信号的作用，提高信噪比。
孔10的几何结构可以在增加相应反应体积的同时允许反应孔的高的、独占(single occupancy)加载，潜在地提高反应效率。
如在图6A-6E中所示，微流体装置50可以包括具有多个孔10的孔阵列10a。孔10可以在珠保留段11中将珠25保持。珠25可以任选包括与其附连的引物并且可以任选预加载至孔10的珠保留段11中。装置50可以包括附连在一起的上部和下部基板50u、50b(图6B、6C)。上部基板50u可以与下部基板50b相同或不同。基板50u中的一个或两个可以是刚性的并且包括例如玻璃、石英、硅、或适合金属。基板50b中的一个或两个可以是聚合物，如有机硅或其他聚合物材料(如PMMA、COC、COP、PDMS、PP、PE、PTFE、或Kapton(聚酰胺)，以及许多其他的)，并且其可以提供珠孔10a的阵列。上部或下部基板50u可以具有与孔10流体连通的至少一个端口50p。例如，反应孔10可以任选是垂直的以在试剂填充和/或油密封期间流经具有孔10a的阵列的阵列腔室；然而，可以使用其他排列构造。
图6A示出，微流体芯片50可以被配置为使得珠孔10a的阵列占据具有密集阵列孔的占用空间“F”(通常在1mm至10cm之间)。如对本领域技术人员来说公知的，流体微芯片50可以包括可以与阵列10a流体连通的用于样品和试剂或其他化学添加的一个或多个输送通道。
图6D示出了可以位于上部和下部基板50u、50b之间的任选的间隔体50s。间隔体50s可以限定一些或全部相应孔10的侧壁。间隔体50s可以包括用作衬垫和间隔体二者的光致抗蚀剂。
图6E示出，如对本领域技术人员来说公知的，密封剂75如密封油可以将相邻的具有珠25的孔10分离。可以另外或备选地使用一个或多个疏水膜。密封剂75(例如，油)可以在底部基板50b的顶部之上延伸。密封剂75可以具有与间隔体/衬垫50s相关的厚度或深度。密封剂75可以覆盖除珠/反应孔10以外的任何物质。密封剂75可以包括矿物质、有机硅、基于烃或氟代烃的油和/或蜡或它们的任何组合或混合物。反应溶液23，例如水溶液，典型不接触顶部基板50u。
对于涉及扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)或以模拟或数字检测模式使用荧光信号读数的酶联免疫吸附测定(ELISA)的基于珠的测定来说，这种技术可以是特别有利的。在这些测定中，通过磁珠捕获零个、一个、或多个分析物分子。之后可以将磁珠加载至微孔阵列10a中，该微孔阵列10a具有限制珠25的加载量为一或零个珠/孔10的几何形状。可以在具有珠25的每个反应孔10中密封小体积的扩增试剂，并且可以进行化学反应以在存在分析物分子的情况下产生荧光信号。之后可以对测定荧光信号进行测量、处理、并且将其用于确定样品中的分析物浓度。
致密阵列中的单重反应(Singleplex Reactions in a Compact Array，SiRCA)是使用微珠阵列形式的大规模平行扩增和检测方法，其具有同时对许多不同靶序列进行数百、或数千至数百万个单独的单重rt-PCR反应的潜力。参见，例如，美国专利申请序列号14/402,565，其描述了例如用于在空间中多重化的微流体装置上的平行测定的试剂的基于珠的递送；该文献的内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
进行在低分析物浓度下的单拷贝数字量化和在高分析物浓度下的多拷贝模拟rt-PCR量化的能力提供了具有aM LOD的大的动态范围。在一些实施方案中，阵列10a可以与附连至染料编码的、链霉抗生物素蛋白标记的、磁性微球或珠的生物素化引物的单独集合一起使用。可以制造含有多至数十至数百种珠类型的珠集合文库，每种珠类型具有针对不同靶序列的不同引物集合，并且可以根据意愿向珠混合物中加入新的珠集合。当将珠混合物与分析物DNA或RNA一起温育时，附连至珠的引物起杂交探针的作用，捕获并且纯化对该珠特异性的核酸序列。可以通过将珠磁力分离并且洗涤来移除样品基质干扰物(外部DNA、RNA、细胞膜组分等)。在清除之后，加入聚合酶、dNTP、和嵌入染料，并且将珠加载至单独的孔10中并且使用不可溶混的油或疏水膜彼此密封。不同于手持移液或试剂印刷，将单独的编码的引物珠随机加载至单独的微反应孔中可以在大约数秒至数分钟内完成。与通过稀释至液滴或不含有为珠捕获设计的区域和/或用于孔10的单独检测区域的反应孔中的随机分离相比，将珠磁性加载至优化的几何结构中可以是更高效的。链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用在低于50℃的温度下是非常稳定的；然而，在PCR期间用于变性的高温可能会使得随后引物在引发靶标DNA扩增的第一次rt-PCR循环期间释放。
为了评价SiRCA在亚pL反应中的性能，在具有通过在硅中的深度反应性离子蚀刻(DRIE)制造的直径为3.7μm、深5μm(具有≈50fL的体积的圆柱形)和10μm的中心到中心间距的孔的阵列的硅流体芯片中进行不具有使用引物和gDNA的珠的初步测试。因此，在具有游离在溶液中的引物和gDNA而不具有珠的≈50fL的圆柱形反应孔中进行rt-PCR。用在庚烷中的辛基三氯硅烷将芯片预处理以使表面是疏水的。用乙醇、之后用水将芯片润湿，并且之后用加载缓冲液(20mM Trizma、50mM KCl、2.5mM MgCl2、1％BSA、和0.1％Tween 20)封闭。将预混液(master mix)(具有0.0625单位/μL额外铂TaqDNA聚合酶、0.5％BSA、2.7μM引物、来自变异链球菌(Smutans)的gDNA、和3x SYBR Green的1x Platinum Quantitative PCRSuperMix-UDG)加入至芯片中并且之后通过芯片牵拉Krytox GPL104全氟化油以将反应体积彼此密封。图7A是示出在30个PCR循环之后的芯片的荧光显微图像，并且图7B示出了针对12个阳性孔和3个阴性孔的荧光信号的图表。与一拷贝/孔(1拷贝/50fL或≈3pM)相关的模板的较高浓度得到仅11个循环的Ct。
随着反应孔直径降低，聚苯乙烯珠的背景荧光可能会成为更大的问题。在之前使用4-25pL SiRCA反应的工作中，反应孔直径是大约25-50μm，比珠(珠体积≈20fL)的3.3μm的直径大得多。因为珠孔位于孔的中心，所以可以将珠背景荧光忽略或者作为背景信号减去。对于亚pL反应的高密度阵列来说，圆柱形珠孔实际上是反应孔，并且珠荧光可以是主要的信号。珠背景荧光在阵列的成像期间光漂白，导致信号的净减少，而与PCR扩增产生的荧光信号无关。此外，在将在小体积孔中的珠密封和热循环的初步研究期间，在某些尺寸下，例如≈4.5μm直径、≈5μm深，在循环之间观察到珠在孔中移动，使得背景减法困难。
在SYBR Green(一种在双链DNA扩增子的存在下提供测定信号的嵌入染料)的约497nm/520nm的最佳激发/发射下，聚苯乙烯珠的自发荧光高。此外，SYBR Green可以与珠相互作用，并且可以引起珠荧光的大幅增加。测试具有更长波长的激发/发射最大值的其他嵌入染料以试图降低珠背景荧光对测定信号的作用，但是它们无法产生比用SYBR Green在1x-15x的浓度下所观察到的更强的荧光信号。使用可以将测定信号与珠的亮背景空间分离的装置可能会是合乎需要的。
评价非圆柱形反应孔几何结构在SiRCA中的使用以避免珠背景荧光并且增加反应体积。图8A是在Si晶片中的连接的珠和反应孔DRIE的明视场显微图像。在孔的左手侧上的珠孔段直径为≈3.5-3.7μm；在右手侧上的检测孔段直径为≈2.1μm。连接它们的通道宽为≈2.0-2.1μm宽和7.4μm长。深度可以为约≈5μm，提供大约150fL的反应体积。图8B示出了显示加载有珠的类似阵列。图8C是示出在加载有3.3μm直径Promag珠的阵列中的珠的高背景荧光的图像。在磁性加载的情况下看到了高占用率，并且观察到相对较少的双倍加载的情况。珠的高背景荧光是明显的。
新的反应孔10、10’可以解决珠背景荧光的问题。为高效PCR提供足够试剂体积的设计为致密阵列维持了高的反应孔密度，并且将珠物理分离，并且评价其来自检测区域的荧光信号。珠孔保留段11可以与作为窄狭缝的通道15ch流体连接(图8A)。珠孔保留段11可以略微大于珠直径，并且检测狭缝可以小于珠直径，以允许加载单个珠/孔结构。图8B示出了使用磁性加载技术(如通过引用结合在本文中的美国专利申请序列号14/402,565中描述的)加载至孔中的3.3μm Promag珠的明视场显微图像。
尽管检测狭缝降低可以匹配至给定占用空间中的单独反应孔的数量，典型性地减少2倍，但是对于给定的占用空间(在这个实例中>6kdmm2或600k/cm2)来说，高加载占用率维持了被加载的孔的高密度。可以进行优化以确定用于反应的密封的最佳孔间距，最可能得到较高的孔密度。观察到相对较少的双倍加载的情况，但是由于珠异质性，一些较小的珠有时加载至检测孔或连接狭缝中。这是容易检测的，并且可以将那些孔从分析中排除。用具有范围为≈100至150fL的反应体积的孔制造原型，并且珠置换大约20fL。
使用用针对在疟原虫属(Plasmodium)物种之间保守的18S rRNA基因的引物官能化的涂布有链霉抗生物素蛋白的Promag珠在这些孔中测试SiRCA。简而言之，将≈350k引物标记的珠在来自在温育时浓度为≈4k寄生物/μL的疟疾血液样品的40μL的核酸提取物中温育30min。将珠洗涤，并且将试样量加载至芯片中。预混液(具有1x额外SYBR Green、0.5％BSA、和0.125单位/μL的铂Taq聚合酶的Kapa SYBR FAST)加入至芯片中并且用KrytoxGPL104油密封。图9A/9B示出了来自第10次循环(在检测到扩增之前)和第30次循环(在扩增之后)的荧光图像。阳性孔在图9B中用圈显示。
SiRCA在具有反应体积为≈150fL的非圆柱形珠孔的装置中进行。示出了第10次循环(图9A)和第30次循环(图9B)之间的比较，并且可以通过在狭缝和较小孔中的荧光的增加来鉴别阳性孔(在图9B中用带有可见的“尾部”的圈显示)。加载多于一个珠的孔可以容易地鉴别并且从分析中丢弃。
在远离珠的背景荧光的空间中读取测定信号的能力使得在亚pL孔中使用SYBRGreen的情况下SiRCA成为可能。这通过将来自珠孔区域的平均信号与来自狭缝和检测孔的平均信号比较来说明。图10A示出了仅来自针对在图9B中所示的六个阳性孔和三个阴性孔的珠孔区域的平均荧光信号。归因于珠的高背景信号，在阴性和阳性孔之间差异并非容易地视觉辨识。如果将仅来自孔的狭缝(检测)区域的信号作图(图10B)，则可以通过在大约15个PCR循环之后荧光信号的明显增加而容易地将阳性反应孔与空白进行区分。可以在全部区域中看到光漂白。对芯片表面和/或缓冲液的改性或信号处理校正可以降低在稍早循环中的检测区域中的高背景。
图10A示出了在30次rt-PCR循环期间仅针对六个阳性孔(实线描记图)和三个阴性孔(虚线描记图)的对珠孔区域的平均的原始荧光信号的图表。图10B是针对这些相同珠的仅根据狭缝和检测孔区域平均的原始荧光信号的图表。
还在ELISA测定中基于由塔夫茨大学(Tufts University)和QuanterixCorporation推广的单分子阵列(SiMoA)形式测试具有狭缝几何形状的珠孔10a的阵列(例如，图2A、2B)，以确定将珠背景荧光(其可能是显著且变化的)与测定信号解偶联能否可以提供信噪比增强，以错误确定阳性反应。图11A/11B示出了将用抗TNF-α抗体标记的珠用于捕获TNF-α抗原的实例。将针对抗原的生物素化二级抗体用于将链霉抗生物素蛋白缀合的β-半乳糖苷酶分子附连至被珠捕获的抗原。将珠加载至阵列中并且用针对酶标记物的荧光底物密封。图11A示出了在密封之前的珠的图像，并且图11B示出了在数分钟之后的图像。在图11A中，可以在密封之前通过背景荧光看到在孔(8)中的珠，并且在图11B中，测定读数是明确的，显示出5个阳性。
在五(5)个容纳有珠的孔中，可以在孔的测定区域中看到清楚的信号，并且三(3)个容纳有珠的孔仅显示出背景荧光。明确地确认阳性反应的能力可以通过移除珠背景荧光的影响并且在发生底物的明显转化之前(时间零或T0图像)消除将阵列成像的需求来提高SiMoA测定的准确性。因为反应进行得非常快速，如果成像系统缺少足够的分辨率或覆盖一个或数个图像中的全部阵列的视场，则可能不能得到大阵列的T0图像。通过读取分离区域中的测定信号，可以在反应已经进行之后扫描阵列，并且可以将多个图像拼接在一起或者询问或组合以创建全部阵列的图像而不丧失准确性。此外，适应新型孔几何结构的实施方案的珠孔中的更大的试剂体积意味着更多的底物分子，并且因此对于每个反应来说，可以得到更多潜在的荧光团。
含有具有珠保留段11和信号检测段15形状的这些孔几何结构的阵列10a的制造可以在任何适合的材料中实现，并且不限于硅或玻璃。例如，可以使用如热压纹或注塑成型的方法制造具有孔阵列10a的聚合物基板。图12A和12B示出了具有通过注塑成型制造并且加载有珠的珠孔阵列10a的聚合物装置的一个实例。在图12A中示出了具有珠的装置的SEM，并且在图12B中示出了加载的阵列的荧光显微图像。
图13A和13B是示出利用热压纹使用DRIE蚀刻的硅模具(图13A)制造以在塑料/聚合基板中制造牛眼形(bullseye-shaped)孔的阵列的SEM图像。图13A还示出了含有2μm内径的环的4°锥形非圆柱形模具，并且图13B示出了相应的塑料/聚合复制品。
例如，在图14A-14D和15A-15C中，本发明的实施方案包括具有被配置成容纳有多于一个珠的几何结构的反应孔10’，从而可以在一个或多个示出的指定检测区域处或备选在珠的表面上研究从一个或多个珠中释放的试剂之间的反应和在溶液中或在一个或多个珠的表面上的反应或这些反应的任何组合。珠孔阵列10a可以包括如下变体情形：其中在单个基板或流体装置上或在单独的基板或装置上，一些孔10保持一个珠25、一些孔10’保持两个珠25、和一些孔10’保持多于两个珠25。在孔10’包括多于一个珠保留段11的情况下，多个(典型每个)珠保留段11可以通过信号检测段如流体通道15ch彼此流体连通。
图14A-14D和15A-15C示出了一些示例性构造，其可以在简单过程中利用迅速产生混合物组合的多个重复的能力，所述简单过程与对于每种研究的成分来说需要用户加入液体试剂的其他组合方法相比大幅降低用户互动(interaction)和劳动。可以将这些孔10’设计为具有两个以上的珠保留段11a和11b和任选的11c(图15A-15C)以加载两个以上的珠25(通过举例的方式在图14D中示出)，并且分离的读数/检测段或区域15(典型在宽度和/或深度更小的区域)通过通道15c流体连接。如示出的，珠孔保留段11a、11b(11c)可以是相同或不同尺寸的。具有另外形状或数量的珠的迭代是可行的。尽管示出了两个和三个珠保留段，孔10’可以被配置成具有大于三个珠保留段11并且可以具有不同的几何形状。
本发明的实施方案所预期的珠孔10、10’的用途不限于基于PCR或ELISA的测定。阵列10a可以用于其中其可以有利于将携带试剂或分析物的珠与一定体积的试剂和测量和/或检测相应信号的区域或范围空间分离的任何过程或方法。
在一些实施方案中，新型珠孔10可以在降低测试不同引物集合以评估它们在多重化反应中的相容性所需的单调(tediousness)和花费的方法中使用。存在复杂的预测软件，以使用多种准则分析并且建议PCR引物以提高引物特异性并且避免引物二聚体的形成；然而，现有技术水平的软件仅能够提供必须在先导PCR实验中通过经验测试的建议的序列。这种预测、测试、和再设计的循环是实验者之间很常见的问题，并且耗费资源和时间。未预测的引物二聚体或脱靶扩增产生于多种机制，包括非典型的碱基相互作用、低的酶保真度、被聚合酶忽略的引物序列错配、和SNP序列或意外的实验序列的存在。在多重PCR反应中这种过程甚至更复杂，在使用含有来自多种生物的核酸的情况下尤其是这样。
引物二聚体形成可以明显地降低PCR反应的效率并且导致假阳性，挫败测序工作、和/或扩增子的其他下游分析。传统上，引物集合必须以不同组合进行混合以确定是否有两个以上的组对彼此相互作用以形成无意扩增子(二聚体)。如果需求将许多集合整合至单个反应中(例如，10-50个集合)，则对于被修饰以降低非特异性产物的集合的初期筛选以及重新测试来说，测试可能会需要数千个反应。如果制造各自具有不同引物集合的多个编码的珠集合，可以将它们混合在一起并且加载至装置上，作为单个试样量以代替单独移液的试剂溶液。如果将珠加载至将捕获两个以上珠25的反应孔几何结构10’的微孔阵列10中(例如，图14A-14C、15A-15C)，则可以容易地实现引物集合的随机混合。PCR则可以显示在将阵列解码之后在每个引物集合的组合之间的不希望的相互作用的存在，以确定在每个反应中的每个珠的身份。因为可以在单个装置中存在数百万个这样的反应孔，将会存在全部可能组合的许多重复，以提供用于分析的丰富数据集合。
在相似的实施方案中，针对不同参考基因组筛选多种引物集合可以使用加载多于一个单珠的阵列完成。为了确定对引物集合的靶标特异性，重要的是，不仅针对它们的预期靶标而且还针对可以在相关样品中存在的多种生物的核酸筛选引物集合。尽管可以使用序列数据库消除许多可能的相互作用，单是仍然需要经验测试，因为序列通常不完整并且现有技术水平的算法远非完美。例如，应当针对为病原量化设计的每个测定筛选宿主基因组DNA和多种相关细菌物种和病毒血清型。如果应用于微生物组(microbiome)研究，可能需要比较数百至数千个不同的、有时非常密切相关的物种。可以通过将生物的基因组片段化并且将片段附连至编码的珠(使用如将片段生物素化并且随后用编码的、链霉抗生物素蛋白官能化的珠温育的方法)来制造参考基因组珠。通过将编码的引物集合珠的文库与编码的参考基因组珠的文库混合，研究人员将能够在单个测定中针对两个脱靶扩增进行筛选并且确认它们的预期靶标的扩增效率。可以通过使用用于引物的较小珠和用于基因组的较大珠(或反之亦然)高效率地将引物珠与基因组珠组合。在这种情况中，反应孔可以含有通过窄狭缝连接的大珠孔和小珠孔(图9B)。如果首先将较大的基因组珠加载至大珠孔中，则较小的珠孔将会是未被占据的。在这个步骤之后，可以高效率地将较小的引物珠加载至较小的珠孔中。这种方法可以避免在反应孔中的不想要的引物-引物和基因组-基因组组合。在这个和其他方法中，并非必须将两种试剂从珠中释放，因为参考基因组珠可以、但并非必须需要保留它们的试剂，而从珠中释放的引物与它们相互作用并且在检测区域中产生可测量的信号。
在另一个实例中，可以同时将这种原理应用于许多临床或实验室样品的核酸分析(nucleic acid profiling)。可以在单个珠集合上捕获来自单个生物的核酸如mRNA或lncRNA的序列。之后可以通过将由来自许多不同个体的核酸提取物制成的不同方式编码的珠组合来产生文库。对于针对如上所述的引物珠文库的靶标，之后可以筛选这个文库，以鉴别单核苷酸多态性(SNP)、基因表达、或其他现象。
可用于实施本发明的方法的试剂盒通常可以包括任选与用于实施所述方法的适合说明书一起包装的具有与其附连的试剂的一个或多个珠集合和用于实施如上所述的方法的其他试剂如限制性酶。试剂盒还可以包括用于收容包括在其中的元件的容器。这样的容器包括，但不限于瓶、具有珠孔阵列的微流体芯片和盒(cartridge)，包括预装珠装置。
在一些实施方案中，珠25可以具有与其附连的引物。引物可以是一对生物素化引物，并且珠25可以是链霉抗生物素蛋白标记的从而发生生物素化引物与珠的结合。在一些实施方案中，珠25可以包括标记物，如光学标记物，所述标记物可以在分析期间使用以鉴别锚定至相应珠25的引物。例如，可以标记相同或不同尺寸的不同的编码的珠，以用于在分析期间鉴别不同的附连的引物集合。可以使用多种预编码方法以在珠25上提供标记物，包括单独使用或与其他编码方法组合使用的预定的尺寸、形状、磁性性质和/或荧光掺杂。定制序列生物素化引物和链霉抗生物素蛋白标记的顺磁性磁珠二者都可以容易地购自商业供应商或在适当装备的实验室中以适合的量制备。
如以上指出的，尽管根据本发明的实施方案还在本文中针对PCR反应进行了描述，但应理解的是，在本文中描述的微流体装置、珠和反应方法可以用于多种其他反应，例如在将试剂从珠切割至孔中以参与反应的情况下。例如，任何核酸转录和/或扩增相关的反应或测序反应均在本发明的范围内，包括但不限于PCR反应、实时PCR(rt-PCR)、数字PCR(dPCR)、RNA向cDNA的逆转录(RT)、来自之前RT步骤的cDNA的PCR(RT-PCR)、使用实时或数字量化的RT-PCR、免疫PCR(iPCR)及其变体、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环复制、和/或非酶核酸扩增方法(例如，“DNA回路”)。在本发明的范围内包括的其他反应包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(SiMoA)或数字ELISA、其中荧光底物与支持表面结合以在随后反应的某个点裂解的ELISA、其中使用多个珠递送不同试剂以用于组合化学的反应、其中珠递送催化剂试剂的反应、和/或其中以通过随机珠加载确定的化学计量递送“点击”化学试剂的反应。
图16是分析系统200的示意图。系统200可以包括与电子信号检测器220(如包括相机或其他成像装置的光学检测器或其他信号检测装置)通信的至少一个控制器210(典型包括至少一个处理器)。信号检测器220被配置成检测相应微流体芯片50的珠孔阵列10a的信号。控制器210可以与具有被配置成鉴别在反应孔的信号检测段中是否存在测定信号的模块221(例如，计算机程序)的图像处理器211通信。图像处理器模块221可以完全或部分在控制器和/或信号检测器220上或远离控制器和/或信号检测器220。图像处理器模块221可以被配置成将孔的多个测定后的图像组合以评估孔是否具有阳性读数。图像处理器模块221可以从相应孔的珠保留段中将背景噪声移除。模块221可以被配置成鉴别来自相应孔的一个或多个检测段的信号的存在以鉴别是否出现阳性测定反应。
图17是可以用于实施根据本发明的实施方案的分析方法的示例性操作的流程图。提供具有珠孔的流体装置；珠孔具有珠保留段和与珠保留段流体连通的隔开的信号检测段(方框250)。在将珠保留在相应珠保留段中的同时从孔的信号检测段获得信号(方框260)。
在这些和/或其他实施方案中，可以从含有珠的段中(即直接从珠中)读取编码信号以确定珠可能会含有什么试剂和/或分析物。以这种方式，可以将阵列解码以确定阳性或阴性测定信号的含义。可以通过本领域技术人员已知的手段将珠光学编码，包括以一种或多种强度水平、珠直径、珠形状、或定义的和/或可观察或可检测的性质的任何组合借助一种或多种染料的荧光染料染色。
可以将珠孔排列为限定反应孔的珠孔的密集阵列(方框252)。珠保留段可以具有与珠的直径相同或大于珠的直径的几何形状和直径，并且信号检测段具有宽度小于珠的直径的几何形状。(方框254)。
信号检测段可以包括比珠的直径窄的细长通道并且珠孔几何形状可以被配置成具有下列各项中的一种或多种：(a)狭缝，(b)通过细长通道隔开的非对称圆形周长，(c)牛眼形式(即，细长通道并入环形通道中)，(d)多个隔开的圆形和/或曲线周长，其通过在其之间延伸的至少一个细长通道连接(方框256)。
可以将珠保留段调整尺寸并且配置成仅保持单个磁珠(方框257)。
珠孔可以容纳有一种或多种扩增试剂(方框258)。
检测段可以与相应珠保留段隔开距离L，所述距离L在靶标珠的直径的.3X至200X之间、例如1μm至1mm以上之间、通常1-100μm之间(方框259)。
如果存在分析物分子，则信号可以包括荧光信号(具有尾部)(方框261)。
图18是制造根据本发明的实施方案的示例性装置的方法的流程图。在基板中将孔的阵列图案化(例如，形成)；孔可以具有在1aL至100μL之间、更典型在1fL至1μL之间的体积容量，以及在具有在1mm至10em之间的线性尺寸的限定的占用空间中的一个或多个限定的几何结构，所述限定的几何结构包括与信号检测段流体连通的珠保留段，所述信号检测段与珠保留段空间分离(方框300)。
可以通过蚀刻将孔的阵列形成为基板(方框302)。
可以将孔的阵列成型为基板(方框304)。考虑了其他制造方法，例如光刻、FIB研磨、压纹、冲压等。
珠孔可以具有直径在约3.2-3.7μm的范围内的珠保留段，其并入具有在约2-3μm之间的宽度和在靶标珠的直径的.3X和200X之间(例如，在一些实施方案中，在1μm至10mm之间、在1μm至1mm之间、在1-100μm之间和/或在1-10μm之间)的长度L的通道中，形成信号检测段(方框306)。
将基板灭菌并且设置在包装和/或试剂盒中以用于使用与孔配合的磁珠对靶标分析物进行流体分析(方框308)。
孔可以是具有一种或多种扩增试剂的反应孔。
孔的阵列可以以6000/mm2至约10,000/mm2、典型约6,000/mm2的密度排列(方框312)。
孔的阵列可以以在10,000/cm2至约2,000,000/cm2之间的密度提供(方框314)。
珠保留段可以具有宽度与靶标(例如，磁性)珠的直径相同或在其约195％以内(即在靶标珠的直径的101％至195％或150％之间)的周长(方框316)。
孔可以具有在100-150fL之间的反应体积和20fL的珠体积(方框318)。
图19是评价根据本发明的实施方案的测定的方法的流程图。从反应孔的多个信号读数段中对测定信号进行电子检测，所述信号读数段与在相应珠保留段中由孔保持的珠分离(方框350)。术语“电子”是指基于机器的检测的所有形式(并非人的视觉)如相机，例如CCD相机、SEM等。信号可以是强度、荧光、一种或多种限定的颜色、限定的像素参数(包括光散射性质(透明度)的改变、透射率或吸光度的改变、化学发光或不同参数的组合)等的增加。
在发生反应以鉴别阳性之后，可以从各自具有与珠保留段分离的信号读数段的珠孔的阵列中对测定信号进行电子检测(方框352)。
信号读数段包括具有小于一个或多个珠保留段的直径的宽度和/或深度的细长通道(方框354)。
信号读数段包括与一个或多个珠保留段流体连通的环形流体通道(方框356)。
测定信号用于基于PCR或ELISA的测定(方框358)。
可以使用相同尺寸的珠或不同尺寸的珠将多个引物集合针对彼此或针对不同的参考基因组进行筛选，至少两个珠通过具有两个(任选不同尺寸的)珠保留段和至少一个分离的读数段的单个反应孔保持(方框360)。
测定信号可以用于使用限定的珠集合对临床或实验室样品进行核酸分析(方框362)。
前述是说明本发明而不应被解释为对其进行限制。尽管已经描述了本发明的一些示例性实施方案，但是本领域技术人员将会容易理解的是，这些本质上不背离本发明的新的教导和优点的情况下，在示例性的实施方案中许多修改是可行的。因此，所有这样的修改均意图包括在如在权利要求中所限定的本发明的范围内。因此，应该理解的是，前述是说明本发明而不应被解释为限于所公开的具体实施方案，并且对公开的实施方案的修改以及其他实施方案均意图包括在所附权利要求的范围内。本发明由以下权利要求以及包括在其中的权利要求的等同物限定。

Claims (31)

1.一种流体装置，所述流体装置包括：
多个反应孔，所述多个反应孔各自具有至少一个珠保留段和至少一个空间上分离的信号检测段，所述信号检测段与所述至少一个珠保留段流体连通，其特征在于所述至少一个空间上分离的信号检测段包括细长通道(15ch)，所述细长通道沿长度方向(L)延伸，并且在垂直于所述长度方向(L)的方向上延伸的宽度小于相邻珠保留段的宽度且小于靶标珠的直径，其中相邻反应孔的珠保留段的中心线隔开1μm至1mm之间的距离，并且其中所述至少一个分离的信号检测段中的至少一个具有与所述至少一个珠保留段中的一个或多个珠保留段相距一定距离的端部，所述距离为靶标珠直径的0.3X至200X之间，并且其中所述多个反应孔形成在上部基板和下部基板之间，并且所述装置包括将所述反应孔彼此密封的密封剂。
2.权利要求1所述的装置，其中所述装置是微流体芯片并且所述反应孔以反应孔的阵列形式提供，其中所述细长通道的宽度比所述相邻珠保留段(11)的宽度小25％-75％。
3.权利要求1所述的装置，其中所述反应孔具有在1aL至100μL之间的体积容量。
4.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段的尺寸和构造被配置成仅保持相应的单个珠。
5.权利要求4所述的装置，其中沿所述至少一个分离的信号检测段延伸的长度方向的所述距离在1μm至1mm之间。
6.权利要求4所述的装置，其中沿所述至少一个分离的信号检测段延伸的长度方向的所述距离在1μm至10μm之间。
7.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段的尺寸和构造被配置成保持直径在100nm至1mm之间的微球形珠，并且其中所述至少一个珠保留段的宽度在被保持在其中的相应靶标珠的直径的101％至195％之间。
8.权利要求1所述的装置，其中所述多个反应孔以反应孔的阵列形式提供在具有在1mm至10cm之间的线性尺寸的限定的占用空间中，其中所述装置还包括在上部基板和下部基板之间的间隔体和密封剂，其中所述上部基板或所述下部基板包括与所述反应孔流体连通的至少一个端口，并且其中所述反应孔各自包含反应溶液，所述反应溶液不接触所述上部基板并且通过所述密封剂彼此密封。
9.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段是单个珠保留段。
10.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段是多个珠保留段。
11.权利要求1所述的装置，其中所述反应孔中的至少一个包括多个分离的信号检测段作为所述至少一个空间上分离的信号检测段，并且其中至少一对相邻的珠保留段通过相应的细长通道隔开，其中所述细长通道具有与所述至少一对相邻的珠保留段中的每个相比更浅的深度。
12.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段是多个珠保留段，所述多个珠保留段各自具有共同的尺寸。
13.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个珠保留段是多个珠保留段，所述多个珠保留段中的至少一个具有与至少另一个的尺寸不同的尺寸。
14.权利要求1所述的装置，其中相应反应孔的反应体积为尺寸和构造都被配置成通过相应珠保留段保持的相应靶标珠的体积的2X至200X。
15.权利要求1-14中任一项所述的装置，其中所述反应孔以在6,000孔/cm2至2,000,000孔/cm2之间的密度提供。
16.权利要求1所述的装置，其中所述反应孔的所述珠保留段和/或所述信号检测段包括逐渐变小的和/或直的壁。
17.权利要求1所述的装置，其中所述至少一个信号检测段中的一个或多个包括与所述至少一个珠保留段隔开一定距离并且与所述至少一个珠保留段流体连通的环形流体通道。
18.权利要求1所述的装置，其中所述反应孔具有通过作为相应细长通道的直线流体通道流体连接的第一和第二隔开的端部，其中第一端部具有圆形周长并且限定第一珠保留段，并且第二端部具有圆形周长并且限定第二珠保留段。
19.权利要求18所述的装置，其中与所述第二端部相比，所述第一端部直径和/或深度更大或更小。
20.一种使用权利要求1-19中任一项所述的装置通过对来自所述反应孔的所述至少一个信号检测段的测定信号进行电子检测来对分析物进行分析的方法，其中从在相应珠保留段中保持的靶标珠释放的试剂和/或分析物扩散通过相应反应孔的共用溶液体积，其中在将靶标珠保持在所述珠保留段中的同时，由所述至少一个信号检测段检测所述测定信号，所述至少一个信号检测段产生包括能够与所述靶标珠的亮背景信号区分开的尾部的光学信号。
21.权利要求20所述的方法，其中进行对信号进行电子检测以检测来自相应反应孔的所述至少一个信号检测段的阳性测定信号和/或编码的信号。
22.权利要求21所述的方法，其中(a)在反应之后进行所述电子检测而不需要在所述反应之前的基线读数和/或(b)在进行测定之前进行所述电子检测。
23.权利要求20所述的方法，其中对容纳有多于一种类型的珠的阵列进行对测定信号进行电子检测，每种珠类型以独特识别标志编码并且每种类型以不同的试剂官能化以允许检测不同的分析物或不同的化学反应。
24.权利要求23所述的方法，其中每种珠类型以包括不同强度水平的荧光染料的组合的独特识别标志编码。
25.一种制造微孔的方法，所述方法包括：
向至少一个基板中或在至少一个基板上形成紧密相距的多个反应孔，所述反应孔具有至少一个珠保留段和至少一个分离信号检测段，所述至少一个分离信号检测段与所述至少一个珠保留段流体连通，其中所述至少一个分离信号检测段包括宽度比所述至少一个珠保留段的宽度小的细长通道，其中相邻反应孔的珠保留段的中心线隔开1μm至1mm之间的距离，并且其中所述至少一个信号检测段从所述至少一个珠保留段的中心线延伸距离L，所述距离L在1μm至1mm之间，并且其中所述反应孔以在6,000孔/cm2至2,000,000孔/cm2之间的密度提供，并且所述反应孔具有在1aL至100μL之间的体积容量；其中所述多个反应孔形成在上部基板和下部基板之间，并且密封剂将所述反应孔彼此密封。
26.一种分析系统，所述分析系统包括：
控制器；
与所述控制器通信的检测器；和
图像处理器，所述图像处理器具有被配置成鉴别在根据权利要求1所述的流体装置的反应孔的信号检测段中存在的信号的模块，
其中所述模块被配置成在将珠保持在相应的珠保留段中的同时鉴别与从所述一个或多个珠保留段延伸一定距离的至少一个信号检测段相关的阳性测定信号，所述阳性测定信号包括能够与所述珠的亮背景信号区分开的与荧光增加相关的尾部。
27.权利要求26所述的系统，其中所述鉴别在反应之后进行而不需要在所述反应之前来自所述检测器的基线读数。
28.权利要求26所述的系统，其中所述模块被配置成基于鉴别的阳性测定信号或者在进行测定之前或期间进行珠解码。
29.权利要求26所述的系统，其中所述模块被配置成鉴别在单个反应孔的第一和第二分离的珠保留段中保持的至少两个珠，所述孔具有与第一和第二珠保留段中的一个或两个流体连通的至少一个信号检测段。
30.权利要求26-29中任一项所述的系统，其中相邻反应孔的珠保留段的中心线隔开1μm至1mm之间的距离，并且其中所述至少一个信号检测段从相应反应孔的所述一个或多个珠保留段的中心线延伸一定距离，所述距离为靶标珠的直径的0.3X至200X之间，其中所述反应孔以在6,000孔/cm2至2,000,000孔/cm2之间的密度提供，并且其中密封剂将所述反应孔彼此密封。
31.权利要求30所述的系统，其中所述至少一个信号检测段从所述一个或多个珠保留段的中心线延伸的所述距离在1-100μm之间。
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