CN101838702A

CN101838702A - 高通量单核苷酸多态性检测方法

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Publication number: CN101838702A
Application number: CN 201010190158
Authority: CN
Inventors: 何农跃; 李松; 刘洪娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2010-09-22

Abstract

一种高通量单核苷酸多态性检测方法，检测步骤为：磁性纳米颗粒的修饰；引物的设计；制备磁珠阵列；扩增样本的全基因组扩增产物或者多重PCR产物；延伸反应；反应完成后，经洗涤，去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。本发明克服了目前单核苷酸多态性检测方法的许多不足，具有操作简单、快速、高通量、高灵敏度等优点，有较高的应用价值。

Description

高通量单核苷酸多态性检测方法

一、技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种新型的高通量单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)检测方法。利用磁珠阵列和在片单碱基延伸(Single Base Circular Extension，SBCE)技术，来实现对大量样本的多个SNPs检测。

二、背景技术

研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组时代研究的主题之一。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)人类基因组中最常见的单碱基差异，在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。SNP的广泛应用前景，使之成为了后基因组时代的主要研究内容之一。其中最为重要的莫过于始于2002年的“国际人类基因组单体型计划”(International Hapmap Project)。该计划为人类基因组计划之后人类基因组研究领域的又一个重大研究计划，通过大规模的基因分型来鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识别这些单体型的标签SNPs。如果说基因组序列是一本生命的“百科全书”，那么Hapmap就是方便读者阅读本书的“索引目录”。所有从Hapmap中获得的标签SNPs的信息，均能够被研究者利用将遗传多态位点和特定疾病风险联系起来，从而为预防、诊断和治疗疾病提供新的方法。尽管单个基因对药物作用或疾病的影响已有不少研究。例如，已知一些参与药物代谢的酶的基因和受体基因可以改变药物在体内的代谢和个体对药物的敏感性。但对于常见的复杂疾病的发病，由于有众多基因和环境因素的参与，仅了解单个基因对其的影响是远远不够的，有必要在整体水平上全面认识多个基因的作用，而这只有基因组水平上才有可能做到。SNP以其数量众多和易于批量检测，正好为此提供了条件。SNP标记的确立，不仅便利了遗传病的原因基因的克隆工作，也便利了单基因、多基因病等各种遗传病的研究工作。SNP标记对临床医学也有重大意义，SNP标记首先应该是作为一种有效的遗传多态性标记物为临床医学服务的，比其它的遗传标记物更能真实的反映人种、人群及个体之间的遗传差异。在Hapmap计划、在全基因组关联分析以及疾病易感因子检出等需求的强烈推动下，对大量人群的已知SNP位点检测方法的研究成为热点，越来越多的生命科学研究者投身于相关的研究中，研究领域越来越大。因此，开发出适合于对大量样本已知SNP位点分型的方法具有时间上的紧迫性。因此，为了满足他们持续增长的需求，对SNP分型技术也有了更高的要求。那么满足要求的SNP分型技术需要具有以下特点：

1)高通量

当前的SNP研究中往往需要对大量样本的多个位点进行分型研究。如，在疾病关联的研究中，往往需要对来自病人和对照的上千乃至上万个样本的多个SNP位点进行分型研究。如此庞大的分析工作量，对需要检测技术具有高通量的特点。要具有真正高通量的特点，需要具备两个基本要素：首先，该方法能够实现阵列式的信号检测能力；其次，该方法能够实现高并行待检测样本的制备。生物芯片技术的发展，为高通量的检测提供了良好的技术平台，而高并行的样本操作和制备则更具有挑战性。

2)自动化

如果手动完成对大量样本的SNP位点分型，需要研究工作者耗费大量的时间和精力。因此，这就需要我们提供一种能够实现自动化的检测方法，不但能够研究人员从实验台边上解放出来，还可以大大加快研究进程。这种自动化的方法应该可以实现从样本的制备，分型操作，一直到最后的信号检测完全自动进行。

3)准确性

准确是对于SNP分型方法的基本要求。针对SNP二等位基因的特点，不同基因型的样本在SNP位点上仅有一个碱基的差异，这就需要SNP分型方法需要具有较高的特异性和较强的检测信号。

4)简单和易用性

一种检测方法若要被广大用户接受应该具有简单和易用的特点，检测探针设计简单易行，操作者只需要简单的培训就可以利用仪器实现操作。

5)低成本

在满足检测基本需求的情况下，成本是一个方法能够推广的一个重要因素，尤其是需要对大量样本进行分型的时候。

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。由于磁性纳米颗粒分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易实现功能基团、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。

科学研究和临床应用上都亟需能同时进行简单、有效、低成本且能够自动化多样本、多位点的高通量SNP分析技术。但总体来说，现有方法普遍受到样品纯化浓缩、操作复杂，及标记检测技术的限制，能同时检出的SNPs位点数和样本数是很有限的，有的方法分析成本过高或结果的准确性不够，缺乏真正的实用性。这些技术和方法上的瓶颈，妨碍了后基因组研究的深入发展。

三、发明内容

发明目的：本发明针对现有技术缺点，提出了一种将磁珠阵列与单碱基延伸技术相结合，建立一种新型的简单、高准确性、低成本、高通量的SNP检测方法，整个方法能够实现从自动化分行，且与传统方法相比该方法应要具有很高的实用性和灵活性。

技术方案：一种高通量单核苷酸多态性检测方法，检测步骤为：a.磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰；b.引物的设计：选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基延伸引物，引物的3’端与SNP位点的上游一个碱基互补，5’端经过功能化修饰共价连接到磁珠表面，得到延伸引物-磁珠复合物；c.制备磁珠阵列：选取洁净的载玻片，其一面粘附有杂交反应池，载玻片另一面年附有永磁体，将延伸引物-磁珠复合物点样于杂交反应池之内，复合物通过永磁体磁场固定于玻片表面；d.扩增样本的全基因组扩增产物或者多重PCR产物；e.延伸反应：延伸反应的体系中包括磁珠延伸引物，扩增产物模板DNA，与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP，Mg²⁺、缓冲液、DNA聚合酶，通过退火使得靶序列和延伸引物结合，在DNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP延伸在引物3’端；f.反应完成后，经洗涤，去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。

检测步骤a中所描述的磁性纳米颗粒表面所修饰的功能基团为亲合素、链霉亲和素、纳米金或醛基，与上述修饰基团所对应的b步骤中引物5’端修饰为生物素、生物素、巯基和氨基。

检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交，对于C->T(G->A)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddGTP，或者ddCTP和ddTTP；

检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交时，对于C->A(G->T)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddCTP，或者ddTTP和ddGTP。

检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交时，对于C->G(T->A)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddTTP，或者ddCTP和ddGTP。

检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用单色延伸杂交时，四个独立反应池中延伸试剂分别加入不同的荧光标记的ddATP、ddCTP、ddTTP和ddGTP。

有益效果：本发明在磁性颗粒制备方面采用了通过在磁性纳米材料表面修饰金壳或凝胶壳，来有效消除磁性纳米颗粒的荧光背景。利用磁珠作为载体，检测微阵列具有制备简单、快速、易于自动化的优点。磁珠表面能够在较小的空间区域内固定更大量的荧光探针，从而实现信号放大。

本发明将单碱基延伸技术应用于磁珠阵列基延伸技术相比，使用全基因组扩增或者多重PCR产物作为延伸模板，利用磁磁珠阵列作为检测平台，直接通过在颗粒表面延伸荧光标记的ddNTP，从而获取样本的分型信息，应用该方法能够实现对样本多个位点的同时检测。

应用磁性颗粒作为载体，该方法能够实现从样本制备——分型操作——信号检测的完全自动化。循环延伸和磁性颗粒为针列的应用，使得样本分型信号强度大，正错配信号比高。由于实验中仅需要荧光标记的ddNTP，无须其他昂贵的荧光探针，大大降低了实验成本。

综上所述，本发明克服了目前单核苷酸多态性检测方法的许多不足，具有操作简单、快速、高通量、高灵敏度等优点，有较高的应用价值。

四、附图说明

图1是实施例1中磁性颗粒微阵列的示意图；

其中1、杂交池盖片；2、固定有延伸引物的磁珠；3、杂交反应池；4、载玻片；5、永磁体。

图2磁珠单碱基延伸结构示意图；

其中6、磁珠7、固定在磁珠上的引物8、荧光标记ddNTP 9、SNPs位点10、全基因组扩增产物或者多重PCR产物。

五、具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述：

实施例1：本发明涉及一种高通量单核苷酸多态性检测方法。实施方案具体如下：

(a)无荧光背景的磁性颗粒的制备：采用了Lin等[Journal of Solid StateChemistry，2001，159：26-31]方法制备了一种金磁颗粒，有效消除磁性颗粒的荧光背景。并将制备好的磁性颗粒通过使用戊二醛及半胱胺做为手臂分子共价修饰亲合素。

(b)此处以检测MTHFR基因的C677T(C→T)位点为待检测位点为例。其中所使用的延伸引物其5’端经过生物素修饰，3’端最后一个碱基与待测位点互补，其序列为：5’-biotin-AAGCTGCGTGATGAT GAAATCG-3’。

(c)将5’端经过修饰的单碱基循环延伸引物固定在亲合素修饰的磁性颗粒表面，制备磁珠引物。

(d)磁珠颗粒阵列制备示意图附图1所示，包括载玻片、永磁体、聚二甲基硅氧烷(PDMS)杂交反应池(制备方法参见：Pantoja et al，Biosensors andBioelectronics，2004，20(3)：509-517)、磁性颗粒引物、杂交池盖片五部分组成。其中用磁铁粘附在玻片点样区的背面，磁性颗粒点样在杂交反应池中，当需要检测多种不同位点时，需制备四个相同的独立的杂交池。

(e)使用通用连接子PCR扩增全基因组扩增产物制备：本实验中所用的通用连接子由两条长度分别为24bp和12bp的寡核苷酸互补构成。其中较长的寡核苷酸(H24)序列为：5’-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT-3’，其中较短的寡核苷酸(H12)序列为：5’-TAA TCC CTC GGA-3’。通用连接子PCR模板的制备及扩增步骤如下：首先，将2μg的基因组DNA用10U的限制性内切酶Mse I在60℃下消化过夜。该内切酶(识别序列为T*TAA)将基因组DNA消化成短片段，片段大小在70-2000个碱基之间。由于该酶的识别序列避开待测SNP位点，因此经该酶消化后，各个待测SNP位点保持完整。消化产物经QIAquick纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，纯化后的消化产物末端连接5’端未磷酸化的连接子，连接子是由两条寡聚核苷酸链H24和H12构成。连接这段连接子的目的是为扩增待测靶序列提供一条通用引物。连接过程如下：(1)将两条寡核苷酸链(浓度为100μM)等量混合，55℃温育10min，慢慢冷却至室温；(2)复性后的连接子按每个样品10μL的量加入到纯化产物中。反应体系为30μL，其中含3μL 10×T4连接酶缓冲液，10μL的纯化产物及2μL的T4 DNA连接酶，加水至30μL。连接反应在16℃下过夜；(3)连接完成后，在70℃下5min终止反应；(4)连接产物经QIAquick纯化试剂盒(QIAGEN)纯化后待用。为了尽量将所有酶切片段进行大量扩增，PCR的循环数为35个。反应体系为100μL，其中含有1×反应缓冲液，2.5mM的Mg²⁺，0.4μM生物素标记的H24引物，4U的Taq DNA聚合酶，5％DMSO(体积比)及200μM的dNTP。PCR扩增前首先将反应体系在72℃反应3min，此目的是将未连接的短寡核苷酸链H12变性下来，同时通过TaqDNA聚合酶的作用将连接产物的缺口补齐，然后进行通用引物扩增。扩增程序为：95℃预变性4min；然后95℃变性1min，70℃退火2min 30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后，72℃再延伸10min。向30μL的PCR产物体系中加入2U的碱性磷酸酶以及6U Exo I酶后，37℃反应60min，然后95℃5min将酶灭活，处理好的PCR产物留着下一步待用。

(d)30μL反应体系包括linker-PCR全基因组扩增产物15μL，3μL的10×Thermo Sequenase的反应缓冲液，0.6μL Cy5-ddATP(10μmol/L)，0.6μLTAMRA-ddGTP(10μmol/L)，1.8μL未标记的另外三种ddNTP(10μmol/L)混合液，3U Thermo Sequenase DNA聚合酶(5U/μL)，44℃延伸7min。

(e)延伸反应后的磁性颗粒微阵列经2×SSC-0.1％SDS(质量体积比)、0.1×SSC-0.1％SDS(质量体积比)和3×SSC各缓缓地振荡和清洗各两次，每次3min。将表面杂交上荧光探针的磁性纳米颗粒点阵列通过100℃热台快速烤干后，取下载玻片另一面的磁体，以备扫描。通过生物芯片扫描仪，对样品的分型结果进行分析。上述处理后的玻片经4100A扫描微阵列分析系统(Axon，USA)扫描以获得样品分型图像。

实施例2本发明涉及一种高通量单核苷酸多态性检测方法，实施方案具体如下：

(a)无荧光背景的磁性颗粒的制备：采用了Lin等[Journal of Solid StateChemistry，2001，159：26-31]方法制备了一种金磁颗粒，有效消除磁性颗粒的荧光背景。

(b)选取多个SNP位点，根据SNP位点的序列设计延伸引物。延伸引物的设计原则为：各个位点的延伸引物具有相似的Tm值，其5’端经过巯基修饰，3’端最后一个碱基与待测位点互补。

(c)将5’端经过修饰的单碱基延伸引物应用Au-S键共价结合固定在功能化的磁性颗粒表面，制备磁珠引物。

(e)应用多重PCR方法同时扩增所有位点的PCR产物，将扩增好的PCR产物应用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

(d)在每个反应池中加入延伸反应试剂，30μL反应体系包括多重PCR扩增扩增产物15μL，3μL的10×Thermo Sequenase的反应缓冲液，一种0.6μLTAMARA-ddNTP(10μmol/L)，1.8μL未标记的另外三种ddNTP(10μmol/L)混合液，3U Thermo Sequenase DNA聚合酶(5U/μL)，44℃延伸7min。

(e)延伸反应后的磁性颗粒微阵列经2×SSC-0.1％SDS、0.1×S SC-0.1％SDS和3×SSC各缓缓地振荡和清洗各两次，每次3min。将表面杂交上荧光探针的磁性纳米颗粒点阵列通过100℃热台快速烤干后，取下载玻片另一面的磁体，以备扫描。通过生物芯片扫描仪，对样品的分型结果进行分析。上述处理后的玻片经4100A扫描微阵列分析系统(Axon，USA)扫描以获得样品分型图像。

Claims

1.一种高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤为：

a.磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰；

b.引物的设计：选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基延伸引物，引物的3’端与SNP位点的上游一个碱基互补，5’端经过功能化修饰共价连接到磁珠表面，得到延伸引物-磁珠复合物；

c.制备磁珠阵列：选取洁净的载玻片，其一面粘附有杂交反应池，载玻片另一面年附有永磁体，将延伸引物-磁珠复合物点样于杂交反应池之内，复合物通过永磁体磁场固定于玻片表面；

d.扩增样本的全基因组扩增产物或者多重PCR产物；

e.延伸反应：延伸反应的体系中包括磁珠延伸引物，扩增产物模板DNA，与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP，Mg²⁺、缓冲液、DNA聚合酶，通过退火使得靶序列和延伸引物结合，在DNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP延伸在引物3’端；

f.反应完成后，经洗涤，去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。

2.根据权利要求1所述的高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤a中所描述的磁性纳米颗粒表面所修饰的功能基团为亲合素、链霉亲和素、纳米金或醛基，与上述修饰基团所对应的b步骤中引物5’端修饰为生物素、生物素、巯基和氨基。

3.根据权利要求1所述的高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交，对于C->T(G->A)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddGTP，或者ddCTP和ddTTP；

4.根据权利要求1所述的高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交时，对于C->A(G->T)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddCTP，或者ddTTP和ddGTP。

5.根据权利要求1所述的高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用双色延伸杂交时，对于C->G(T->A)SNP位点，使用双色荧光标记的ddATP和ddTTP，或者ddCTP和ddGTP。

6.根据权利要求1所述的高通量单核苷酸多态性检测方法，其特征在于检测步骤e中所描述的延伸反应体系，采用单色延伸杂交时，四个独立反应池中延伸试剂分别加入不同的荧光标记的ddATP、ddCTP、ddTTP和ddGTP。