CN101392290A - 基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁分离和固相单碱基循环延伸技术(SingleBase Circular Extension,SBCE)的单碱基差异(Single Base Difference,SBD)检测新方法。其特征在于以磁性颗粒为载体固定待检测位点的延伸引物,在Taq酶作用下将特定荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,通过包含有变性、退火和延伸的热循环反应,将模板的基因型信号放大。本发明具有简单、准确、低成本、高通量、高灵敏度的特点,并且该方法能够实现自动化运行,与传统方法相比该方法具有更高的实用性。
Description
一、技术领域
本发明属于基因检测技术领域,特别涉及一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法。
二、背景技术
现有技术:研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组时代研究的主题之一。因此,对人类基因组中最常见的变异——单碱基差异(Single Base Difference,SBD)的研究也成为了热点,其主要包括单碱基的缺失,插入,置换,以及单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP)。SNP是人类基因组中最常见的单碱基差异,在基因组中出现频率很高,据估计每300-1000个碱基中即出现一次,分布密度远大于微卫星重复序列等,因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。在不同的人群中,SNP的频率分布有差异,这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此,研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性,以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此,建立一种快速、准确、高通量且适用于临床的SNP检测方法具有时间上的紧迫性,同时该方法应具备一定的通用性,能够对组织样本中低突变率的SBD进行准确的检测。该种检测方法应具备以下特点:
1)高通量
具有真正高通量的特点,需要具备两个基本要素:首先,该方法能够实现阵列式的信号检测能力;其次,该方法能够实现高并行待检测样本的制备。生物芯片技术的发展,为高通量的检测提供了良好的技术平台,而高并行的样本操作和制备则更具有挑战性。
2)自动化
如果手动完成对大量样本的SBD检测,需要研究工作者耗费大量的时间和精力。因此,这就需要我们提供一种能够实现自动化的检测方法。这种自动化的方法应该可以实现从样本的制备,分型操作,一直到最后的信号检测完全自动进行。
3)准确性
准确是对于SBD检测方法的基本要求。尤其是对于肿瘤样本来说,由于癌组织中的突变率往往很低,常规的杂交检测方法由于错配杂交产生的假阳性信号,往往无法准确进行突变检测。
当然,简单和易用性以及低成本也是SBD检测应具备的特点。
随着纳米技术的迅速发展,纳米材料逐渐被应用到生命科学领域,为其研究和发展提供了新的技术和手段。具体关于磁性颗粒的制备可参考以下文献:Jun Lin,et al.Journal of Solid State Chemistry 159,26-31(2001);XC Shen,Chemistry Letters Vol.33,No.11,1468-1469(2004);Eugenii Katz,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,6042-6108.
由于磁性纳米颗粒分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易实现功能基团、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性,目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。
三、发明内容
技术问题:本发明针对现有技术空白,提供一种将纳米技术与单碱基循环延伸技术相结合,建立一种新型的简单、高准确性、低成本、高通量的SBD检测方法,整个方法能够实现从自动化分行,且与传统方法相比该方法应要具有很高的实用性和灵活性。
技术方案:一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法,其特征在于检测步骤为:
a.磁性纳米颗粒的修饰:对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰,使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子,所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基;
b.设计引物的修饰:选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点,根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物,所设计的引物5’端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基,3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补;
c.固相引物的制备:通过共价结合法,将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金-巯基、亲合素-生物素或者醛基-氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上,制备固相引物;
d.延伸反应:延伸反应的体系中包括固相延伸引物,模板DNA,与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP,Mg2+、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶,通过95℃变性、退火,靶序列和延伸引物结合,在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上,如此若干循环后,延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物;
e.经过若干个循环后,将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分洗涤,通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SBD检测。
上述方法中所使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延伸模板,在Taq酶的作用下,通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出荧光标记的ddNTP。
上述方法中所循环延伸所使用的荧光标记的ddNTP只与待检测位点互补,所述荧光标记的ddNTP为单色荧光标记或为双色荧光标记。
上述方法中步骤(e)中磁性颗粒表面的荧光强度用生物芯片扫描仪检测或用微孔板检测。
有益效果:
本发明在磁性颗粒制备方面采用了通过在磁性纳米材料表面修饰金壳或凝胶壳,有效消除磁性纳米颗粒的荧光背景。利用磁性颗粒作为单碱基循环延伸反应的固相载体,本发明具有制备简单,易于自动化,检测快速,灵敏度高等优点。能够在较小的空间区域内固定更大量的荧光探针,从而实现信号放大。
本发明首次提出了固相单碱基循环延伸技术。该技术与常规单碱基延伸技术相比,能够同时使用基因组DNA、全基因组扩增产物或者PCR扩增产物作为靶序列,避免对靶序列的纯化、浓缩。利用磁性颗粒作为载体,直接通过在颗粒表面循环延伸荧光标记的ddNTP或者将循环延伸后3’端连接有荧光标记物的延伸引物固定到磁性颗粒上,从而获取样本的分型信息,实现了对分型信号的二次放大。
应用磁性颗粒作为载体,该方法能够实现从样本制备——分型操作——信号检测的完全自动化。循环延伸和磁性颗粒为针列的应用,使得样本分型信号强度大,正错配信号比高。由于实验中仅需要荧光标记的ddNTP,无须其他昂贵的荧光探针,大大降低了实验成本。因而应用该方法能够实现对大量样本多个SBD位点的高准确性、低成本、高通量、自动化的检测。
综上所述,本发明克服了目前SBD检测方法的许多不足,具有操作简单、快速、高通量、高灵敏度等优点,有较高的应用价值。
四、具体实施方式
实施例1:
一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法,检测步骤为:磁性纳米颗粒的修饰:对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰,使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子,所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基;设计引物的修饰:选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点,根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物,所设计的引物5’端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基,3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补;固相引物的制备:通过共价结合法,将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金-巯基、亲合素-生物素或者醛基-氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上,制备固相引物;延伸反应:延伸反应的体系中包括固相延伸引物,模板DNA,与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP,Mg2+、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶,通过95℃变性、退火,靶序列和延伸引物结合,在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上,如此若干循环后,延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物;经过若干个循环后,将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分洗涤,通过生物芯片扫描仪检测或用微孔板检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SBD检测。
上述方法中所使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延伸模板,在Taq酶的作用下,通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出荧光标记的ddNTP。
上述方法中所循环延伸所使用的荧光标记的ddNTP只与待检测位点互补,所述荧光标记的ddNTP为单色荧光标记或为双色荧光标记。
实施例2:
1、应用Jun Lin等的方法(Journal of Solid State Chemistry 159,26-31,2001)制备包有金壳的磁性颗粒,将颗粒分散到0.1M的PB缓冲液中,最终浓度为4mg/M1。
2、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例,所设计的延伸引物为5’端巯基标记。具体引物序列为:SH-(N)15-GGTGTCCACACTGGCTCCC。
3、24pmol巯基标记的引物通过Au-S键共价固定在80μg磁性颗粒表面。
4、固相循环延伸反应每个样本在两个单独的PCR管中进行,每管反应体系20μL,每管中包含20μM相应的TARMA-ddNTP,TARMA-ddATP加入野生型的反应管中,TARMA-ddGTP加入突变型的反应管中,其余反应成分包括10mM Tris-HCl(pH 8.3),50mMKCl,2.0mM MgCl2,1.5 U Taq酶,80μg固定有延伸引物的磁性颗粒。
5、延伸反应的具体程序如下:首先95℃保温5分钟,然后进行35个循环的变温热循环,具体包括95℃ 30秒,58℃ 30秒,72℃ 30秒.在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,由于反应体系中只有ddNTP的存在,所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后,延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。
6、反应后,磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变,然后分散到10μL去离子水.将磁性颗粒点样在干净的玻片表面,快速干燥后,利用生物芯片扫描仪进行检测。采用单色荧光标记的ddNTP分型时,样本的分型原理为:野生型样本,来自野生型管的颗粒有较强的荧光信号,而来自突变型管的颗粒无荧光信号;突变型样本,来自野生型管的颗粒无荧光信号,而来自突变型管的颗粒有较强的荧光信号;杂合型样本,来自两管的的颗粒均有较强的荧光信号。
实施例3:
1、按照Shen等的方法(Chemistry Letters Vol.33,No.11,1468-1469,2004)合成Fe2O3磁性颗粒。
2、磁性颗粒通过在5%(体积浓度)APTES的乙醇溶液中浸泡,使之表面修饰上NH2基团,经乙醇和去离子水洗涤后,磁性颗粒浸泡在5%(体积浓度)戊二醛的水溶液中,使之表面修饰上醛基基团。
3、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例,所设计的延伸引物为5’端氨基标记。具体引物序列为:NH2-(N)15-GGTGTCCACACTGGCTCCC。
4、20pmol氨基标记的引物通过氨基和醛基之间的shifft效应共价固定在80μg磁性颗粒表面。
5、固相循环延伸反应每个样本在两个单独的PCR管中进行,每管反应体系20μL,每管中包含20μM相应的TARMA-ddNTP,TARMA-ddATP加入野生型的反应管中,TARMA-ddGTP加入突变型的反应管中,其余反应成分包括10mM Tris-HCl(pH 8.3),50mMKCl,2.0mM MgCl2,1.5U Taq酶,80μg固定有延伸引物的磁性颗粒。
6、延伸反应的具体程序如下:首先95℃保温5分钟,然后进行35个循环的变温热循环,具体包括95℃ 30秒,58℃ 30秒,72℃ 30秒。在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,由于反应体系中只有ddNTP的存在,所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后,延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。
7、反应后,磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变,然后分散到10μL去离子水,将磁性颗粒点样在干净的玻片表面,快速干燥后,利用生物芯片扫描仪进行检测。采用单色荧光标记的ddNTP分型时,样本的分型原理为:野生型样本,来自野生型管的颗粒有较强的荧光信号,而来自突变型管的颗粒无荧光信号;突变型样本,来自野生型管的颗粒无荧光信号,而来自突变型管的颗粒有较强的荧光信号;杂合型样本,来自两管的的颗粒均有较强的荧光信号。
实施例4:
1、按照Shen等的方法(Chemistry Letters Vol.33,No.11,1468-1469,2004)合成Fe2O3磁性颗粒。
2、磁性颗粒通过在5%(体积浓度)APTES的乙醇溶液中浸泡,使之表面修饰上NH2基团,经乙醇和去离子水洗涤后,磁性颗粒浸泡在5%(体积浓度)戊二醛的水溶液中,使之表面修饰上醛基基团。最终,将稀释与PB缓冲液中的亲合素与醛基修饰的磁性颗粒反应,制备得到亲合素修饰的磁性颗粒。
3、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例,所设计的延伸引物为5’端生物标记。具体引物序列为:biotin-(N)15-GGTGTCCACACTGGCTCCC。
4、20pmol生物素标记的引物通过生物素和亲合素之间的特异性结合共价固定在80μg磁性颗粒表面。
5、固相循环延伸反应每个样本在一个PCR管中进行,每管反应体系20μL,管中包含20μM Cy3-ddATP,20μM Cy5-ddGTP,10mM Tris-HCl(pH 8.3),50mM KCl,2.0mM MgCl2,1.5U Taq酶,80μg固定有延伸引物的磁性颗粒。
6、延伸反应的具体程序如下:首先95℃保温5分钟,然后进行35个循环的变温热循环,具体包括95℃ 30秒,58℃ 30秒,72℃ 30秒。在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,由于反应体系中只有ddNTP的存在,所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后,延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。
7、反应后,磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变,然后分散到10μL去离子水,将磁性颗粒点样在干净的玻片表面,快速干燥后,利用生物芯片扫描仪进行检测。采用双色荧光标记的ddNTP分型时,样本的分型原理为:野生型样本,有较强的Cy3荧光信号,Cy5信号很弱;突变型样本有较强的Cy5荧光信号,Cy3信号很弱;杂合型样本,两种荧光信号均比较强。
实施例5:
1、按照Shen等的方法(Chemistry Letters Vol.33,No.11,1468-1469,2004)合成Fe2O3磁性颗粒。
2、磁性颗粒通过在5%(体积浓度)APTES的乙醇溶液中浸泡,使之表面修饰上NH2基团,经乙醇和去离子水洗涤后,磁性颗粒浸泡在5%(体积浓度)戊二醛的水溶液中,使之表面修饰上醛基基团。最终,将稀释与PB缓冲液中的亲合素与醛基修饰的磁性颗粒反应,制备得到亲合素修饰的磁性颗粒。
3、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例,所设计的延伸引物为5’端生物标记。具体引物序列为:biotin-(N)15-GGTGTCCACACTGGCTCCC。
4、20pmol生物素标记的引物通过生物素和亲合素之间的特异性结合共价固定在80μg磁性颗粒表面。
5、固相循环延伸反应每个样本在一个PCR管中进行,每管反应体系20μL,管中包含20μM Cy3-ddATP,20μM Cy5-ddGTP,10mM Tris-HCl(pH 8.3),50mM KCl,2.0mM MgCl2,1.5U Taq酶,80μg固定有延伸引物的磁性颗粒。
6、延伸反应的具体程序如下:首先95℃保温5分钟,然后进行35个循环的变温热循环,具体包括95℃ 30秒,58℃ 30秒,72℃30秒。在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,由于反应体系中只有ddNTP的存在,所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后,延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。
7、反应后,磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变,然后分散到20μL去离子水中。通过荧光读板仪直接检测。采用双色荧光标记的ddNTP分型时,样本的分型原理为:野生型样本,有较强的Cy3荧光信号,Cy5信号很弱;突变型样本有较强的Cy5荧光信号,Cy3信号很弱;杂合型样本,两种荧光信号均比较强。
Claims (4)
1.一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法,其特征在于检测步骤为:
a.磁性纳米颗粒的修饰:对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰,使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子,所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基;
b.设计引物的修饰:选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点,根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物,所设计的引物5’端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基,3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补;
c.固相引物的制备:通过共价结合法,将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金-巯基、亲合素-生物素或者醛基-氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上,制备固相引物;
d.延伸反应:延伸反应的体系中包括固相延伸引物,模板DNA,与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP,Mg2+、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶,通过95℃变性、退火,靶序列和延伸引物结合,在TaqDNA聚合酶的作用下,与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端,在新的一个循环中,靶序列通过与另一条引物互补,将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上,如此若干循环后,延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物;
e.经过若干个循环后,将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分洗涤,通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SBD检测。
2、根据权利要求1所述的SBD检测方法,其特征在于使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延伸模板,在Taq酶的作用下,通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出荧光标记的ddNTP。
3、根据权利要求1所述的SBD检测方法,其特征在于循环延伸所使用的荧光标记的ddNTP只与待检测位点互补,所述荧光标记的ddNTP为单色荧光标记或为双色荧光标记。
4、根据权利要求1所述的SBD检测方法,其特征在于所述步骤e中磁性颗粒表面的荧光强度用生物芯片扫描仪检测或用微孔板检测。
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