CN102358910A

CN102358910A - 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

Info

Publication number: CN102358910A
Application number: CN2011103437952A
Authority: CN
Inventors: 曾新; 何农跃; 柳明
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2031-11-03
Also published as: CN102358910B

Abstract

基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，制备适合于获取核酸序列拷贝数信息的磁性介质；设计能与目标核酸序列特异性结合的引物与探针；根据引物设计数据确定Tm值，使引物与变性成单链的DNA模板充分结合；加入延伸反应缓冲溶液，捕获目标核酸片段至磁性介质；磁分离；对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。

Description

基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传领域，涉及一种基于磁分离与引物延伸的以化学发光检测拷贝数多态性的方法。本发明可应用于遗传异常的发现和识别，具体而言，本发明特别用于微观和亚微观基因组结构变异的发现，包括缺失、重复及大片段的多态性，以便计量与正常和疾病状态相关的基因组变化。本发明也可应用于其他的基因定量研究。

背景技术

遗传变异是生命的基本特征，也是疾病的重要指征。目前，以第三代遗传标记——单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）为基础的全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）已经成为研究常见复杂疾病遗传易感性的主要手段。随着DNA芯片技术的逐步发展，研究者们发现，在人类基因组中存在大量大于1Kb但小于3Mb的DNA片段多态，包括片段的插入、缺失和/或重复，及其互相组合衍生出的复杂染色体结构变异。这种现象被称作拷贝数变异（copy number variation，CNV），或拷贝数多态（copy number polymorphism，CNP）。拷贝数变异在人类基因组中的存在最早于2004年分别由Iafrate和Sebat各自所在的研究小组报道。随后， Redon等人于2006年在HapMap计划的270名健康供者中鉴定得到1447个CNV区域（CNV region，CNVR），它们覆盖了12%（300Mb）的人类基因组，并且和疾病致病/易感基因位点相关。这些结果提示，CNVs可能像SNPs一样影响着基因的表达、表型的变异和适应，也是一种重要的疾病易感变异，能引发疾病或增加复杂疾病的发病风险。因此，在随后的几年中，多种常见复杂疾病的全基因组CNVs分析结果相继出现，包括CNVs与自闭症、CNVs与精神分裂症、CNVs与癌症等等。举例而言，已知胃癌的发生发展机制涉及多因素、多步骤，其中CNVs导致的抑癌基因的失活和癌基因的激活在胃癌的发生和演变过程中担当重要角色。近年的研究表明，不同的CNVs与胃癌的分期、分型、淋巴结和血液转移等存在一定相关性。从细胞遗传学角度来解释，出现高频率丢失的部位很可能存在与胃癌密切相关的抑癌基因，而出现高频率重复的部位则可能存在相关的癌基因，CNVs所导致的抑癌基因失活和癌基因过表达很可能对胃癌的发生具有启动作用。这些研究结果提示研究人员更深入探寻CNVs与胃癌发生发展的关联性，为胃癌的早期诊断、治疗和预后提供新的判断依据。对于CNVs与其他复杂疾病的关联性研究也是立足于此。

自CNVs于2004年被报道，随即有研究者建立了“基因组变异数据库”（Database of Genomic Variants，DGV），收录人类基因组结构变异信息，为广大遗传学研究人员提供便捷的查询基因组结构变异的渠道。根据DGV的统计，截至2010年11月2日，基于NCBI build 36参考基因组序列发现的CNVs总共为66，741个，由此形成的CNVR共12，963个，覆盖35.07%的人类基因组，覆盖长度达1，000 Mb以上，这是目前任何一种遗传标记都不能比拟的。尤其是，DGV收录的信息每年呈倍数增长，说明对于人类基因组中>1Kb之结构变异的研究越来越受到关注，该种变异的重要程度不言而喻。

目前存在的研究CNVs的技术可划分为两类，一类是扫描全基因组以发现新CNVs的技术，主要包括比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）、代表性寡核苷酸微阵列分析（representational oligonucleotide microarray analysis，ROMA）、SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）芯片；另一类是针对已知CNVs进行高通量检测的技术，主要包括实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）、多重可扩增探针杂交技术（multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH）、多重连接依赖的探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）。其中，MLPA是由荷兰学者Schouten等人于2002年建立。它利用简单的杂交、连接、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增反应，于单一反应管内同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。其原理如下：MLPA方法中的探针组由两部分构成，一组探针由与靶基因特异性结合的序列和合成的通用引物序列构成，另一组探针则由与靶基因特异性结合的序列、来源于M13载体的通用引物序列以及填充于两者之间的不同长度的寡核苷酸片段构成；两组探针若与基因组DNA模板完全互补配对则能够被连接酶连接，经过PCR扩增后根据毛细管电泳结果判读基因组中拷贝数的变化。虽然检测之前经过了PCR扩增过程，但由于使用的是通用引物，不存在不同核酸序列之间扩增效率的差异，因此能够定量基因组中目标核酸片段的拷贝数差异。最初的MLPA技术以片段长度来标记不同核酸序列，通过毛细管电泳解码标记从而判读基因组中目标核酸序列的拷贝数差异。之后更发展了多种基于MLPA之连接反应为根本原理检测特定CNVs的技术，主要为提高检测的通量，而对于通量的提高则在于编码与解码技术的改进，如发展了序列标签编码解码技术、质谱编码解码技术等。然而，目前基于MLPA技术检测CNVs之方法的共同局限性在于其昂贵的价格，而造成其价格昂贵的主要原因之一便在于它的核心原理——获取核苷酸序列拷贝数信息时需要使用特殊的连接酶（Ligase-65）对目标片段进行连接。

基因组结构变异与疾病、药物、环境易感性明显相关，但是人类基因组将近3Gb的核苷酸数量限制了全基因组测序作为常规检测遗传变异的手段。因此，需要发展便捷、经济的检测遗传变异的技术为人类健康提供基因组信息。

发明内容

解决的技术问题：CNVs研究的关键问题在于对基因拷贝数的真实定量，即对于基因组中核苷酸序列拷贝数信息的获取。本发明的目的在于解决上述所提到的使用特殊连接酶而造成获取核苷酸序列拷贝数信息时成本高昂的问题，提出了一种能大大降低成本的基于磁分离的获取核苷酸序列拷贝数信息的方法，在获取核苷酸序列拷贝数信息后检测化学发光以分析基因拷贝数变异，从而为推广CNVs检测成为常规遗传变异检测项目奠定基础。

技术方案：基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，1) 制备适合于获取核酸序列拷贝数信息的磁性介质；2) 设计能与目标核酸序列特异性结合的引物与探针，探针5’端的修饰对应1)所述磁性介质上所修饰之功能化基团，之后以产物捕获方式获取目标核酸片段的拷贝数信息，产物捕获方式指先进行引物延伸反应，再利用磁性介质表面连接的特异性探针与延伸反应产物之间的碱基互补配对捕获延伸得到的核酸片段；3) 根据引物设计数据确定Tm值，根据Tm值确定退火温度，加入杂交缓冲溶液，经过变性与退火过程，使引物与变性成单链的DNA模板充分结合；4) 加入延伸反应缓冲溶液，进行一个循环后结束反应，再加入已制备的连接有特异性探针的磁性介质与延伸产物进行杂交反应，从而捕获目标核酸片段至磁性介质；5) 磁分离，对磁性介质进行清洗，即得到获取了模板中目标核酸片段拷贝数信息的磁性介质；6) 对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。

所述磁性介质为体现磁学性质的物体。

所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。

所述延伸反应体系为常规使用的PCR缓冲体系，所使用的酶为普通的Taq DNA聚合酶、Vent^-DNA聚合酶或DeepVent^- DNA聚合酶。

一种基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，制备步骤为：

a.磁性颗粒制备，采用溶剂热法制备直径在300nm左右的Fe₃O₄磁性颗粒：称取1.35 g的FeCl₃·6H₂O、3.6 g的醋酸钠以及1.0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力搅拌溶解，形成黄褐色胶体；将胶体转移至四氟乙烯反应釜，密封，置于200℃烘箱中反应8小时；反应完成后以乙醇与去离子水清洗，烘干后得Fe₃O₄磁性颗粒；用100 mL 0.1mol 盐酸浸泡Fe₃O₄磁性颗粒1小时，超声分散30分钟；再重新分散于乙醇体积浓度80%的乙醇-水混合液中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL正硅酸乙酯（TEOS），反应1小时；以乙醇、去离子水交叉洗涤；将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵，超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL TEOS，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存；制备得到核-壳结构的Fe₃O₄SiO₂复合颗粒；磁性纳米颗粒的氨基化；将上述制得的Fe₃O₄SiO₂复合纳米磁性颗粒磁分离，加入至乙醇/水混合溶液中并超声分散，然后将10 μL 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室温下振荡搅拌7小时，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出来，用乙醇溶液对其清洗5次，磁分离，再用二甲基甲酰胺（N,N-dimethyl formamide, DMF）清洗5次，最后以5 mg/mL的浓度分散于DMF中，待用；氨基化磁性纳米颗粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化SiO₂/Fe₃O₄磁性纳米颗粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等体积丁二酸酐(Succinic anhydride，SA) 浓度为0.001的DMF溶液中，室温下反应24小时，用水洗涤数次后磁分离，加入双蒸水定容至10 mg/mL，即得到功能性的羧基化磁珠；将上述羧基化磁珠（10 mg/mL）用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6）反复清洗，磁分离，加入以MES溶液稀释的氨基化探针（100 μM）至清洗过的磁珠中，混合均匀后室温下温和旋转孵育30 分钟，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC，10 mg/mL）至磁珠中混合均匀，再以MES溶液补足体积至50 μL。在4℃条件下旋转孵育2小时，每20分钟摇匀一次，磁分离后吸去上清，将磁珠于Tris （50 mM，pH 7.4）溶液中孵育15分钟以中和没有反应的活化的羧基基团，再以Tris（50 mM，0.1 % Tween-20）清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液（g/mL：0.1%）封闭磁珠；即得到了连接有特异性探针的功能化磁珠；

b.设计一对能与GAPDH、GSTT1与GSTM1基因特异性结合的引物与探针，探针5’端以氨基修饰，通过氨基-羧基相互反应将探针固定至磁性颗粒表面；

c.延伸：加入10×Buffer 2 μL、25 mM Mg²⁺ 2μL、2.5 mM dNTP 1.5 μL、上下游引物各2.5 μL，人工合成的上述DNA模板2.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水补足体积至20 μL，将反应混合物置于PCR仪中；PCR参数：94℃ 5分钟；95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟，1个循环；将得到的双链延伸产物进行变性，通过碱基互补配对原则将变性后的单链延伸产物与连有特异性探针的磁性颗粒杂交，然后将连有单链DNA的磁性颗粒磁分离，进行清洗；从而得到反映了目标基因拷贝数信息的磁性介质；

d.对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。

所述磁性颗粒表面包被一层SiO₂外壳。

所述包被方法为：用100 mL 0.1mol 盐酸浸泡Fe₃O₄颗粒1小时，超声分散30分钟；再重新分散于体积浓度80%的乙醇-水混合液中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL SiO₂ 28.4%wt的TEOS，反应1小时，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次；将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵，超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL TEOS，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存。

所述化学发光检测为进行化学反应过程中检测得到的光信号，所使用的化学发光体系包括鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯、1，2-二氧杂环丁烷类、吖啶酯或三（2，2’-联吡啶）钌（Ⅲ ）。

具体而言，本发明通过引物延伸反应，将基因组中待测核酸片段的拷贝数信息反映至磁性介质，再利用磁性介质易于分离的特性，经过磁分离后检测化学发光以分析待测模板中目标核酸片段的拷贝数变化情况。

该方法具体技术过程如下：

1) 在本发明的一个较佳实施例中，以功能化的Fe₃O₄磁性颗粒作为磁性介质来获取DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。具体而言，制备Fe₃O₄磁性颗粒，在其上包被功能化材料并修饰功能化基团。所述制备Fe₃O₄磁性颗粒的方法包括共沉淀法、水热法、高温分解法、微乳液法、溶胶-凝胶法，以及其他物理或化学方法。所述包被于Fe₃O₄磁性颗粒表面的功能化材料包括聚合物（葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯等）、二氧化硅、金属等。所述修饰于功能化材料表面的功能化基团包括羧基修饰、氨基修饰、链亲和素修饰等。这些对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的制备、包被与修饰Fe₃O₄磁性颗粒的材料和方法只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

2) 探针设计。设计一对能与目标核酸序列特异性结合的探针，探针的5’端修饰根据前述磁性颗粒上所修饰功能化基团的不同而不同。利用磁性颗粒与探针5’端修饰基团之间的反应将探针固定于磁性颗粒上。

3) 延伸。加入延伸反应溶液，成分包括常规使用的PCR缓冲体系，将反应混合物置于PCR仪中进行引物延伸反应。根据引物设计的相关数据确定Tm值，根据Tm值确定退火温度，从而确定反应参数；根据反应产物的长度确定延伸反应时间。进行一个循环后结束反应，对双链进行变性。所述常规使用的PCR缓冲体系中所使用的酶为普通的Taq DNA聚合酶、Vent^-DNA聚合酶、DeepVent^- DNA聚合酶等。这对于本领域的普通技术人员是显然的，所列举的酶与PCR反应体系只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

4) 杂交。将3)中得到的延伸反应产物与2)中制备的连接有特异性探针的磁性颗粒混合，加入杂交缓冲溶液，使两者充分结合。

上述例举的方法只对待测核酸片段进行了一次延伸，在真实反应基因组中待测核酸序列拷贝数水平的同时，对于低丰度基因的拷贝数检测可能灵敏度不够，因此可结合PCR方法，设计通用接头与通用引物对延伸产物进行扩增、得到一定丰度的目标核酸片段后再进行检测。此为对本发明核心原理“延伸反应”的技术发展，对于本领域的普通技术人员是显然的，不能以任何方式限制本发明的范围。

通过前述四个步骤得到了已获取DNA模板中目标核酸片段拷贝数信息的磁性颗粒，即对DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息进行了预处理。接下来可对磁性颗粒采用不同的检测方法进行检测，根据此时检测方式的不同，前述步骤2)、3)和4)在实验设计与实验步骤方面都有相应调整。本发明以化学发光检测方式，对拷贝数变异进行定量分析。步骤3)在延伸反应缓冲体系中加入经过标记的核苷酸单体，通过延伸反应将其掺入至产物链，磁分离后，加入对应标记的酶，使酶与核苷酸单体充分结合，加入化学发光底物后，经过酶催化反应产生化学光，再进行检测。所述化学发光体系包括鲁米诺（Luminol）、光泽精（Lucigenin）、过氧化草酸酯（Peroxyoxalates）、1，2-二氧杂环丁烷类（Adamantyl Dioxtanes）、吖啶酯（Acridinium Exter）、三（2，2’-联吡啶）钌（Ⅲ）（tris（2,2’-bipyridyl）ruthenium(Ⅲ)）等。这对于本领域的普通技术人员是显然的，所列举的化学发光反应体系只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下特点：

通过延伸引物反应将基因组中待测核酸片段的拷贝数信息反映至磁性颗粒，再利用磁性颗粒易于分离的特性在分离后通过检测延伸片段的化学发光强度确定待测核酸片段的拷贝数变化情况。该方法能真实再现待测核酸片段在基因组中的拷贝数变化情况，不同于经过PCR扩增后检测终点产物的方法，也避免了实时荧光定量PCR方法检测CNVs时需要优先考虑的待测核酸片段与内参核酸片段在引物扩增效率方面的一致性；反映至磁性颗粒的检测信号经过了富集，同时还避免了杂交过程中其他核酸片段对于待测核酸片段信号的干扰，能够有效降低本底，提高分辨率。

附图说明

图1为通过引物延伸后经磁性颗粒捕获产物再以化学发光检测目标核酸片段的实验流程示意图。

图2为功能化的Fe₃O₄磁性颗粒。A. 溶剂热法制备的Fe₃O₄磁性颗粒；B. SiO₂包被的核壳结构的复合磁性颗粒。

图3以GAPDH基因为例示以人工合成DNA片段为模板进行引物延伸反应的结果。A. 不同退火温度条件下GAPDH基因片段的延伸结果；泳道0：DNA分子量标志DL2000；泳道1：引物对照；泳道2：模板对照；泳道3：52℃为退火温度的引物延伸结果；泳道4：54℃为退火温度的引物延伸结果；泳道5：56℃为退火温度的引物延伸结果；泳道6：58℃为退火温度的引物延伸结果；泳道7：60℃为退火温度的引物延伸结果。B. 以人工合成的GAPDH基因片段为模板进行引物延伸反应、再以连接有特异性探针之磁性纳米颗粒捕获延伸产物的电泳结果；泳道0：DNA分子量标志DL2000；泳道1：引物对照；泳道2-4：过程中所使用之洗脱缓冲液的电泳结果；泳道5：以人工合成的GAPDH基因片段为模板进行引物延伸之产物经磁分离再经变性后的电泳结果；泳道6：模板对照。

图4以GAPDH基因为例示以人类基因组DNA为模板进行引物延伸的结果。泳道0：DNA分子量标志DL2000；泳道1：以人类基因组DNA为模板进行引物延伸之产物的电泳结果；泳道2：人类基因组DNA模板对照；泳道3：引物对照。

图5为化学发光检测目标基因核酸片段的结果。A. GAPDH基因延伸产物及其空白对照的化学发光强度值；B. GSTT1基因延伸产物及其空白对照的化学发光强度值；C. GSTM1基因延伸产物及其空白对照的化学发光强度值。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述：

本发明利用磁性颗粒易于分离的特性结合引物延伸反应的方法，采用化学发光检测技术，公布了一种能够低成本地获取核酸序列拷贝数信息并进行检测的技术。在本发明的一个较佳实施例中，以Fe₃O₄磁性颗粒作为媒介、以常规使用的PCR缓冲体系进行核苷酸序列拷贝数信息的获取，之后以化学发光技术进行检测。其实验流程如图1所示；延伸引物获取核酸序列拷贝数信息后，经连接有特异性探针的磁性颗粒捕获掺入了标记性核苷酸的产物片段，再加入对应标记的化学发光的酶与底物进行反应而检测化学发光强度。以下特定的实施例旨在更详细地描述本发明。这些实施例目的在于解释本发明，而不应理解为限定本发明的范围。

实施例1 以人工合成的GAPDH基因片段为模板进行核酸序列拷贝数信息的获取

以人工合成的GAPDH基因片段为模板进行核酸序列拷贝数信息获取的实验过程如下：

1) 磁性颗粒制备。采用溶剂热法制备直径在300 nm左右的Fe₃O₄磁性颗粒。称取1.35 g的FeCl₃·6H₂O、3.6 g的醋酸钠（NaAc）以及1.0 g聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），溶解于40 mL乙二醇中，磁力搅拌溶解，形成黄褐色胶体。将胶体转移至四氟乙烯反应釜，密封，置于200℃烘箱中反应8小时；反应完成后以乙醇与去离子水清洗，烘干后得Fe₃O₄磁性颗粒样品，如图2A示。

在制备的Fe₃O₄磁性颗粒表面包被一层几十纳米厚的二氧化硅（SiO₂）外壳，可以得到具有更高稳定性和生物相容性的核-壳结构复合颗粒。具体过程如下：用100 mL 0.1 mol 盐酸（HCl）浸泡Fe₃O₄颗粒1小时，超声分散30分钟。再重新分散于体积浓度80%的乙醇-水混合液中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL正硅酸乙酯（Tetraethylorthosilicate， TEOS， SiO₂ 28.4%wt），反应1小时。以乙醇、去离子水交叉洗涤数次。将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL TEOS，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存。制备得到的核-壳结构的Fe₃O₄SiO₂复合颗粒如图2B示。

如上所述制备的Fe₃O₄SiO₂复合颗粒不仅磁效应好，而且利用SiO₂包被后的颗粒表面存在大量羟基（-OH），可以方便地修饰上各种功能化基团。在本实施例中选择在颗粒表面修饰羧基（-COOH）。具体修饰过程如下：① 磁性纳米颗粒的氨基化；将上述制得的Fe₃O₄SiO₂复合纳米磁性颗粒磁分离，加入至乙醇/水混合溶液中并超声分散，然后将10 μL 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室温下振荡搅拌7小时，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出来，用乙醇溶液对其清洗5次，磁分离，再用二甲基甲酰胺（N,N-dimethyl formamide, DMF）清洗5次，最后以5 mg/mL的浓度分散于DMF中，待用；② 氨基化磁性纳米颗粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化SiO₂/Fe₃O₄磁性纳米颗粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等体积丁二酸酐(Succinic anhydride，SA) 浓度为0.001M的DMF溶液中，室温下反应24小时，用水洗涤数次后磁分离，加入双蒸水定容至10 mg/mL。③ 将上述羧基化磁珠（10 mg/mL）用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6）反复清洗，磁分离，加入以MES溶液稀释的氨基化探针（100 μM）至清洗过的磁珠中，混合均匀后室温下温和旋转孵育30 分钟，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC，10 mg/mL）至磁珠中混合均匀，再以MES溶液补足体积至50 μL。在4℃条件下旋转孵育2小时，每20分钟摇匀一次，磁分离后吸去上清，将磁珠于Tris （50 mM，pH 7.4）溶液中孵育15分钟以中和没有反应的活化的羧基基团，再以Tris（50 mM，0.1 % wt Tween-20）清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液（g/mL：0.1%）封闭磁珠。

2) 引物与探针设计。由于谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)的解毒与抗氧化活性，研究认为此家族成员是重要的癌症易感基因，在胃癌、结肠癌等消化系统癌症的研究中受到了广泛地重视。其中GST θ1 (GSTT1)，GST μ1 (GSTM1)基因由于同源序列的等位交换造成缺失、重复引起基因拷贝数的变化而导致酶活性的改变与癌症的发生具有显著相关性：GSTT1与GSTM1缺失的基因型相较正常基因型具有癌症发生的高风险性。3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为管家基因，是基因定量研究中常用的内参基因。因此我们选用GSTT1与GSTM1基因作为目标基因、GAPDH基因作为内参基因进行CNVs分析平台的开发研究。

设计一对能与GAPDH（ID: 2597）、GSTT1（ID: 2952）与GSTM1（ID: 2944）基因特异性结合的引物与探针，探针5’端以氨基修饰。引物序列如下。GAPDH：GGAAGATGGTGATGGGATTT；GSTT1：GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA；GSTM1：TCACTGGGGACACTCACAAA。探针序列如下。GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG；GSTT1：AGCCTTGAAGGACGGGGACT；GSTM1：TGGGCATGATCTGCTACAAT。

3) 产物捕获方式获取DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。具体实验过程如下：加入10×Buffer 2 μL、Mg²⁺ (25 mM) 2μL、dNTP (2.5 mM) 1.5 μL、引物2.5 μL，人工合成的DNA模板2.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水补足体积至20 μL，将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数：94℃ 5分钟；95℃ 30秒，退火30秒，72℃ 1分钟，1个循环。图3以GAPDH基因为例示引物延伸结果。图3A为不同退火温度的条件下GAPDH基因的延伸结果，可以看出以54℃为退火温度时电泳条带最清晰单一，因此确定54℃作为GAPDH基因延伸时的退火温度（泳道4）。

由于羧基修饰的磁性纳米颗粒表面连接有5’端经氨基修饰的特异性探针、通过碱基互补配对即能够将延伸产物捕获至磁性纳米颗粒表面，从而将其与模板分离开来。因此在上述经过延伸反应后的体系中加入步骤1)中制备得到之羧基修饰的Fe₃O₄SiO₂磁性纳米颗粒100 μg，加入杂交缓冲溶液100 μL，室温杂交1小时，磁分离，弃上清，以清洗缓冲液将颗粒洗涤三次，磁分离，即得到连有目标核酸片段的磁性纳米颗粒；加入洗脱缓冲液于95℃水浴10分钟，保留洗脱液。以洗脱液进行1%琼脂糖凝胶电泳。图3B示以人工合成的GAPDH基因片段为模板进行引物延伸反应、再以磁性纳米颗粒捕获延伸产物的结果：泳道1为引物对照，泳道6为模板对照，两者均无明显条带；泳道2-4为过程中所使用之洗脱缓冲液的电泳结果，亦无明显条带；泳道5为产物，电泳条带单一且明显，说明经过引物延伸反应后得到了GAPDH基因的目标片段，而连接有特异性探针的磁性纳米颗粒能够通过碱基互补配对将延伸产物捕获至颗粒表面，从而将延伸得到的核酸片段与DNA模板片段分离开来，再经过磁分离，即通过引物延伸与磁分离结合的方法获取了DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。

GSTT1与GSTM1基因同样得到了类似结果（为免重复，电泳图未列出）。

实施例2以基因组DNA为模板进行核酸序列拷贝数信息的获取

1) 磁性颗粒制备。如实施例1所述制备磁性颗粒待用。

2) 引物与探针设计。使用实施例1所述的GAPDH、GSTT1与GSTM1的引物与探针。

3) 产物捕获方式获取人类基因组DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。加入5 μL基因组DNA模板，98℃变性，加入杂交缓冲液与引物，杂交，使引物与基因组DNA模板充分结合。再如实施例1所述之反应体系与具体实验步骤而获取基因组DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。结果如图4所示。泳道2为人类基因组DNA模板对照，泳道3为引物对照。泳道1为引物延伸产物的电泳结果，电泳条带单一且明显，说明以人类基因组DNA为模板、经过引物延伸反应后得到了GAPDH基因的目标片段，而连接有特异性探针的磁性纳米颗粒能够通过碱基互补配对将延伸产物捕获至颗粒表面，经过磁分离后即获取了基因组DNA模板中目标核酸片段的拷贝数信息。

GSTT1与GSTM1基因同样得到了类似结果。

实施例3对GAPDH、GSTT1和GSTM1进行延伸产物的化学发光检测

实施例1与实施例2证实以人工合成的DNA为模板或以基因组DNA为模板通过引物延伸反应都能够得到目的核酸片段，可以进行以下的检测工作。

1) 磁性颗粒制备。如实施例1所述制备磁性颗粒待用。

3) 生物素标记的核酸片段的延伸形成。具体实验过程如下：加入10×Buffer 2 μL、Mg²⁺ (25 mM) 2μL、dNTP (2.5 mM) 1.5 μL（其中Biotin-dUTP/dTTP：4/21）、引物2.5 μL，人工合成的DNA模板2.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水补足体积至20 μL，将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数：94℃ 5分钟；95℃ 30秒，退火30秒，72℃ 1分钟，1个循环。

4) 化学发光检测。取连接有特异性探针的羧基修饰的磁性纳米颗粒（10 mg/mL）磁分离后吸去上清，在反应体系中分别加入杂交液和步骤1)得到的延伸产物，以双蒸水补足体积，混匀后以95 ℃变性10分钟，以退火温度杂交1 小时，每20 分钟混匀一次。经洗涤缓冲液振荡、清洗，最后磁分离吸去上清。加入封闭缓冲液混匀后室温放置30 分钟，期间不断混匀。磁分离后吸去上清，加入1:1000以封闭液稀释的链亲和素标记的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）溶液，混匀后室温孵育30分钟。磁分离后以洗涤缓冲液清洗。加入化学发光底物3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸（3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4- (3”-phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane, AMPPD）。充分混匀后，测定化学发光强度值至其稳定。

结果如图5所示。测得的化学发光强度值至70分钟时达到稳定，GAPDH、GSTT1和GSTM1基因延伸产物与空白对照的化学发光强度均值差值分别为871、1028、1256，目标基因与内参基因化学发光强度均值差值的比值分别为1.18（GSTT1/GAPDH）和1.44（GSTM1/GAPDH）。重复三次独立实验，结果稳定，化学发光强度均值差值及其比值无显著的批间差异，说明经过引物延伸反应能获得待测模板中目标核酸片段的拷贝数信息、再经磁性介质分离后检测延伸产物的化学发光强度值即能检测模板中目标与内参核酸片段的含量，通过二者的比值即可计算得到待测模板与对照模板中目标核酸片段相对于内参核酸片段的变化，即检测得到了目标核酸片段在待测模板中的拷贝数变化情况。

序列表

<110> 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

<120> 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaagatggt gatgggattt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcccagtta cctctccgtc a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcactgggga cactcacaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaaggctga gaacgggaag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agccttgaag gacggggact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgggcatgat ctgctacaat 20

Claims

1.基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于：1) 制备适合于获取核酸序列拷贝数信息的磁性介质；2) 设计能与目标核酸序列特异性结合的引物与探针，探针5’端的修饰对应1)所述磁性介质上所修饰之功能化基团，之后以产物捕获方式获取目标核酸片段的拷贝数信息，产物捕获方式指先进行引物延伸反应，再利用磁性介质表面连接的特异性探针与延伸反应产物之间的碱基互补配对捕获延伸得到的核酸片段；3) 根据引物设计数据确定Tm值，根据Tm值确定退火温度，加入杂交缓冲溶液，经过变性与退火过程，使引物与变性成单链的DNA模板充分结合；4) 加入延伸反应缓冲溶液，进行一个循环后结束反应，再加入已制备的连接有特异性探针的磁性介质与延伸产物进行杂交反应，从而捕获目标核酸片段至磁性介质；5) 磁分离，对磁性介质进行清洗，即得到获取了待测模板中目标核酸片段拷贝数信息的磁性介质；6) 对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。

2.根据权利要求1所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述磁性介质为体现磁学性质的物体。

3.根据权利要求2所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。

4.根据权利要求1所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述延伸反应体系为常规使用的PCR缓冲体系，所使用的酶为普通的Taq DNA聚合酶、Vent^-DNA聚合酶或DeepVent^- DNA聚合酶。

5.一种基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于制备步骤为：

a.磁性颗粒制备，采用溶剂热法制备直径在300 nm的四氧化三铁磁性颗粒：称取1.35 g的FeCl₃·6H₂O、3.6 g的醋酸钠以及1.0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力搅拌溶解，形成黄褐色胶体；将胶体转移至四氟乙烯反应釜，密封，置于200℃烘箱中反应8小时；反应完成后以乙醇与去离子水清洗，烘干后得Fe₃O₄磁性颗粒；用100mL 0.1mol 盐酸浸泡Fe₃O₄磁性颗粒1小时，超声分散30分钟；再重新分散于体积浓度80%的乙醇中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL正硅酸乙酯，反应1小时；以乙醇、去离子水交叉洗涤；将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵，超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL 正硅酸乙酯，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存；制备得到核-壳结构的Fe₃O₄SiO₂复合颗粒；磁性纳米颗粒的氨基化，将上述制得的Fe₃O₄SiO₂复合纳米磁性颗粒磁分离，加入至乙醇/水混合溶液中并超声分散，然后将10 μL APTS滴加到以上混合溶液中，并在室温下振荡搅拌7小时，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出来，用乙醇溶液对其清洗5次，磁分离，再用二甲基甲酰胺清洗5次，最后以5 mg/mL的浓度分散于DMF中，待用；氨基化磁性纳米颗粒的羧基化，取分散于DMF溶液中的氨基化SiO₂/Fe₃O₄磁性纳米颗粒，浓度为5 mg/mL，逐滴加入到等体积丁二酸酐浓度为0.001M的DMF溶液中，室温下反应24小时，用水洗涤数次后磁分离，加入双蒸水定容至10 mg/mL；即得到功能性的羧基化磁珠；将上述羧基化磁珠用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液反复清洗，磁分离，加入100 μM以MES溶液稀释的氨基化探针至清洗过的磁珠中，混合均匀后室温下旋转孵育30 分钟，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺至磁珠中混合均匀，再以MES溶液补足体积至50 μL，在4℃条件下旋转孵育2小时，每20分钟摇匀一次，磁分离后吸去上清，将磁珠于50 mM，pH 7.4 Tris溶液中孵育15分钟以中和没有反应的活化的羧基基团，再以50 mM，含0.1 %wt Tween-20的Tris清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液封闭磁珠；即得到了连接有特异性探针的功能化磁珠；

c.延伸：加入10×Buffer 2 μL、25 mM Mg²⁺ 2μL、2.5 mM dNTP 1.5 μL、上下游引物各2.5 μL，DNA模板2.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水补足体积至20 μL，将反应混合物置于PCR仪中；PCR参数：94℃ 5分钟；95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟，1个循环；将得到的双链延伸产物进行变性，通过碱基互补配对原则将变性后的单链延伸产物与连有特异性探针的磁性颗粒杂交，然后将连有单链DNA的磁性颗粒磁分离，进行清洗；从而得到反映了目标基因拷贝数信息的磁性介质；

6.根据权利要求5所述的基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述磁性颗粒表面包被一层二氧化硅外壳。

7.根据权利要求5所述的基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述引物序列如下：GAPDH：GGAAGATGGTGATGGGATTT；GSTT1：GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA；GSTM1：TCACTGGGGACACTCACAAA；探针序列如下：GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG；GSTT1：AGCCTTGAAGGACGGGGACT；GSTM1：TGGGCATGATCTGCTACAAT。

8.根据权利要求6所述的基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述包被方法为：用100 mL 0.1mol 盐酸浸泡Fe₃O₄颗粒1小时，超声分散30分钟；再重新分散于乙醇体积浓度80%的乙醇-水混合液中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL SiO₂ 28.4%wt的正硅酸乙酯，反应1小时，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次；将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵，超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL 正硅酸乙酯，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存。

9.根据权利要求1或5所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述化学发光检测为进行化学反应过程中检测得到的光信号，所使用的化学发光体系包括鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯、1，2-二氧杂环丁烷类、吖啶酯或三（2，2’-联吡啶）钌（Ⅲ ）。