CN109321672A

CN109321672A - 核苷酸组合物、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109321672A
Application number: CN201811279725.3A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 牛晨启; 黄昆仑; 徐瑗聪; 杜再慧; 贺晓云
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Xutai Yulong Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: CN109321672B

Abstract

本申请公开了一种核苷酸组合物和包含该核苷酸的试剂盒及检测方法。当待测样品中包含待测目标分子时，利用本发明设计的组合物二和引物对通过非对称PCR反应，可获得大量单链产物，这些单链产物可与利用本发明设计的组合物一制备好的银纳米簇探针杂交结合后会发出荧光，从而实现待测目标分子的可视性检测，本发明克服传统方法依赖于仪器判别的缺点，建立一种不依赖于复杂仪器的可视化、可定性定量的检测新方法，丰富了现有检测技术和方法，为以后银纳米簇在转基因方面的应用提供了思路和技术基础。在一个具体的实施方式中，本发明建立的组合物和方法的灵敏度达到0.5ng/μL且重复性好、特异性高。

Description

核苷酸组合物、试剂盒及检测方法

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种核苷酸组合物、包含该核苷酸组合物的试剂盒及检测方法。

背景技术

我国于2002年7月开始实施《转基因食品卫生管理条例》，对转基因食品产品进行标识管理。目前国际上常用的转基因产品检测方法主要有酶联免疫检测(ELISA)、PCR-电泳检测、荧光定量PCR检测等技术，但这些技术对于大量转基因品系的检测数，往往需要专业的仪器，成本较高，且数据需要进行分析后才能得出结果。因此对于转基因作物的可视性检测技术进入人们的视野。邓婷婷等均有采取过可视化芯片法对转基因玉米Mir162进行检测，检测限可达0.01％；成晓维对转基因大豆、玉米和水稻中的转基因成分进行检测，灵敏度达0.1％。但由于基因芯片技术操作较为复杂，在PCR反应过程后，仍需要清洗、封闭、显色等步骤才能判别结果，繁琐的步骤限制了这些方法在实验室的常规应用。

金属纳米簇(NCs)在过去十年中发展非常快的纳米材料。其特点是在不大于2nm的尺寸内包含最多几百个分子，并由此展现出类似于分子的特征。并且由于自身尺寸、氧化态、结构和表面基团的性质，使得金属纳米簇具备展现出较强的荧光性质。而相比于金纳米簇，银纳米簇拥有可以在水溶液中表现出更强的荧光的特点，引起了广泛的研究。

发明内容

本发明提供了一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；组合物二的序列的杂交互补序列可与组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；组合物还包括一引物对，引物对包括引物1和引物2，引物1与组合物二连接；引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

进一步的，银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。

引物1与引物2的摩尔比在1:30以下。组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。

优选的，银纳米簇成核序列为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；识别序列为序列表中SEQID №：5所示核苷酸序列；引物1与引物2的摩尔比为1:60。

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述核苷酸组合物和银纳米离子。

本发明还提供一种检测方法，该方法包括：

利用组合物一制备银纳米簇探针；

利用靶标序列、组合物二和引物对进行非对称PCR反应；

非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合。

其中，组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，银纳米簇成核序列可与银纳米离子结合形成银纳米簇；组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；组合物二的序列的杂交互补序列可与组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；组合物还包括一引物对，引物对包括引物1和引物2，引物1与组合物二连接；引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

进一步的，利用组合物一制备银纳米探针方法包括：将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混和，再与硝酸银溶液混合，然后加入NaBH₄溶液混和后室温避光孵育14小时以上。具体的，磷酸缓冲液pH＝6.6，浓度为20mM；硝酸银溶液浓度为3mM；NaBH₄溶液浓度为1.5mM。

非对称PCR反应体系中引物1与引物2的摩尔比在1:30以下。非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合包括将非对称PCR反应完成后的反应体系与制备好的银纳米簇探针溶液混合，90-95℃水浴1min，冷却至室温。

银纳米簇成核序列为富C序列；银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。

非对称PCR反应体系总体积为25μl，1μl浓度为1uM的组合物二+引物1，1μl浓度为10uM的引物2，2μl的dNTP，0.2μlTaq酶，2μl靶标DNA，10μl 10x Buffer，余量为超纯水；非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min。

优选的，Ag⁺与组合物一摩尔比例为6:1。室温避光孵育14-22小时。非对称PCR反应体系中引物1与引物2的摩尔比为1:60。银纳米簇成核序列为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；识别序列为序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列。

本发明还提供一种转基因作物的可视性检测方法，包括：

制备银纳米簇探针

将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混匀，再与硝酸银溶液混合，使Ag⁺与组合物一摩尔比例为6:1，然后快速加入NaBH₄溶液混匀后室温避光孵育14小时；组合物一的序列为序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列。

非对称PCR扩增

非对称PCR反应体系总体积25μl，1μl浓度为1uM的组合物二5’端连接引物1，1μl浓度为10uM的引物2,2μl的dNTP，0.2μlTaq酶，2μl待测转基因作物样品DNA，10μl 10xBuffer，余量为超纯水。

其中，组合物二的序列由序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列3’端连接序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列组成；引物1和引物2为根据转基因作物外源基因所设计的特异性扩增引物对，引物1与引物2的摩尔比为1:60；待测转基因作物样品DNA浓度大于0.5ng/μL。

非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min。

非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合

将非对称PCR反应完成后的反应体系加到制备好的银纳米簇探针溶液中。混匀，90-95℃水浴1min，冷却至室温。紫外光下检测。

本发明的检测方法，当待测样品中包含待测目标分子时，通过非对称PCR反应，可获得大量单链产物，这些单链产物同时拥有银纳米簇激发序列、识别序列的杂交互补序列，这些单链产物与利用组合物一制备好的银纳米簇探针杂交结合后会发出荧光，从而实现待测目标分子的可视性检测。本发明的有益效果包括：

1、无需特殊的荧光标记，节约了实验成本。

2、借助非对称扩增实现了单双链的转化，增加了该方法的特异性，减少了假阳性。

3、扩增结果与片段长度无关，易于设计引物。

4、根据设计原理可做推广去检测不同的转基因筛选序列或者品系，只需要将用于扩增目标待测靶基因的常规引物序列与激发序列的杂交互补序列和识别序列配合使用，即可实现用同样的信号去检测多个筛选基因来判定是否是转基因。

5、本发明以转基因玉米MON810中的筛选元件35S启动子为研究对象，通过优化实验条件，建立转基因成分的可视性检测体系，丰富了现有检测技术和方法，为以后银纳米簇在转基因方面的应用提供了思路和技术基础。

6、本发明提供的组合物和方法，通过对实验结果的可视化判别就能过做出定性检测的判定结果，进而结合仪器测得的数据，通过分析对需要精确定量的样品再进行定量检测。

7、转基因作物的品系越来愈多，带来的是对转基因检测方法的不断挑战，针对转基因插入序列中的筛选元件的筛查检测方法受到了极大的关注，采用本发明的组合物和检测方法，能克服传统方法依赖于仪器判别的缺点，建立一种不依赖于复杂仪器的检测方法，可广泛应用于转基因产品的检测或制备中。

8、在一个具体的实施方式中，本发明建立的组合物和方法的灵敏度达到0.5ng/μL且重复性好、特异性高。

附图说明

图1为非对称PCR过程中AG-F和AG-R序列添加量的优化实验结果图，其中，其中M代表分子量标记Marker；序号1-10分别依次代表实验组一至实验组十的结果；

图2为可行性验证实验结果图，其中A代表实验组结果，B代表NTC对照组结果；

图3为灵敏度实验结果图，图中曲线由上到下分别依次代表样品模板浓度为：10ng/μL，7.5ng/μL，5ng/μL，2.5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL；

图4为灵敏度实验中拟合的标准曲线；

图5为特异性实验统计结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。硝酸银及相关钠盐购买自北京化工有限公司。

下述实施例主要以转基因玉米MON810为例，详细说明本发明提供的DNA银纳米簇荧光可视检测技术方案，即转基因玉米MON810及其相关核苷酸序列的使用是为了详细解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的不当限定，不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。

实施例1、DNA银纳米簇荧光可视检测技术的建立

本实施例构建DNA银纳米簇荧光可视检测技术的过程包括组合物的设计、形成银纳米簇探针、非对称PCR过程、PCR产物与银纳米簇探针杂交。

(一)用于DNA银纳米簇荧光可视检测的组合物的设计

银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。

组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。

(二)形成银纳米簇探针

①将组合物一用水稀释到浓度为100μM(记为A液)。

②配制20mM的磷酸缓冲液(pH＝6.6)：

1、0.2M磷酸二氢钠水溶液：称取NaH₂PO₄·2H₂O 1.56g，溶于蒸馏水中，稀释至50ml。

2、0.2M磷酸氢二钠水溶液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，溶于蒸馏水中，稀释至50ml。

3、取31.25mL的0.2M磷酸二氢钠水溶液，18.75mL的0.2M磷酸氢二钠水溶液，均匀混合制成0.2M的磷酸缓冲液，然后稀释10倍配制20mM磷酸缓冲液，并微调pH至6.6。

③3mM硝酸银溶液的制备：硝酸银MW：170g/M，称取0.051g粉末，溶于100mL蒸馏水中，配制成3mM的Ag⁺溶液。记为B液。

④1.5mM的NaBH₄溶液：NaBH₄(MW：37.83g/M)，称取0.113g粉末，溶于99.568mL蒸馏水中，配置成30mM的NaBH₄溶液。吸取200μl 30mM的NaBH₄溶液，加入3.8mL蒸馏水，配置成1.5mM的NaBH₄工作液。记为C液。

制备银纳米簇探针的操作步骤如下:

①向1.5mL离心管中加入15μL的A液，保证最终体积100μL时终浓度为15μM；

②将15μL A液与73μL上述配制的20mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.6)混合，混合液涡旋2s，然后14 000rpm离心30s；

③加入6μL B液，使Ag⁺与组合物一摩尔比例为6:1。混合液涡旋2s，然后14000rpm离心30s；

④混合液室温避光放置10min；

⑤混合液中快速加入6μL新制备的1.5mM的C液，然后剧烈摇动1min；

⑥室温避光孵育8小时以上。

(三)非对称PCR过程

非对称PCR与传统PCR有很多相似之处，区别在于非对称PCR中两条引物的添加量不同，从而可以使扩增结果中生成大量的单链。

非对称PCR反应体系如表1所示。

表1

注：表1中，组合物二+引物1代表引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。

(四)PCR产物与银纳米簇探针杂交

将25μL的上述非对称PCR反应完成后的反应体系加到100μL上述(二)制备好的15μM银纳米簇探针溶液中。混合溶液涡旋混匀、离心后，90-95℃水浴1min，逐渐冷却至室温并保持1h。之后对反应体系的荧光进行检测。

实施例2、针对转基因玉米MON810的35S启动子的DNA银纳米簇荧光可视检测技术的建立

(一)组合物的设计

本实施例根据转基因玉米MON810的外源基因筛选元件35S启动子的部分核苷酸序列，设计了如表2所示的用于DNA银纳米簇荧光可视检测的组合物。

表2

表2中的AG-F中从5’端开始依次包括实施例一的组合物二中的银纳米簇激发序列的杂交互补序列、识别序列(斜体部分)和引物1；AG-R为引物2；具体的，银纳米簇激发序列的互补杂交序列为5′-CCCCACCCCACCCCACCC-3′(序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列)、识别序列为5′-TATAATAAATTTTAAATATTATTTATTAAT-3′(序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列)、特异性扩增35S启动子的引物15′-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3′(序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列)。

表2中的组合物一包括与银纳米簇成核序列(带下划线部分)和识别序列，具体的，银纳米簇成核序列为5′-CCCTTAATCCCC-3′(序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列)和识别序列5′-TATAATAAATTTTAAATATTATTTATTAAT-3′(序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列)。

表2所示序列均由人工合成获得。

(二)形成银纳米簇探针

与实施例1(二)所述过程相同，其中所述组合物一具体为表2所示的组合物一。

(三)非对称PCR过程

与实施例1(三)所述反应体系和反应条件相同，其中，表1中的组合物二+引物1、引物2、靶标DNA具体分别为表2中的AG-F和AG-R以及转基因玉米MON810的基因组DNA(浓度为50ng/μL)。

(四)PCR产物与银纳米簇探针杂交

与实施例1(四)所述过程相同。最后可通过酶标仪测得反应体系的荧光数值，用580nm的光源激发，荧光发射范围是600-740nm(银纳米簇的理论最大发射波长为640nm)。

实施例3、针对转基因玉米MON810的35S启动子的DNA银纳米簇荧光可视检测技术条件的优化

(一)银纳米簇探针制备过程中避光孵育时间的优化

实验分3组进行，制备银纳米簇探针步骤与实施例1(二)所述过程相同，不同的是将步骤⑥所述的室温避光孵育分别依次设置为14h、10h、8h三组；其中所述组合物一具体为表2所示的组合物一。

直接用人工合成的含激发序列的单链产物代替实施例1(四)所述过程中的非对称PCR反应完成后的反应体系，分别与上述3组实验制备得到的银纳米簇探针进行杂交，单链产物与银纳米簇探针杂交的其它过程与实施例1(四)所述过程相同。

人工合成的含激发序列的单链产物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：8所示：5′-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3′。

杂交反应完成后，在紫外光下检测结果。

紫外检测结果显示，当孵育时间为8h或10h时，与含激发序列的单链产物杂交后，反应体系没有明显发出荧光。当孵育时间增加为14h时发出荧光变明显。

紫外检测结果说明表2所示的组合物一在与银离子结合时，在本实验的缓冲液浓度及还原性硼氢化钠浓度下，至少14h避光孵育，能达到理想的效果。因此挑选14h作为银纳米簇避光孵育的时间用作后续实验。

(二)非对称PCR过程中上、下游引物序列添加量的优化

优化实验分为实验组一至实验组十共10组，按照实施例2(三)所述反应体系分别配制10组反应体系，不同的是，配制实验组一至实验组十的10组反应体系时，保持AG-R加入反应体系后的终浓度为400nM，使得加入反应体系后，AG-F与AG-R在实验组一至实验组十的反应体系中的终浓度比分别依次为AG-F：AG-R＝1:10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100。

按照实施例2(三)所述反应条件进行非对称PCR反应。

将实验组一至实验组十的非对称PCR反应产物进行2％凝胶电泳分析，结果如图1所示。

从图1中可以看出，当上下游引物浓度比是1：10(泳道1)和1:20(泳道2)时，上游引物处于较高浓度，此时的产物中仍然是以双链为主(双链产物123bp)。当上下游引物浓度比下降至1:30(泳道3)时，产物中的单链产物明显增多(123nt的单链产物琼脂糖电泳条带不会达到Marker的100bp处)。当引物浓度比达到1:60时(泳道6)，单链产物条带亮度很大且双链产物明显减少。因此可选择AG-F：AG-R＝1:30以下的浓度比进行非对称PCR反应，优选AG-F：AG-R＝1:60以下的浓度比进行非对称PCR反应。

实施例4、针对转基因玉米MON810的35S启动子的DNA银纳米簇荧光可视检测技术的可行性验证

可行性验证实验设置了两组，分别为实验组A和NTC对照组B。

实验组A按照实施例2所述过程进行反应，其中，银纳米簇避光孵育时间选取14h，非对称PCR反应过程中上下游引物浓度比选为1:60。

NTC对照组将非对称PCR反应体系中的转基因玉米MON810的基因组DNA替换为水，其它过程也均按照实施例2所述过程进行反应，其中，银纳米簇避光孵育时间选取14h，非对称PCR反应过程中AG-F：AG-R＝1:60。

实验结果如图2所示。图2中实验组A的结果明显发出了红色荧光，而NTC对照组B没有发出红色荧光。因此本发明提供的DNA银纳米簇荧光可视检测技术可以用于对转基因筛选元件35S启动子的检测。

实施例5、针对转基因玉米MON810的35S启动子的DNA银纳米簇荧光可视检测技术的可重复性和灵敏度验证

实验分为7组，将转基因玉米MON810的基因组DNA样品浓度梯度稀释，分别依次制成浓度为10ng/μL，7.5ng/μL，5ng/μL，2ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1pg/μL的样品，以不同浓度的样品为非对称PCR反应过程中模板，然后按照实施例2所述过程进行反应，其中，银纳米簇避光孵育时间选取14h，非对称PCR反应过程中AG-F：AG-R＝1:60。

将每组样品都在相同条件下测量三次来验证该检测技术的可重复性。

实验结果如图3、图4所示。

图3、图4所示结果表明，随着模板样品浓度的下降，反应体系的荧光强度呈现出下降的趋势。在模板样品浓度0.5ng/μL至10ng/μL的范围内存在线性关系。如图4所示，以理论最大吸收波长640nm处的荧光强度的平均值为纵坐标，以模板浓度为横坐标，拟合的标准曲线，具有良好的线性关系，其R²＝0.994。因此该方法的检测限为0.5ng/μL。此外该方法从0.5ng/μL至10ng/μL都进行了三次重复实验对重复性进行了验证，其对应的相对标准偏差为5.5％、2.6％、4.6％、6.1％、7.2％和2.2％，具有良好的重复性。

实施例6、针对转基因玉米MON810的35S启动子的DNA银纳米簇荧光可视检测技术的特异性验证

以6种我国发放进出口安全证明的转基因作物，转基因大豆GTS40-3-2和MON89788，转基因玉米BT176，BT11，GA21和MIR604的基因组DNA分别作为非对称PCR过程中的靶标DNA模板(基因组浓度50ng/μL)，然后按照实施例2所述过程进行反应，其中，银纳米簇避光孵育时间选取14h，非对称PCR反应过程中AG-F：AG-R＝1:60。

实验结果如图5所示。

图5所示结果结合表3的结果，可以看出插入序列中含有35S启动子的转基因品系GTS40-3-2、BT176和BT11的荧光强度明显高于不含有35S启动子的MON89788和MIR604。且BT11由于其插入序列中含有两个35S启动子序列，因此荧光强度要显著高于只含有一个35S启动子序列的GTS40-3-2和BT176。这说明本研究方法的特异性良好，没有出现假阳性和假阴性现象，可以用于转基因作物的日常检测。

表3

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 核苷酸组合物、试剂盒及检测方法

<130> MP1826710Z

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccccacccca ccccacccta taataaattt taaatattat ttattaatcg acagtggtcc 60

caaaga 66

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aagacgtggt tggaacgtct tc 22

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cccttaatcc cctataataa attttaaata ttatttatta at 42

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccccacccca ccccaccc 18

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tataataaat tttaaatatt atttattaat 30

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cgacagtggt cccaaaga 18

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cccttaatcc cc 12

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

attaataaat aatatttaaa atttattata gggtggggtg gggtgggg 48

Claims

1.一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，所述组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，所述银纳米簇成核序列用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；所述组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，所述组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；所述组合物二的序列的杂交互补序列可与所述组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；其特征在于，所述核苷酸组合物还包括一引物对，所述引物对包括引物1和引物2，所述引物1与所述组合物二连接；所述引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

2.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于包括以下(1)-(5)的一项或多项：

(1)所述银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；

(2)所述识别序列为富A、T序列；

(3)所述引物1与所述引物2的摩尔比在1:30以下；

(4)所述组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；

(5)所述组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，所述引物1的5′端与所述组合物二的所述识别序列的3′端连接。

3.根据权利要求1或2所述的核苷酸组合物，其特征在于，包括下述1)-4)中的至少一种：

1)所述银纳米簇成核序列为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；

2)所述银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；

3)所述识别序列为序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；

4)所述引物1与所述引物2的摩尔比为1:60。

4.一种试剂盒，其特征在于包括银纳米离子和权利要求1-3任一项中的核酸组合物。

5.一种检测方法，其特征在于，所述方法包括，

利用组合物一制备银纳米簇探针；

利用靶标序列、组合物二和引物对进行非对称PCR反应；

非对称PCR产物与所述银纳米簇探针杂交结合；

其中，所述组合物一包括由识别序列和银纳米簇成核序列组成的序列，所述银纳米簇成核序列可与银纳米离子结合形成银纳米簇；

所述组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，所述组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；所述组合物二的序列的杂交互补序列可与所述组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；其特征在于，所述核苷酸组合物还包括一引物对，所述引物对包括引物1和引物2，所述引物1与所述组合物二连接；所述引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

6.根据权利要求5所述的一种检测方法，其特征在于包括以下(1)-(7)的一项或多项：

(1)所述利用组合物一制备银纳米探针方法包括：

将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混和后，再与硝酸银溶液混合，然后再加入NaBH₄溶液混和后室温避光孵育14小时以上；

(2)所述非对称PCR反应体系中所述引物1与所述引物2的摩尔比在1:30以下；

(3)所述非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合包括将非对称PCR反应完成后的反应体系制备好的银纳米簇探针溶液混和，90-95℃水浴1min，冷却至室温；

(4)所述银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；

(5)所述识别序列为富A、T序列；

(6)所述组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；

(7)所述组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，所述引物1的5′端与所述组合物二的所述识别序列的3′端连接。

7.根据权利要求5所述的一种检测方法，其特征在于包括以下(1)-(6)的一项或多项：

(1)将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混和后，再与硝酸银溶液混合，使Ag⁺与组合物一摩尔比例为6:1，然后再加入NaBH₄溶液混和后室温避光孵育14-22小时；

(2)所述非对称PCR反应体系总体积为25μl，1μl浓度为1uM的组合物二+引物1，1μl浓度为10uM的引物2，2μl的dNTP，0.2μl Taq酶，2μl靶标DNA，10μl 10x Buffer，余量为超纯水；

(3)非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min；

(4)所述非对称PCR反应体系中所述引物1与所述引物2的摩尔比为1:60；

(5)所述银纳米簇成核序列为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；

所述银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；

(6)所述识别序列为序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列。

8.一种转基因作物的可视性检测方法，其特征在于所述方法包括：

制备银纳米簇探针

将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混匀，再与硝酸银溶液混合，使Ag⁺与组合物一摩尔比例为6:1，快速加入NaBH₄溶液混匀后室温避光孵育14小时；所述组合物一的序列为序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；

非对称PCR扩增

非对称PCR反应体系总体积25μl，1μl浓度为1uM的组合物二5’端连接引物1，1μl浓度为10uM的引物2,2μl的dNTP，0.2μlTaq酶，2μl待测转基因作物样品DNA，10μl 10x Buffer，余量为超纯水；

所述组合物二的序列由序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列3’端连接序列表中SEQID №：5所示核苷酸序列组成；所述引物1和引物2为根据转基因作物外源基因所设计的特异性扩增引物对，所述引物1与所述引物2的摩尔比为1:60；所述待测转基因作物样品DNA浓度大于0.5ng/μL；

非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min；

非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合

将非对称PCR反应完成后的反应体系加到制备好的银纳米簇探针溶液中，混匀，90-95℃水浴1min，冷却至室温；

紫外光下检测。

9.权利要求1-3任一项所述的核苷酸组合物的应用，其特征在于，应用于转基因产品的检测或制备中。

10.权利要求4所述试剂盒的应用，其特征在于，应用于转基因产品的检测或制备中。