CN110195111A - 一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明首先筛选出一个绵羊源通用内标准基因CALPONIN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在绵羊物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定绵羊源的靶基因。以该基因为靶序列设计了PCR扩增引物，与PCR反应液一起进行扩增，PCR反应产物用于铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测。PCR反应结合基于铂钯纳米颗粒的免疫层析试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的绵羊源成分，检测灵敏度可达0.8％(w/w)。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

Description

一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测食品中绵羊源成分的聚合酶链式反应技术(PCR)结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。

背景技术

随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，香肠中掺杂其他肉类等等行为。目前，PCR方法是检测食品掺假简单有效的方法，其操作简单、时间短、检测准确性高。因此，本发明目的是提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

PCR方法是目前应用比较广泛的方法，其原理是利用一种DNA聚合酶和一对与模板互补配对的特异性引物，通过一系列的变性、退火、延伸等步骤，使模板DNA总量不断增加的过程。

免疫层析试纸是为了实现快速检测而衍生出的一种高精度、低价格、易操作的检测方法，通常由样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜、吸水垫、背板几部分组成。检测原理与酶联免疫吸附测定类似，但是检测过程更为简单、便携、易于操作。免疫层析试纸有夹心法、竞争法和间接法3种。铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条属于夹心法，其原理是将待测物质的特异性抗体交联到纳米颗粒上以及侧流层析传感器的检测线上，当纳米颗粒-抗体复合物和抗原结合后，该复合物再与检测线上包被的抗体相结合，形成三明治夹心结构。通过观察检测线和控制线颜色的变化实现目视定性检测。

铂钯纳米颗粒就是在铂纳米催化剂中引入第二金属元素钯，即在纳米铂颗粒上包裹一层钯，形成具有球壳结构铂钯双金属颗粒。铂钯纳米颗粒具有优越的类辣根过氧化物酶活性，可以在H2O2存在的情况下成功使TMB溶液显现明显的蓝色。因此，本发明将铂钯纳米颗粒应用于免疫层析试纸上，以起到增强检测线的作用，极大的提高了检测灵敏度。

本发明将特异性PCR技术同铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测结合起来，提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。本发明无需复杂的仪器，时间短，操作简单，灵敏度高，只需要一台普通PCR仪就可以满足检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测食品中绵羊源成分的绵羊源通用内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中绵羊源成分的特异性PCR结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。

一种用于检测食品中绵羊源成分的基因，其为内标准基因CALPONIN，具有SEQ IDNO.1所示的序列。

本发明提供了上述内标准基因CALPONIN在检测绵羊源成分中的应用。

本发明提供了上述内标准基因CALPONIN在食品中绵羊源成分鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于检测上述内标准基因CALPONIN的特异性PCR引物组合，包括以下2条引物：

F：5’-GGGTTGGAGCGGGTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:2)；

R：5’-CACCGAAAGCGACCAGACACTA-3’(SEQ ID NO:3)；

其中上游引物F的5’端标记生物素(Biotin)，下游引物R的5’端标记荧光素(FITC)。

本发明提供了上述特异性PCR引物组合在绵羊源成分鉴定中的应用。

本发明提供了上述特异性PCR引物组合在制备绵羊源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。

进一步地，本发明提供一种含有上述特异性PCR引物组合的检测绵羊源成分的快速检测试剂盒。

本发明提供一种检测食品中绵羊源成分的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品提取DNA；

(2)以提取DNA为模板，采用权利要求3所述特异性PCR引物组合进行PCR检测；

(3)结果判断：采用铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条进行结果判断。检测T线和质控C线均有蓝色条带，含有目的基因；质控C线有蓝色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因。

上述方法中，步骤(2)所述PCR检测，其25μL PCR检测体系的具体配置为：10×reaction buffer，0.4mM dNTP，0.2μM引物F，0.2μM引物R，2UTaq PCR polymerase。

上述方法中，PCR检测反应条件为：95℃5min；95℃30s,53℃30s,72℃30s,共30个循环；72℃5min。

上述方法中，步骤(3)所述的铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条包含测试线与质控线，测试线标记有FITC抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有铂钯纳米颗粒-生物素抗体标记物。

本发明首次在染色体上筛选出绵羊源内标准基因。本发明用多个品种绵羊验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。

图1为免疫层析试纸示意图。本发明利用PCR反应，设计两条引物针对绵羊特异性内标准基因靶序列进行基因扩增。然后用铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测PCR反应产物。铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条测试线(TL)与质控线(CL)分别标记有FITC抗体和生物素二抗，结合垫有铂钯纳米颗粒-生物素抗体标记物。

当PCR反应产物滴加到试纸条样品垫时，由于毛细管作用，产物会依次经过结合垫、检测线(TL)、质控线(CL)，由于“抗原-抗体”的特异性结合作用和铂钯纳米颗粒的催化作用，PCR反应产物为阳性时，测试线(TL)与质控线(CL)均有蓝色条带；反应产物为阴性时，则只有质控线(CL)有蓝色条带。

免疫层析试纸以“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物和“抗原-抗体”识别体系为基础构建了三层夹心结构。在一个标准的检测过程中，将含有绵羊源成分的样品和体系缓冲液混合加在样品垫，溶液在毛细管力的作用下会随着侧流层析试纸向上移动并到达结合垫。在结合垫上，含有绵羊源的特异PCR产物与溶解的“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物中的抗体发生基于“抗原-抗体”的免疫反应，形成“铂钯纳米颗粒-抗体”与抗原结合的新复合物。之后该复合物会沿着免疫层析试纸继续向上移动，当其到达检测线时，PCR产物与检测线上的相应抗体发生第二次基于“抗原-抗体”的免疫反应。因此，含有铂钯纳米颗粒的复合物就会被抓取并堆积于检测线上，生成一条特征性的黑色条带。之后过量的“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物会向着质控线迁移，当其到达质控线后，“铂钯纳米颗粒-抗体”功能探针中的抗体会被质控线上羊抗鼠IgG捕获，形成第二条特征性的黑色条带。因铂钯纳米颗粒还具有类辣根过氧化物酶活性，在检测线或指控线堆积的铂钯纳米颗粒可以与辣根过氧化物酶底物和H₂O₂反应产生特异性蓝色非溶解性产物，从而起到提升检测线信号强度，进而提升检测灵敏度。

铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本发明通过将绵羊肉肉末与非绵羊肉肉末进行5倍梯度等质量的混合，通过PCR反应结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测以探究本检测方法的灵敏性。结果显示，本发明检测试剂盒的检测极限为0.8％(w/w)。

基于本发明确定的用于检测食品中绵羊源成分的内标准基因CALPONIN，本发明设计了用于检测该基因的PCR引物组合，应用PCR反应结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条可检测待测样品中是否有绵羊源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为免疫层析试纸示意图；

图2为绵羊特异性内标准基因在16种动物中的特异性PCR扩增，泳道1为绵羊的PCR产物，1：绵羊；2：猪；3：狗；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；17：阴性；M:Maker DL2000；

图3为绵羊源PCR产物铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测中阳性与阴性结果的判断,样品1的测试线(TL)与质控线(CL)均有蓝色条带则证明为阳性样品，其他样品只有质控线(CL)有蓝色条带则为阴性样品。1：绵羊；2：驴；3：猪；4：牛；5：山羊：6：鸡；7：鸭；8：鹅：9：马；10：阴性；

图4为PCR-铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条的检测灵敏度试验,1：混合梯度0倍，即为原始质量的100％；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20％；3：混合梯度25倍，即为原始质量4％；4：混合梯度125倍，即为原始质量0.8％；5：混合梯度625倍，即为原始质量0.16％；6：阴性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

猪(Sus scrofa)，牛(Bos taurus)，羊(Ovis aries)，普通家鸡(Calponinluscalponinlus)，野鸡(Phasianuscolchicus)，火鸡(Meleagris calponinlopavo)，乌鸡(Calponinlus domesticus brisson)，鸭(Anas platyrhynchos)，鹅(Goosecalicivirus)，狗(Canis lupus familiaris)，兔(Oryctolagus cuniculus)，牦牛(Bosmutus)，黄鱼(Pseudosciaena polyactis)为超市购买。马(Equus caballus)，驴(Equusasinus)为北京农贸市场购买。老鼠(Mus musculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，骆驼(Camelus ferus)，鹿(Cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供。

实施例1绵羊源通用内标准基因CALPONIN的筛选

通过搜索GenBank中关于绵羊的基因信息，将目标基因组从NCBI下载，并保存为“.FASTA”格式。针对绵羊的全基因组信息进行分析，利用BLAST和DNAMAN Version 4.0软件进行同源性分析，筛选出CALPONIN基因，该基因位于染色体上，编码钙调理蛋白基因。将20种肉类(分别是普通家鸡(Calponinlus calponinlus)，野鸡(Phasianuscolchicus)，火鸡(Meleagris calponinlopavo)，乌鸡(Calponinlus domesticus brisson)，猪(Susscrofa)，牛(Bos taurus)，羊(Ovis aries)，鸭(Anas platyrhynchos)，鹅(Goosecalicivirus)，狗(Canis lupus familiaris)，兔(Oryctolagus cuniculus)，牦牛(Bosmutus)，黄鱼(Pseudosciaena polyactis)，马(Equus caballus)，驴(Equus asinus)，老鼠(Mus musculus)，水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，骆驼(Camelusferus)，鹿(Cervus))的CALPONIN基因导入DNAMAN Version 4.0，进行多序列特异性分析，序列比对结果保存为“.seq”格式。选择特异性高的片段再进行BLAST分析，查找数据库中序列同源性及特异性。最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因CALPONIN基因可以作为内标准基因。该CALPONIN片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2绵羊源成分PCR检测方法的建立

利用primer premier5.0软件设计针对实施例1确定的CALPONIN基因设计PCR引物，上游引物F的5’端标记生物素(Biotin)，下游引物R的5’端标记荧光素(FITC)。见表1。

表1 PCR引物序列

利用PCR快速检测绵羊样品，反应体系25μL，包括10×reaction buffer，0.4mMdNTP，0.2μM引物F，0.2μM引物R，2U Taq PCR polymerase。反应程序为95℃5min；95℃30s,53℃30s,72℃30s,共30个循环；72℃5min。扩增结束后，利用2％琼脂糖凝胶电泳进行产物判定，出现特异性条带证明扩增成功，含有目的基因。结果如图2所示，绵羊特异性内标准基因在16种动物中的PCR扩增，泳道1为绵羊的PCR产物，1：绵羊；2：猪；3：狗；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；17：阴性；M:Maker DL2000。只有绵羊样品出现明亮条带，表明CALPONIN基因以及相应的PCR体系能用于绵羊种类的快速检测。

实施例3绵羊源成分PCR产物铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测方法的建立

铂钯纳米颗粒标记抗体采用夹心法制备，制备好后于4℃下储存备用。分别将FITC抗体用缓冲液稀释至最佳浓度。测试线(TL)与质控线(CL)间的距离为4.5mm，按1.0μL/cm分别喷涂在NC膜上。将已喷好的NC膜37℃烘干过夜后备用。试纸条切成3.8mm宽。

将PCR反应产物与缓冲液充分混合后滴加在铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条的样品垫上，此时混合液在毛细管动力下经过结合垫与NC膜，并继续向吸水垫方向移动，3min后即可观察检测结果。如图3所示，样品1的测试线(TL)与质控线(CL)均有蓝色条带则证明为阳性样品，样品2只有质控线(CL)有蓝色条带则为阴性样品。

铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。通过将绵羊肉肉末与非绵羊肉肉末(猪、绵羊、老鼠等混合肉末)进行5倍梯度等质量的混合，进行PCR反应，再与铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条相结合以探究铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测方法的灵敏性。结果如图4所示，1：混合梯度0倍，即为原始质量的100％；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20％；3：混合梯度25倍，即为原始质量4％；4：混合梯度125倍，即为原始质量0.8％；5：混合梯度625倍，即为原始质量0.16％；6：阴性。当混合梯度为125倍(混合肉末质量为绵羊肉末质量的125倍)即为初始质量的0.8％时，仍然可以出现很淡的检测条带。当混合梯度为625倍(混合肉末质量为绵羊肉末质量的625倍)即为初始质量的0.1％时，几乎检测不到TL线，故本发明检测试剂盒的检测限为0.8％(w/w)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒及其应用

<130> MP1907458Z

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> DNA

<213> 绵羊Calponin(Ovis aries calponin)

<400> 1

aggtatggcc ctttcctcgc ctgggtcttg ctgatgagct gtggttgagg agggcaccct 60

ggtccctgca ggctttggtg ggttggagcg ggtacagaat atgtggtctt taggaaaccc 120

tatgcttagc attttcggta ccttaactca ctcctctgac agtcctaggg ggtgggtact 180

gttaccgtca tgccctttat acagatggga aaactgaggc ctggaggtta gcacacttgc 240

taggattgct caggtgatga gtagctgaac cctggaaatc aggccactta gcagtcatgt 300

gacacacctt ctctgagcct cagtttccat tctgttgccc caggggggtg gaaacagggc 360

ctcattagag ggccatgtga ctgctgacat cagtagtgtc tggtcgcttt cggtgggatc 420

ctgtaacccc ccgggtgact ctcctcctgg ctccct 456

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggttggagc gggtacagaa ta 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgaaagc gaccagacac ta 22

Claims (10)

1.一种用于检测食品中绵羊源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.权利要求1所述的基因在检测绵羊源成分中的应用。

3.权利要求1所述的基因在食品绵羊成分鉴定中的应用。

4.用于检测权利要求1所述基因的特异性PCR引物组合，包括以下2条引物：

F：5’-GGGTTGGAGCGGGTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:2)；

R：5’-CACCGAAAGCGACCAGACACTA-3’(SEQ ID NO:3)；

其中上游引物F的5’端标记生物素(Biotin)，下游引物R的5’端标记荧光素(FITC)。

5.权利要求4所述的特异性PCR引物组合在绵羊源成分鉴定中的应用。

6.权利要求4所述的特异性PCR引物组合在制备绵羊源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。

7.一种检测食品中绵羊源成分的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测样品提取DNA；

(2)以提取DNA为模板，采用权利要求4所述特异性PCR引物组合进行PCR检测；

(3)结果判断：采用铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条进行结果判断，检测T线和质控C线均有蓝色条带，含有目的基因；质控C线有蓝色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR检测，其25μL PCR检测体系的具体配置为：10×reaction buffer，0.4mM dNTP，0.2μM引物F，0.2μM引物R，2U Taq PCRpolymerase。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR检测反应条件为：95℃5min；95℃30s,53℃30s,72℃30s,共30个循环；72℃5min。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条包含测试线与质控线，测试线标记有FITC抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有铂钯纳米颗粒-生物素抗体标记物。