CN108342495A - 肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒 - Google Patents
肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；绵羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；绵羊探针序列如SEQ ID No.4所示；山羊探针序列如SEQ ID No.5所示；质控探针序列如SEQ ID No.6所示。本发明的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测，并且可以进行绵羊源性和山羊源性的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及肉制品中动物源性检测领域。
背景技术
羊肉是消费者广泛食用的家畜肉之一。羊肉不仅营养丰富、肉质细嫩、容易消化，还具 有高蛋白、低脂肪、含磷脂多、胆固醇少的特点。然而，伴随着日益增长的生产量和消费量， 肉制品成为在食品生产、加工、流通以及餐饮领域中造假掺假的主要目标。
目前，肉制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中 在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。 假阴性一直是困扰PCR技术在肉制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控是去除假阴性 的有效手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品中绵羊源性、山 羊源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉制品中绵羊和山羊源性成分 定性和定量检测问题。
本发明的技术方案为：肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针， 引物和探针序列如下：
两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；
绵羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；
绵羊探针序列如SEQ ID No.4所示；
山羊探针序列如SEQ ID No.5所示；
质控探针序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地，绵羊探针、山羊探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬 灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、 BHQ1或BHQ2中任意一种。
作为本发明的另一目的，提供了一种肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的 试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.4所示的绵羊探针，
SEQ ID No.5所示的山羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
绵羊阳性标准品，
山羊阳性标准品。
当然，也可以单独检测绵羊源性，为了节省成本，只需要去除山羊源性相关的试剂即可 (SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物、SEQ ID No.5所示的山羊探针和山羊阳性标 准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中绵羊源性以及质控同管检测的 试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.4所示的绵羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
绵羊阳性标准品。
当然，也可以单独检测山羊源性，为了节省成本，只需要去除绵羊源性相关的试剂即可(SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物、SEQ ID No.4所示的绵羊探针和绵羊阳性标 准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中山羊源性以及质控同管检测的 试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.5所示的山羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
山羊阳性标准品。
肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
(1)提取肉制品的DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL；
(3)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用绵羊和山羊阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取绵羊、山羊和质控相应 探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；
(5)利用绵羊和山羊阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源 性的定量检测结果。
进一步地，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的 两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10 μmol/L；SEQ ID No.4所示的绵羊探针1μL，浓度为10μmol/L；、SEQ ID No.5所示的山羊 探针1μL，浓度为10μmol/L和SEQ ID No.6所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L； DNA模板1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
本发明通过比对绵羊、山羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、猫及鱼等12种动物 的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件 比对上述120条序列，筛选出绵羊和山羊保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和 探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的 退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物 和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
本发明研发了绵羊、山羊及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同 管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之 间的影响以及对模板以及PCR反应资源的竞争的问题，达到PCR反应体系可以同时进行多 重实时荧光PCR的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现肉制品中绵羊和山羊源 性的定性和定量检测，并且可以进行绵羊、山羊和质控的同时检测，节省了工序，降低了成 本。
附图说明
图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对绵羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、 猫及鱼等11种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量PCR的检测，绵羊肉中出现扩 增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明绵羊源性引物和探针具有特异性。
图2利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对山羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、 猫及鱼等11种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量PCR的检测，山羊肉中出现扩 增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明山羊源性引物和探针具有特异性。
图3利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性对绵羊DNA(100ng、10ng、1ng、 0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，绵羊源性 探针可以检测到0.01pg的绵羊源性DNA。以上结果说明绵羊探针在肉制品的源性检测方面 具有较高的灵敏度。
图4利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性对山羊DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，山羊源性 探针可以检测到0.1pg的山羊源性DNA。以上结果说明山羊探针在肉制品的源性检测方面 具有较高的灵敏度。
图5绵羊源性检测标准曲线：用于肉制品中绵羊源性的定量检测。
图6山羊源性检测标准曲线：用于肉制品中山羊源性的定量检测。
图7利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对绵羊肉和山羊肉梯度混合样品(0.1％、1％、 10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行绵羊、山羊和质控的同时检测，结果显示 绵羊探针都可以检测到1％水平混合样品，山羊探针都可以检测到10％水平混合样品。以上 结果说明混合探针(绵羊、山羊以及质控对照)具有绵羊源性、山羊源性以及质控对照同时 同管检测能力。
图8利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对混合样品(30％绵羊肉和70％山羊肉)进行 绵羊、山羊和质控的同时检测，绵羊源性(绵羊-FAM)、山羊源性(山羊-HEX)及质控对 照(质控对照-ROX)都出现扩增曲线。以上结果说明混合探针(绵羊、山羊以及质控对照) 具有绵羊源性、山羊源性以及质控对照同时同管检测能力。
图9利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性和HEX和TAMRA修饰探针标记山 羊源性分别对绵羊肉和山羊肉梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％ 和99.9％)进行绵羊和山羊源性的分别检测，结果显示绵羊、山羊探针都可以检测到0.1％ 水平混合样品。以上结果说明绵羊和山羊探针具有千分之一掺假的检测能力。
具体实施方式
1、检测方法：
(1)提取肉制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用绵羊和山羊阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。
表1 Real-time PCR反应体系(绵羊、山羊和质控的同时检测)
表2 Real-time PCR反应体系(绵羊源性以及质控同时检测)
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 两源性检测正向引物 | 1 |
| 绵羊源性检测反向引物 | 1 |
| 绵羊探针 | 1 |
| 质控探针 | 1 |
| DNA | 1 |
| 灭菌的去离子水 | 5 |
| 总体积 | 20 |
表3 Real-time PCR反应体系(山羊源性以及质控同时检测)
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 两源性检测正向引物 | 1 |
| 山羊源性检测反向引物 | 1 |
| 山羊探针 | 1 |
| 质控探针 | 1 |
| DNA | 1 |
| 灭菌的去离子水 | 5 |
| 总体积 | 20 |
表4 Real-time PCR扩增参数
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取绵羊、山羊和质控相应 探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性。
(5)利用绵羊和山羊阳性标准品(稀释101到107倍)做DNA定量的标准曲线。
(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源 性的定量检测结果。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在肉制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计 绵羊、山羊和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按 照发明的序列进行合成和纯化。
两源性检测正向引物：5'TTGAATCAGGCCATGAAGC 3'(SEQ ID No.1)，
绵羊源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC 3'(SEQ ID No.2)，
山羊源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTATCTC 3'(SEQ ID No.3)，
绵羊探针：5'CCTCTCGTGTGGTTGATATATGTAAATAGGTT 3'(SEQ ID No.4)，
山羊探针：5'TCTCATGTAGTTGATGCGTGTTAATAGGCT 3'(SEQ ID No.5)，
质控探针：5'ACACACCGCCCGTCACCCT 3'(SEQ ID No.6)；
绵羊、山羊和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报 告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或 BHQ2中任意一种。
3、引物和探针的特异性检测
单源性检测的Real-time PCR反应体系如下表所示
利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性 及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对绵羊、山羊、牛肉、马肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、 鹅肉、狗肉、兔肉、猫肉及鱼肉进行qPCR的检测。
检测结果如下：
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。 在绵羊肉中检测出绵羊源性，在山羊肉中检测出山羊源性，而在其他肉中没有检测到绵羊和 山羊源性。
4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验
将绵羊和山羊的基因组DNA分别稀释101到107倍(共8个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，绵羊源性探针可以检测到样品中10fg的绵羊源性DNA，山羊源性探针可以检测到样品中100fg的山羊源性DNA。以上结果说明自主 研发的绵羊和山羊引物和探针的检测限度达到fg水平，检测的灵敏度较高。
检测结果如下：
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
5、利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对绵羊肉和山羊肉梯度混合样品(0.1％、1％、 10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行绵羊、山羊和质控的同时检测。
检测结果如下：
Ct值：平均值(三组数据)±标准差
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示绵羊探针都可以检测到1％水平混合样品，山羊探针都可以检测到10％水平混合样品。以上结果说明混合探针(绵羊、山羊以及质控对照)具有绵羊源性、山羊源性以及质控对照同管检测能力。
6、利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性和HEX和TAMRA修饰探针标记山羊 源性分别对绵羊肉和山羊肉梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％ 和99.9％)进行绵羊和山羊源性的分别检测。
检测结果如下：
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示绵羊、山羊探针都可以检测到0.1％水平混合样品。以上结果说明绵羊和山羊探针具有千分之一掺假 的检测能力。
7、试剂盒制作
(1)绵羊源性、山羊源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：
| 试剂 | 说明 |
| Probe qPCR预混液 | 反应体系(酶、dNTP、Mg2+) |
| 两源性检测正向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊源性检测反向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 山羊源性检测反向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊探针 | 浓度为10μmol/L |
| 山羊探针 | 浓度为10μmol/L |
| 质控探针 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于绵羊阳性对照及标准曲线 |
| 山羊阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于山羊阳性对照及标准曲线 |
| 灭菌的去离子水 | 补充反应体系 |
(2)绵羊源性检测试剂盒试剂如下表所示：
| 试剂 | 说明 |
| Probe qPCR预混液 | 反应体系(酶、dNTP、Mg2+) |
| 两源性检测正向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊源性检测反向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊探针 | 浓度为10μmol/L |
| 质控探针 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于绵羊阳性对照及标准曲线 |
| 灭菌的去离子水 | 补充反应体系 |
(3)山羊源性检测试剂盒试剂如下表所示：
序列表
<110> 申请人名称:锡林郭勒职业学院
<120> 肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaatcagg ccatgaagc 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttaccttgt tacgacttgt ctc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttaccttgt tacgacttat ctc 23
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctctcgtgt ggttgatata tgtaaatagg tt 32
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctcatgtag ttgatgcgtg ttaataggct 30
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacaccgcc cgtcaccct 19
Claims (8)
1.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：
两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示，
绵羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示，
山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示，
绵羊探针序列如SEQ ID No.4所示，
山羊探针序列如SEQ ID No.5所示，
质控探针序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，绵羊探针、山羊探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。
3.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.4所示的绵羊探针，
SEQ ID No.5所示的山羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
绵羊阳性标准品，
山羊阳性标准品。
4.肉制品中绵羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.4所示的绵羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
绵羊阳性标准品。
5.肉制品中山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，
SEQ ID No.5所示的山羊探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
山羊阳性标准品。
6.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取肉制品的DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL；
(3)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对DNA稀释液进行多重荧光定量PCR扩增，以绵羊和山羊阳性标准品做阳性对照，以灭菌的去离子水做阴性对照，以DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取绵羊、山羊和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；
(5)利用绵羊和山羊阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
7.根据权利要求6所述的肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
8.根据权利要求6所述的肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的绵羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ IDNo.4所示的绵羊探针1μL，浓度为10μmol/L；、SEQ ID No.5所示的山羊探针1μL，浓度为10μmol/L和SEQ ID No.6所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
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