CN109880918A - 肉制品中羊和猪源性同步检测的引物和探针及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肉制品中羊和猪源性同步检测的引物和探针及检测方法，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；猪源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；羊探针序列如SEQ ID No.4所示；猪探针序列如SEQ ID No.5所示；质控探针序列如SEQ ID No.6所示。本发明的引物和探针特异性好、灵敏度高，可以实现肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测，并且可以进行羊源性和猪源性的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及肉制品中动物源性检测领域。
背景技术
羊肉是消费者广泛食用的家畜肉之一。羊肉不仅营养丰富、肉质细嫩、容易消化、具有高蛋白、低脂肪、含磷脂多、胆固醇少的特点，同时羊肉的食用也没有宗教和文化的禁忌。20.3万平方公里的锡林郭勒盟有18万平方公里的优质天然草场，是传统的畜牧业生产区，同时具有发展现代畜牧业的优越条件，是国家和内蒙古自治区重要的绿色畜产品输出基地。肉制品除了含有丰富的常规营养成分之外，色、香、味俱佳的感官体验更是赋予其全球美食的内核。然而，伴随着日益增长的生产量和消费量，肉制品成为在食品生产、加工、流通以及餐饮领域中造假掺假的主要目标。
我国对于肉制品真伪鉴别技术方面的研究起步晚，这一领域的研究还处于初步阶段。由此可见，当前在肉制品真伪鉴别技术方面的研究领域，实现具有我国自主产权的、安全高效的检测技术是一个充满机遇同时极具挑战的研究课题。作为羊、牛、马、驼产品基地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的羊和猪相关肉制品真伪鉴别技术及检测标准，以此保护地方特色羊肉产品和维护消费者的合法权益。目前，肉制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。假阴性一直是困扰PCR技术在肉制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控是去除假阴性的有效手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的引物、探针及方法，解决肉制品中羊和猪源性成分定性和定量检测问题。
本发明的技术方案为：肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：
两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；
羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
猪源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；
羊探针序列如SEQ ID No.4所示；
猪探针序列如SEQ ID No.5所示；
质控探针序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地，羊探针、猪探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基因，3'端修饰有淬灭基团，报告基因为FAM、HEX或ROX中的任意一种，淬灭基团为TAMRA或BHQ2。
肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
(1)提取待检测的肉制品的DNA；
(2)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、猪和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；
(4)利用羊和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(5)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
进一步地，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的猪源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQID No.4所示的羊探针1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.5所示的猪探针1μL，浓度为10μmol/L和SEQ ID No.6所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
本发明通过比对羊、猪、牛、马、骆驼、驴、梅花鹿、鸡、鸭、鹅、狗、兔、猫及鱼等14种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出羊和猪保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
本发明研发了羊、猪及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及PCR反应资源的竞争的问题，达到PCR反应体系可以同时进行多重实时荧光PCR的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物和探针的特异性强、灵敏度高，可以实现肉制品中羊和猪源性的定性和定量检测，并且可以进行羊、猪和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。
附图说明
图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对鲜羊肉(A)、鲜猪肉(B)、羊肉干(C)及猪肉肠(D)进行的实时荧光定量PCR的检测。
图2利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性对鲜羊肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，羊源性探针可以检测到0.001pg的羊源性DNA(A)；利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性对羊肉干DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，羊源性探针可以检测到0.01pg的羊源性DNA(B)；利用HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性对鲜猪肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，猪源性探针可以检测到0.0005pg的羊源性DNA(C)；利用HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性对猪肉肠DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，猪源性探针可以检测到0.01pg的猪源性DNA(D)。
图3应用于鲜肉中羊源性定量检测的标准曲线(A)；应用于肉干中羊源性定量检测的标准曲线(B)；应用于鲜肉中猪源性定量检测的标准曲线(C)；应用于香肠中猪源性定量检测的标准曲线(D)。
具体实施方式
1、检测方法：
(1)提取鲜肉或加工肉制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL左右。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用羊和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。
表1 Real-time PCR反应体系(羊、猪和质控的同时检测)
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 两源性检测正向引物 | 1 |
| 羊源性检测反向引物 | 0.5 |
| 猪源性检测反向引物 | 0.5 |
| 羊探针 | 1 |
| 猪探针 | 1 |
| 质控探针 | 1 |
| DNA | 1 |
| 灭菌的去离子水 | 4 |
| 总体积 | 20 |
表2 Real-time PCR反应体系(羊源性以及质控同时检测)
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 两源性检测正向引物 | 1 |
| 羊源性检测反向引物 | 1 |
| 羊探针 | 1 |
| 质控探针 | 1 |
| DNA | 1 |
| 灭菌的去离子水 | 5 |
| 总体积 | 20 |
表3 Real-time PCR反应体系(猪源性以及质控同时检测)
表4 Real-time PCR扩增参数
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、猪和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性。
(5)利用羊和猪阳性标准品(稀释101到107倍)做DNA定量的标准曲线。
(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在肉制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计羊、猪和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
两源性检测正向引物：5'-CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC-3'(SEQ ID No.1)，
羊源性检测反向引物：5'-TTGAATCAGGCCATGAAGC-3'(SEQ ID No.2)，
猪源性检测反向引物：5'-TTGAATAAGGCCATGAAGC-3'(SEQ ID No.3)，
羊探针：5'-CCTCTCGTGTGGTTGATATATGTAAATAGGTT-3'(SEQ ID No.4)，
猪探针：5'-TTCTTGCATGGTTGTGTAATTGAATATAGGT-3'(SEQ ID No.5)，
质控探针：5'-ACACACCGCCCGTCACCCT-3'(SEQ ID No.6)。
羊、猪和质控探针序列的5'端修饰有报告基因，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基因为FAM、HEX或ROX，所述淬灭基团为TAMRA或BHQ2。
3、引物和探针的特异性检测
单源性检测的Real-time PCR反应体系如下表所示
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 两源性检测正向引物 | 1 |
| 羊或猪源性检测反向引物 | 1 |
| 相应源性探针 | 1 |
| 质控探针 | 1 |
| DNA | 1 |
| 灭菌的去离子水 | 5 |
4、利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对鲜羊肉、鲜猪肉、羊肉干及猪肉肠进行的实时荧光定量PCR的检测。如图1所示，所设计的引物和探针具有较好的特异性。
5、利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性对鲜羊肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，羊源性探针可以检测到0.001pg的羊源性DNA；利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性对羊肉干DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，羊源性探针可以检测到0.01pg的羊源性DNA；利用HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性对鲜猪肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，猪源性探针可以检测到0.0005pg的羊源性DNA；利用HEX和TAMRA修饰探针标记猪源性对猪肉肠DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，猪源性探针可以检测到0.01pg的猪源性DNA。如图2所示，所设计的引物和探针具有较好的灵敏度。
6、利用灵敏度实验的数据构建应用于鲜肉中羊源性定量检测的标准曲线、应用于肉干中羊源性定量检测的标准曲线、应用于鲜肉中猪源性定量检测的标准曲线以及应用于香肠中猪源性定量检测的标准曲线。如图3所示，所设计的引物和探针具有定量能力。
序列表
<110> 锡林郭勒职业学院
<120> 肉制品中羊和猪源性同步检测的引物和探针及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttaccttgt tacgacttgt ctc 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgaatcagg ccatgaagc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgaataagg ccatgaagc 19
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctctcgtgt ggttgatata tgtaaatagg tt 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcttgcatg gttgtgtaat tgaatatagg t 31
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacaccgcc cgtcaccct 19
Claims (5)
1.肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：
两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示，
羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示，
猪源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示，
羊探针序列如SEQ ID No.4所示，
猪探针序列如SEQ ID No.5所示，
质控探针序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，羊探针、猪探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基因，3'端修饰有淬灭基团，报告基因为FAM、HEX或ROX中的任意一种，淬灭基团为TAMRA或BHQ2。
3.肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待检测的肉制品的DNA；
(2)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对DNA进行多重荧光定量PCR扩增，以羊和猪阳性标准品做阳性对照，以灭菌的去离子水做阴性对照，以DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、猪和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；
(4)利用羊和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(5)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
4.根据权利要求3所述的肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。
5.根据权利要求3所述的肉制品中羊源性、猪源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的猪源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.4所示的羊探针1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.5所示的猪探针1μL，浓度为10μmol/L和SEQ IDNo.6所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。
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-
2019
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