CN105734157A - 一种快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量pcr引物、探针组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针及其试剂盒，涉及食品检验和分子生物学检测技术领域，利用本发明的引物、探针组合物以及实时荧光PCR联合检测试剂盒可以快速鉴定出含肉制品中的骆驼源成分。本发明应用实时荧光定量PCR技术及荧光探针核酸DNA分子标记技术，根据线粒体细胞色素b(Cytb)基因高度保守区域设计骆驼源性特异引物和特异探针，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势。

Description

一种快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR引物、探针组合物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品检验和分子生物学检测技术领域，具体涉及一种快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针及其试剂盒，特别是用于肉制品中骆驼源性的检验及鉴定。

背景技术

我国骆驼多产于内蒙古、新疆、甘肃、青海、宁夏等地、是世界上最大产地之一。骆驼全身都是宝，驼肉、驼奶、驼毛的开发利用价值大，是农牧民发家致富的好项目。驼肉含有蛋白质、脂肪、钙、磷、铁及维生素A、维生素Bl、维生素B2和尼克酸等成分。肉质细嫩，适口性好，并且含有大量的糖原，故肉甜，很像马肉，可与牛肉媲美。驼峰和驼掌具有很高的医药价值，是高档食品。性味甘温无毒，具有润燥、祛风、活血、消肿的功效。适宜顽痹不仁之风疾者食用。

现代科学研究表明：驼奶属于蛋白类型乳，蛋白质含量远高于马奶和牛奶，而脂肪含量比牛奶和马奶低，是典型的高蛋白低脂肪奶类，驼奶含有丰富的乳糖、维生素C、A、B1、B2、E等成分，易被消化吸收，尤其是生物价值特高的天然胰岛素的含量远远高于牛奶和马奶，并且胆固醇含量低，鲜味氨基酸和各种微量元素含量高。驼奶具有清洁肺和肠道功能，被认为是最具营养和保健作用的产品，将成为继牛奶产业后的第二奶产业。明代李时珍在《本草纲目》中记载：“驼乳味甘、温、无毒，可补中益气，壮筋骨，令人不饥。”实践证明，驼乳能助食开胃，促进新陈代谢，对肺结核、消化道溃疡、高血压、糖尿病等均有一定的辅助治疗作用。

驼毛和驼皮是很重要的商品，驼毛具有细柔轻滑、耐久、保暖性强、绝缘值比纯羊毛高50％等优良特性，被用来编制毛毯、衣物等。驼皮普遍被用来生产高档台灯罩和女士提包等。

虽然从驼肉、驼奶、驼毛、驼皮目前的市场需求情况看，都具有极大的市场空间。但是，因为当前随着优质草场的退化、沙漠化，碱性化等问题，骆驼存栏量逐年下滑，导致骆驼制品却出现了“有价无货”的尴尬局面。致使某些不法商贩用相对廉价的非骆驼类的肉奶毛皮冒充骆驼制品，欺骗消费者，从中谋取暴利。因此，针对骆驼源性制品建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方法是十分必要的。GB/T21100-2007《动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR法》公开了一种饲料中骆驼源成分的检测方法，利用常规PCR扩增待测样品基因后电泳后检测是否为骆驼源成分的方法，此方法步骤复杂、耗时、且检测灵敏度并不高，无法满足当前检测需求。

以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已逐步成为食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来TaqMan探针实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能。由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，已经广泛应用于各个领域。目前未有任何公开或报道一种利用TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法快速鉴别骆驼源性的方法。因此，建立一种快速鉴别骆驼源性的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法对相关食品安全的快速监管具有重要的创新性和实践意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于检测肉制品中骆驼源性成分的荧光定量PCR引物、探针；本发明的另一目的是提供一种检测肉制品中骆驼源性成分的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒操作方便，不易污染，准确稳定。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物，其特征在于，包括以下引物和探针，其核苷酸序列如下：

(1)引物

上游引物序列：5'ACAAAATCCCATTCCACCCCT3'，如SEQIDNO.1所示；

下游引物序列：5'CGGCTTAATGTGTGGTGGTG3'，如SEQIDNO.2所示；

(2)探针：

5'FAM-CGTACTGTTCTCACCAGACTTATTAGGA3'，如SEQIDNO.3所示。

骆驼Cytb基因参考序列：164bp

ACAAAATCCCATTCCACCCCTACTACACAATTAAAGACATCCTAGGAGCACTGCTACTAATATTAATTCTCCTTATTCTCGTACTGTTCTCACCAGACTTATTAGGAGATCCTGACAACTATACTCCCGCTAACCCCCTCAATACACCACCACACATTAAGCCG，如SEQIDNO.4所示。

本发明提供的一种鉴别骆驼源性成分的试剂盒，包括上述快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物，以及PCR反应所必需的反应原料和试剂。

本发明还可以具有以下附加技术特征：

优选的，所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：PCR缓冲液，MgCL2，dNTPs，Taq聚合酶和超纯水；反应条件为：试剂盒中各组分构成一个20μl的反应体系：2×TaqManMasterMix，pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U，所述引物、探针组合物的终浓度为0.4～1μM。

本发明另提供所述的快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物或所述的鉴别骆驼源性成分的试剂盒在鉴别骆驼源性成分中的应用。

本发明还可以提供一种鉴别骆驼的荧光定量PCR检测方法，使用上述TaqMan探针引物组合物及试剂盒在鉴别骆驼制品中的应用。鉴别方法为：取骆驼制品样品，提取基因组DNA，利用特异性引物及探针进行扩增，检测荧光信号。

本发明的一种鉴定肉制品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的基因组DNA，备用；

(2)利用权利要求1所述引物、探针组合物，或权利要求2或3所述的鉴别骆驼源性成分的试剂盒对步骤(1)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，收集荧光信号，进行判断，所述PCR扩增程序为：95℃，10min预变性；95℃10s，63℃35s，在此收集荧光信号，45个循环；

(3)结果判读：收集PCR过程中的荧光信号，通过相应的荧光信号扩增曲线、Ct值鉴别待检样本中是否含有骆驼源性成分。

本发明还可以具有以下附加技术特征：

优选的，上述的PCR检测方法还设置非骆驼源性基因组DNA模板作为阴性对照，和骆驼源性基因组DNA模板作为阳性对照。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μL反应体系时，其优选配置见表1。

表120μL反应体系

使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段可在任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，10min预变性；95℃10s，63℃35s，在此收集荧光信号，45个循环。

本发明主要原理：应用实时荧光定量PCR技术及荧光探针核酸DNA分子标记技术，根据线粒体细胞色素b(Cytb)基因高度保守区域设计骆驼源性特异引物和特异探针；建立并完善实时荧光PCR体系和扩增条件，进行骆驼动物源性成份的定性检测。

本发明与现有的检测技术相比其有益效果在于：

a.本发明基于线粒体DNA(mtDNA)具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势，因此作为目标靶基因；

b.本发明的实时荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，2小时即可快速准确的鉴定骆驼源性成分，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高，特异性强，效率高、通量大等有益效果，为食品畜产品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为骆驼目的基因琼脂糖凝胶电泳图；

图2为骆驼目的基因DNA测序比对图；

图3为骆驼探针特异结果图，只有骆驼源性荧光检出，其他物种均未检出，且Ct值＜35即确定含骆驼源性成分；

图4为骆驼源性模板DNA灵敏度检测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。

1.下列实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：骆驼、兔、马、羊、牛、貉子、狗、水貂、猪、鸭、鹅等肉类制品，其中马、牛、羊、兔、猪、鸭和鹅肉样品购自山东济南农贸市场；貉子、水貂和狗样品取自山东养殖场；骆驼样品取自甘肃省天祝县骆驼养殖牧场。

所用试剂：

动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqManMasterMix为DBIBioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。

所用仪器：ABI7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，TakaraPCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品，凝胶成像仪为BIO-RAD公司产品。

实施例1目的基因的获得

采用本发明试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法检测肉品动物源性的方法步骤如下，可以检测出各种待测肉类样品中是否含有骆驼源性成分：

DNA提取：取待测样本50g研磨充分混匀，待测样品可以为动物的皮、毛发、器官组织以及肌肉，取50mg提取DNA，可用动物组织提取试剂盒提取DNA，也可用经典手提法(参照分子克隆手册动物组织DNA提取方法)。Nanodrop核酸检测仪检测DNA样本浓度和纯度，要求在1-20ng/μl，OD值1.7-2.0之间。

骆驼目的基因的获得：以提取的驼源性基因组为模板，用本发明骆驼特异引物进行普通PCR扩增，PCR体系为25μL，Taq酶0.2μL，上下游引物终浓度0.25μM，dNTP0.25mM，1×PCR缓冲液，Mg²⁺浓度为0.2mM，20ng/μL模板为1μL，按照95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min，16℃保存PCR程序进行，跑2％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪中拍照，跑胶图见图1，将目的条带切胶回收，利用ABI公司3730xl测序仪测序，测序图谱见图2，经比对分析为骆驼线粒体Cytb目的基因。

实施例2待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs的反应混合物(2×TaqManMasterMix)、超纯水、高特异性扩增的骆驼引物、TaqMan探针混合物(0.4～1μM)

在PCR反应管中按照表1试剂盒反应体系进行配制，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火35s(在此收集荧光信号)，40个循环。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μL反应体系时，其优选配置见表2。

表2荧光定量PCR反应体系

应用荧光定量PCR仪分析软件，分析扩增结果。

结果判定：为确保检测结果的准确性，在进行实际样品检测时，请务必进行阴性对照实验(模板为非驼源性基因组DNA)和阳性对照(驼源性基因组DNA)实验以及空白对照(模板为水)。

实施例3方法学验证之特异性试验

分别用动物组织提取试剂盒或经典提法提取骆驼、兔、马、羊、牛、貉子、狗、水貂、猪、鸭、鹅等肉类的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。

结果显示，只有骆驼源性DNA检测Ct值<35，而其他样本没有扩增信号。结果见表3及附图说明图3。可见本试剂盒中的引物及探针具有很强的物种特异性。

表3引物和探针特异性实验结果

注：“-”即无扩增。

从以上结果可以看出，骆驼探针仅针对骆驼源性基因组DNA进行扩增，且Ct值<35，而其他样本均没有扩增。由此可见本发明试剂盒中的引物及探针具有很强的物种特异性。

实施例4方法学验证之灵敏度试验

基因组DNA灵敏度试验

按照实施例2所用试剂盒提取目标基因组DNA，用Nanodrop定量到5ng，做10×梯度分别稀释至0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL、，每个梯度均取2μl为模板量，按照上述方法分别对骆驼DNA检测以考察本试剂盒的灵敏度。

结果显示(图4)，当荧光定量模板DNA用量为0.001ng时探针仍有扩增曲线且Ct值<35；但当模板用量为0.0001ng时，Ct值＞35，基本无扩增曲线，所以该试剂盒的检测限为0.001ng。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物，其特征在于，包括以下引物和探针，其核苷酸序列如下：

(1)引物

上游引物序列：5'ACAAAATCCCATTCCACCCCT3'，如SEQIDNO.1所示；

下游引物序列：5'CGGCTTAATGTGTGGTGGTG3'，如SEQIDNO.2所示；

(2)探针：

5'FAM-CGTACTGTTCTCACCAGACTTATTAGGA3'，如SEQIDNO.3所示。

2.一种鉴别骆驼源性成分的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物，以及PCR反应所必需的反应原料和试剂。

3.根据权利要求2鉴别骆驼源性成分的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：PCR缓冲液，MgCL2，dNTPs，Taq酶和超纯水；反应条件为：试剂盒中各组分构成一个20μl的反应体系：2×TaqManMasterMix，pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U，所述引物、探针组合物的终浓度为0.4～1μM。

4.权利要求1所述的快速鉴别骆驼源性成分的荧光定量PCR特异性引物、探针组合物或权利要求2所述的鉴别骆驼源性成分的试剂盒在鉴别骆驼源性成分中的应用。

5.一种鉴别骆驼的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，取骆驼制品样品，提取基因组DNA，使用利用权利要求1所述引物、探针组合物，或权利要求2或3所述的鉴别骆驼源性成分的试剂盒进行PCR扩增，检测荧光信号，判定。

6.一种鉴定肉制品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的基因组DNA，备用；

(2)利用权利要求1所述引物、探针组合物，或权利要求2或3所述的鉴别骆驼源性成分的试剂盒对步骤(1)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，收集荧光信号，进行判断，所述PCR扩增程序为：95℃，10min预变性；95℃10s，63℃35s，在此收集荧光信号，45个循环；

(3)结果判读：收集PCR过程中的荧光信号，通过相应的荧光信号扩增曲线、Ct值鉴别待检样本中是否含有骆驼源性成分。

7.根据权利要求6所述的鉴定肉制品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，还设置有非骆驼源性基因组DNA模板作为阴性对照，和骆驼源性基因组DNA模板作为阳性对照。