CN110305973A - 鲜肉及制品中牛和驴源性同步检测的引物和探针及试剂盒 - Google Patents

鲜肉及制品中牛和驴源性同步检测的引物和探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲜肉及制品中对牛、驴源性进行同步检测的引物和探针，引物和探针序列如下：两源性检测反向引物序列如SEQ ID No.1所示；牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示；驴源性检测正向引物序列如SEQ ID No.3所示；牛探针序列如SEQ ID No.4所示；驴探针序列如SEQ ID No.5所示；质控探针序列如SEQ ID No.6所示。本发明的引物和探针特异性好、灵敏度高，可以实现鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测，并且可以进行牛源性和驴源性的定量检测。

Description

鲜肉及制品中牛和驴源性同步检测的引物和探针及试剂盒
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及鲜肉及制品中动物源性检测领域。
背景技术
随着中国综合国力的提升和国民消费观念的转变，居民对肉类食品的摄入量逐年递增。而牛肉和驴肉由于具有丰富的的蛋白质和氨基酸，受到广大民众的推崇和喜爱。在我国民间驴肉素有“天上龙肉，地下驴肉”、“要长寿吃驴肉，要健康喝驴汤”的赞誉；此外，驴肉中还含有多种常量、微量矿质元素和维生素A、E、B1、B2等，其中维生素A、E含量远高于常见的畜禽肉。中医认为，驴肉性温，具有补气养血，壮阳益精、滋阴补肾的功效，且非常适合高血压、肥胖症、心脑血管疾病、糖尿病、动脉粥样硬化患者以及老年人食用。基于以上等原因，驴肉消费在我国具有广阔的市场前景。据国家统计局2018年公布数据显示，1998-2016年期间，我国驴存栏量由955.8万头迅速减少至259.3万头，巨大的供求错位使得我国驴肉价格由2009年的24元/Kg上涨至2018年的78.6元/Kg。
由于驴肉资源的缺乏和价格的不断攀升，掺假问题随之而来。2014年沃尔玛超市被曝出驴肉中掺有狐狸肉，2018年有媒体曝光河北河间市黑作坊用低价猪肉、马肉、骡子肉炮制假驴肉进行销往中国各地以牟取巨额利益。一系列的驴肉掺假问题引发人们对驴肉食品安全的高度重视。这些造假掺假的欺诈违法行为对人类健康、消费者权益、市场公平交易机制以及民族宗教等各方面都产生了巨大的威胁。因此，对肉类安全的监管非常有必要，寻找一种有效鉴定肉类掺假的技术手段成为当务之急。
我国对于肉制品真伪鉴别技术方面的研究起步晚，这一领域的研究还处于初步阶段。目前，利用实时荧光定量PCR对肉制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，而对于多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。假阴性一直是困扰PCR技术在肉制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控是去除假阴性的有效手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决鲜肉及制品中牛和驴源性成分定性和定量检测问题。
本发明的技术方案为：鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：
两源性检测反向引物：5'ACACACCGCCCGTCACCCT3'(SEQ ID No.1)，
牛源性检测正向引物：5'TTGAATTAGGCCATGAAGC 3'(SEQ ID No.2)，
驴源性检测正向引物：5'TTGAATCAGGCCATGAAGC3'(SEQ ID No.3)，
牛探针：5'CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG3'(SEQ ID No.4)，
驴探针：5'TGG(A/G)TCA(T/C)GGTTTTGTGTAATATTGTGA3'(SEQ ID No.5)，
质控探针：5'ACACACCGCCCGTCACCCT 3'(SEQ ID No.6)。
作为本发明的另一目的，提供了一种肉制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物，
SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物，
SEQ ID No.4所示的牛探针，
SEQ ID No.5所示的驴探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
牛阳性标准品，
驴阳性标准品。
当然，也可以单独检测牛源性，为了节省成本，只需要去除驴源性相关的试剂即可(SEQID No.3所示的驴源性检测正向引物、SEQ ID No.5所示的驴探针和驴阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中牛源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物，
SEQ ID No.4所示的牛探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
牛阳性标准品。
当然，也可以单独检测驴源性，为了节省成本，只需要去除牛源性相关的试剂即可(SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物、SEQ ID No.4所示的牛探针和牛阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中驴源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物，
SEQ ID No.5所示的驴探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
驴阳性标准品。
鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
(1)提取鲜肉及制品的DNA；
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL左右；
(3)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用牛和驴阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取牛、驴和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤40和阳性对照Ct≤40，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤40，结果判定为具有相应两源性；
(5)利用牛和驴阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(6)利用检测鲜肉及肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
进一步地，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，34s，45个循环。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物1μL，浓度为10μM；SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQ ID No.4所示的牛探针0.5μL，浓度为10μM；、SEQ ID No.5所示的驴探针0.5μL，浓度为10μM和SEQ IDNo.6所示的质控探针0.5μL，浓度为10μM；DNA模板2μL，灭菌的去离子水4.5μL，总体积20μL。
本发明通过比对驴、牛、羊、猪、马、山羊、骆驼、牦牛、水牛、狗、兔、鸡及鸭等13种动物的线粒体基因组，选取线粒体基因组序列并通过生物信息软件进行比对，筛选出牛和驴保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
本发明研发了牛、驴及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及PCR反应资源的竞争的问题，达到PCR反应体系可以同时进行多重实时荧光PCR的效果。
驴源性探针在鲜驴肉和驴肉干样品中都可以检测到样品中2.5pg的驴源性DNA，牛源性探针可以在鲜牛肉及牛肉肠中检测样品中到1pg的牛源性DNA，在牛肉肠样品中可以检测到2.5pg牛源性DNA。本发明的驴和牛引物和探针的检测限度达到pg水平，检测的灵敏度较高。
在驴和牛混合肉样中进行三通道检测，结果显示驴和牛探针都可以检测到10％水平混合样品，说明混合探针(驴、牛以及质控对照)具有驴源性、牛源性以及质控对照同管检测能力。
在驴和鸡、牛和鸡混合肉样中进行三通道检测，结果显示驴和牛探针都可以检测到0.1％水平混合样品，说明牛和驴探针都具有千分之一掺假的检测能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，能够实现对鲜肉及加工制品中牛和驴源性的定性和定量检测，并且可以进行牛、驴和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。
附图说明
图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性、HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对鲜牛肉(A)、鲜驴肉(B)、牛肉干(C)、驴肉干(D)、牛肉肠(E)、奶豆腐(F)和奶粉(G)进行的实时荧光定量PCR关于引物和探针特异性的检测。
图2利用HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性对鲜驴肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，驴源性探针可以检测到2.5pg的驴源性DNA(A)；利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性对鲜牛肉DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，牛源性探针可以检测到1pg牛源性DNA(B)；利用HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性对驴肉干DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，驴源性探针可以检测到2.5pg的驴源性DNA(C)；利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性对牛肉干DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，牛源性探针可以检测到1pg牛源性DNA(D)；利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性对牛肉肠DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，牛源性探针可以检测到2.5pg牛源性DNA(E)；。
图3应用于鲜肉中驴源性定量检测的标准曲线(A)；应用于鲜牛肉牛源性定量检测的标准曲线(B)；应用于驴肉干中驴源性定量检测的标准曲线(C)；应用于牛肉干中牛源性定量检测的标准曲线(D)；应用于牛肉肠中牛源性定量检测标准曲线(E)。
具体实施方式
1、检测方法：
(1)提取鲜肉和加工制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL左右。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用牛和驴阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。
表1 Real-time PCR反应体系(牛、驴和质控的同时检测)
成分 体积(微升)
Probe qPCR预混液 10
两源性检测反向引物 1
牛源性检测正向引物 0.5
驴源性检测正向引物 0.5
牛探针 0.5
驴探针 0.5
质控探针 0.5
DNA 2
灭菌的去离子水 4.5
总体积 20
表2 Real-time PCR反应体系(牛源性以及质控同时检测)
成分 体积(微升)
Probe qPCR预混液 10
两源性检测反向引物 1
牛源性检测正向引物 1
牛探针 0.5
质控探针 0.5
DNA 2
灭菌的去离子水 5
总体积 20
表3 Real-time PCR反应体系(驴源性以及质控同时检测)
成分 体积(微升)
Probe qPCR预混液 10
两源性检测反向引物 1
驴源性检测正向引物 1
驴探针 0.5
质控探针 0.5
DNA 2
灭菌的去离子水 5
总体积 20
表4 Real-time PCR扩增参数
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取牛、驴和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤40和阳性对照Ct≤40，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤40，结果判定为具有相应两源性。
(5)利用牛和驴阳性标准品(样品DNA原液稀释101至107倍)做DNA定量的标准曲线。
(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在肉制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计牛、驴和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
两源性检测反向引物：5'ACACACCGCCCGTCACCCT3'(SEQ ID No.1)，
牛源性检测正向引物：5'TTGAATTAGGCCATGAAGC 3'(SEQ ID No.2)，
驴源性检测正向引物：5'TTGAATCAGGCCATGAAGC3'(SEQ ID No.3)，
牛探针：5'CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG3'(SEQ ID No.4)，
驴探针：5'TGG(A/G)TCA(T/C)GGTTTTGTGTAATATTGTGA3'(SEQ ID No.5)，
质控探针：5'ACACACCGCCCGTCACCCT 3'(SEQ ID No.6)；
牛、驴和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX和ROX，所述淬灭基团为TAMRA、TAMRA或BHQ2。
3、引物和探针的特异性检测
单源性检测的Real-time PCR反应体系如下表所示
成分 体积(微升)
Probe qPCR预混液 10
两源性检测反向引物 1
牛或驴源性检测正向引物 1
相应源性探针 0.5
质控探针 0.5
DNA 2
灭菌的去离子水 5
利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性、HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对驴、牛、羊、猪、马、山羊、骆驼、牦牛、水牛、狗、兔、鸡、鸭、驴肉干、牛肉干、牛肉肠、羊肉干、猪肉肠、马肉干、奶豆腐、山羊奶酪、牛奶粉等进行qPCR的检测。
检测结果如下：
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；
结果说明：Ct小于40(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。在驴肉和驴肉干中检测出驴源性，在牛肉、牛肉干、牛肉肠、奶豆腐以及奶粉1和奶粉2中检测出牛源性，而在其他肉及制品中没有检测到驴和牛源性。
4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验
将驴和牛的基因组DNA分别进行10倍稀释和2倍稀释，浓度如下：100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.0025、0.001、0.0001、0.00001，进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，驴源性探针在鲜驴肉和驴肉干样品中都可以检测到样品中2.5pg的驴源性DNA，牛源性探针可以在鲜牛肉及牛肉肠中检测样品中到1pg的牛源性DNA，在牛肉肠样品中可以检测到2.5pg牛源性DNA。以上结果说明自主研发的驴和牛引物和探针的检测限度达到pg水平，检测的灵敏度较高。
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
5、利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性、HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对牛和驴梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行牛、驴和质控的同时检测。
Ct值：平均值(三组数据)±标准差
结果说明：Ct小于40(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示驴和牛探针都可以检测到10％水平混合样品，以上结果说明混合探针(驴、牛以及质控对照)具有驴源性、牛源性以及质控对照同管检测能力。
6、利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性、HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对牛和鸡梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行牛源性的分别检测。利用FAM和TAMRA修饰探针标记牛源性、HEX和TAMRA修饰探针标记驴源性和ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对驴和鸡梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、70％、90％、99％和99.9％)进行驴源性的分别检测。
(1)牛源性探针、驴源性探针及质控探针对鸡和牛混肉样进行牛源性检测
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
(2)牛源性探针、驴源性探针及质控探针对驴和鸡混肉样品进行驴源性检测
Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测
结果说明：Ct值小于40(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示驴和牛探针都可以检测到0.1％水平混合样品，以上结果说明牛和驴探针都具有千分之一掺假的检测能力。
7、试剂盒制作
(1)牛源性、驴源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：
试剂 说明
Probe qPCR预混液 反应体系(酶、dNTP、Mg<sup>2+</sup>)
两源性检测反向引物 浓度为10μmol/L
牛源性检测正向引物 浓度为10μmol/L
驴源性检测正向引物 浓度为10μmol/L
牛探针 浓度为10μmol/L
驴探针 浓度为10μmol/L
质控探针 浓度为10μmol/L
牛阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于牛阳性对照及标准曲线
驴阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于驴阳性对照及标准曲线
灭菌的去离子水 补充反应体系
(2)牛源性检测试剂盒试剂如下表所示：
(3)驴源性检测试剂盒试剂如下表所示：
试剂 说明
Probe qPCR预混液 反应体系(酶、dNTP、Mg<sup>2+</sup>)
两源性检测反向引物 浓度为10μmol/L
驴源性检测正向引物 浓度为10μmol/L
驴探针 浓度为10μmol/L
质控探针 浓度为10μmol/L
驴阳性标准品 浓度为100ng/μL，用于驴阳性对照及标准曲线
灭菌的去离子水 补充反应体系
。

Claims (8)

1.鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：
两源性检测反向引物序列如SEQ ID No.1所示，
牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示，
驴源性检测正向引物序列如SEQ ID No.3所示，
牛探针序列如SEQ ID No.4所示，
驴探针序列如SEQ ID No.5所示，
质控探针序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，牛探针、驴探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团分别为FAM、HEX和ROX，淬灭基团为TAMRA、TAMRA和BHQ2。
3.鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取鲜肉及加工制品的DNA；
(2)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针对DNA进行多重荧光定量PCR扩增，以牛和驴阳性标准品做阳性对照，以灭菌的去离子水做阴性对照，以DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取牛、驴和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤40和阳性对照Ct≤40，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤40，结果判定为具有相应两源性；
(4)利用牛和驴阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
(5)利用检测鲜肉及制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到相应源性的定量检测结果。
4.根据权利要求3所述的鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，34s，45个循环。
5.根据权利要求3所述的鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物1μL，浓度为10μM；SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μM；SEQ ID No.4所示的牛探针0.5μL，浓度为10μM；、SEQ ID No.5所示的驴探针0.5μL，浓度为10μM和SEQ ID No.6所示的质控探针0.5μL，浓度为10μM；DNA模板2μL，灭菌的去离子水4.5μL，总体积20μL。
6.鲜肉及制品中牛源性、驴源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物，
SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物，
SEQ ID No.4所示的牛探针，
SEQ ID No.5所示的驴探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
牛阳性标准品，
驴阳性标准品。
7.鲜肉及制品中牛源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.2所示的牛源性检测正向引物，
SEQ ID No.4所示的牛探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
牛阳性标准品。
8.鲜肉及制品中驴源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的两源性检测反向引物，
SEQ ID No.3所示的驴源性检测正向引物，
SEQ ID No.5所示的驴探针，
SEQ ID No.6所示的质控探针，
Probe qPCR预混液，
驴阳性标准品。
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