CN110004233A

CN110004233A - 一种特种乳中掺伪牛乳的双重pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110004233A
Application number: CN201910222792.XA
Authority: CN
Inventors: 杨洁; 邓露; 李爱丽; 岳海涛; 申彤; 陈红征
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN110004233B

Abstract

本发明旨在提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，利用山羊乳、马乳、驴乳、骆驼乳样本作为测试材料，利用本发明检测试剂盒通过检测骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳和牛乳线粒体基因差异序列为靶基因，用于分别检测骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳中牛乳的掺伪，该方法灵敏度较高，特种乳中牛乳掺伪的检出限在0.1～2%之间。本发明应用双重PCR技术，根据线粒体基因设计骆驼、驴、马、山羊和牛源性特异引物，能够在一个PCR体系中同时鉴别牛源以及其他物种源性，具有灵敏度高、特异性好、快速鉴别的特点。

Description

一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

发明涉及乳制品检测的技术领域，具体的，本发明涉及一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的技术领域。

背景技术

特种乳是指牛乳以外的其它家畜乳，如骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳等。据联合国粮食及农业组织(FAO)统计，自2012年来，我国特种乳总产量基本呈现逐年上涨的趋势。目前，随着人们消费水平的不断提高，居民保健意识增强，对特种乳健康属性的认可度提高。特种乳产业已受到广泛关注，特种乳不仅营养价值高，而且其特殊的营养成分在治疗各种疾病方面发挥着独特的功效。

特种乳营养成分丰富，组成比例合适，不饱和脂肪酸含量高，易于消化吸收，奶质优良，是良好的母乳替代品。骆驼乳富含不饱和脂肪酸、铁、维生素B和维生素C等营养元素，含有高浓度的各种保护性蛋白。驴乳、马乳水分含量较高、全乳固体含量较低，脂肪含量低，胆固醇的含量低，亚油酸和维生素的含量远高于牛乳，其中维生素C的含量是牛乳的4～8倍。山羊乳富含矿物元素以及维生素A和B族维生素、超氧化物歧化酶、表皮生长因子等。

与牛乳相比，特种乳具有营养价值丰富、功效特殊、乳源有限等特点，且市场售价远高于牛乳。特种乳产业目前尚在起步阶段，原料乳多来自小规模饲养的牧民，可能会出现养殖户为谋取利益将牛乳掺到高价特种乳中的现象。

向特种乳中掺入牛乳不仅导致牛乳过敏人群产生过敏反应，而且影响特种乳产业的健康发展。针对这种掺伪现象现有检测蛋白质组成的色谱、质谱技术等，但由于特种乳营养特殊，为避免微生物污染，市售乳制品多是经过热处理如巴氏消毒、高温灭菌等过程来保证乳品的食品安全，而热处理会造成蛋白质部分变性，造成检测结果假阴性。由于DNA相对蛋白质更稳定、灵敏度极高和可重复性好，因此检测DNA的PCR技术备受市场检测需求的青睐和应用。

相对于检测蛋白组成的技术，PCR检测方法的优势在于DNA耐高温，仅需要少量样品就可以获得足够用于分析的DNA。其机理是哺乳动物在泌乳时，会脱落部分体细胞进入乳汁中，而不同物种体细胞中包含的基因组DNA信息间的差异，能够通过PCR技术扩大并检测出来。PCR技术中的双重PCR因其能够在一个PCR体系中同时检测两个物种源性，相较于普通PCR效率更高，更为简便快速，更适合应用于特种乳中掺伪牛乳的检测。

因此，建立一种快速、准确检测特种乳中掺伪牛乳的检测方法，使之既满足于原料乳检测，又可用于加工产品的分析是十分重要的，对于乳制品产业健康可持续发展，维护消费者权益具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中未见报道专门针对特种乳中掺伪牛乳的检测方法的技术现状，本发明旨在提供了一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，利用骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳、牛乳样本作为测试材料，利用本发明检测试剂盒通过检测骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳和牛乳线粒体基因差异序列为靶基因，用于对特种乳中牛乳的掺伪进行鉴别。

本发明通过以下技术方案实现的：

发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，包括PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、空白对照、PCR反应试剂。

本发明中，所述空白对照为双蒸水。

本发明中，所述阳性对照为牛DNA。

本发明中，所述阴性对照为骆驼DNA、驴DNA、马DNA、山羊DNA。

本发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：根据骆驼、驴、马、山羊、牛线粒体基因序列，自行人工设计特异性引物。

(2)PCR反应试剂：PCR mix、上下游引物、DNA模板和双蒸水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物：

双峰驼16S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'-ACCACATTTCAACTATTTCAAAACCG-3'

反向引物：5'-ATCGGTGGGTTAAGTTTATTAAGTGT-3'

驴12S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'-GCCCTAAACCAAAATAGCTCACCATA-3'

反向引物：5'-CATATGTTTGGATCATGGTTTTGTG-3'

马D-LOOP基因特异性引物：

正向引物：5'-CATACCCACCTGACATGCAATATCT-3'

反向引物：5'-ACACGTAGTTGGGAGGGTTGCTGAT-3'

山羊D-LOOP基因特异性引物：

正向引物：5'-ACTCCACAAGCTTACAGACATGCCA-3'

反向引物：5'-GAAGGCTGTATGTCCGCGTTATATG-3'

牛16S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'ACCCTCTCGACTAAACAACCAAGATAG-3'

反向引物：5'-TGGGGCTAGGAGTTAATCATTTGTTG-3'

进一步，本发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)乳样品中DNA的提取：

取乳样品，1500r/min离心10min，弃脂肪及悬浮液；向沉淀中加入200μLTE，300μL0.5mol/L EDTA重悬沉淀物，摇床振摇40～60min；将管中液体3000～5000r/min离心5～15min，沉淀内加入200μLPBS；1mL SLB及50μL蛋白酶K，70℃15～20min消化；

1mL酚-氯仿抽提消化液，5000～10000r/min离心5～10min；取上清加2.5mL无水乙醇和0.1mL 3mol/L乙酸钠；-20℃冷冻3h；8000～12000r/min离心20～30min，弃上清；加0.5mL 70％乙醇清洗沉淀，5000r/min离心5～10min；晾干，加TE悬浮，-80℃保存待用。

(2)PCR扩增：

在PCR检测管中加入预处理的DNA样本及PCR mix，同时设置阳性对照、阴性对照；根据设计的特异性引物，利用以上所述试剂盒特异性扩增骆驼16S-rRNA基因片段、驴12S-rRNA基因片段、马D-LOOP基因片段、山羊D-LOOP基因片段、牛16S-rRNA基因片段；PCR扩增总体积为20μL，体系如下：PCR mix 10μL，1μL模板，上下游引物各1μL(10～100μmol/L)，补双蒸水至20μL；反应条件为反应条件为，94.0℃预变性5min，94℃变性30s，骆驼、马、山羊与牛引物62.6℃退火45s、驴与牛引物55.7℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次，4℃保存。结束反应，PCR产物置于4℃冰箱。

(3)PCR扩增产物分析：

将步骤(2)制备的PCR扩增产物进行凝胶电泳，与阳性对照、阴性对照以及DNAMarker比较，检验乳样本所出现的电泳条带，通过牛乳特异性条带的出现情况判断待检乳样品是否为掺伪牛乳。

本发明中，骆驼16S-rRNA基因、驴12S-rRNA基因、马D-LOOP基因、山羊D-LOOP基因、牛16S-rRNA基因的特异性引物设计，从GenBank数据库中下载骆驼、驴、马、山羊、牛线粒体基因序列，用DNAMan软件对5个目的基因进行碱基序列比对，选取其中的差异较大区段,借助公知软件Primer 5.0，自行人工设计特异性引物。

本发明中，所述0.5mol/L EDTA的pH为8.0。

本发明中，所述蛋白酶K浓度为20mg/ml。

本发明中，所述酚-氯仿，按体积比计，酚:氯仿＝1:1。

本发明中，所述3mol/L乙酸钠的pH为5.2。

通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：

(1)本发明通过提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，利用骆驼乳、驴乳、马乳、山羊乳、牛乳样本作为测试材料，利用本发明检测试剂盒通过检测骆驼乳驴乳、马乳、山羊乳、和牛乳线粒体基因差异序列为靶基因，用于对特种乳中牛乳的掺伪进行鉴别，可作为牛乳掺假的定性判断依据。

(2)本发明通过提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用，灵敏度较高，特种乳中牛乳掺伪的检出限在0.1～2％之间，一般小于2％的掺伪，极可能是意外污染，已达到实际应用中的掺伪底线。

(3)本发明中，设计的5对特异性引物与其他相关的反刍动物物种均不产生扩增，各特异性引物扩增目的条带的相对灰度与混合乳样品的浓度呈现依赖性。由于不同物种扩增产物存在长度差异，特异性强，且退火温度相近，能够有效应用于掺伪检测。

附图说明

图1显示为特种乳掺伪乳样DNA电泳结果图，图中，A为鲜乳样品；B为巴氏杀菌乳样品；C为高温灭菌乳样品；D为冷冻干燥乳样品；M为DL15000DNAMarker；1-11为特种乳掺伪牛乳乳样DNA，将牛乳按体积比掺入特种乳样品中，掺入牛乳的比例分别为0％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、50％。

图2显示为山羊、马、驴、牛与骆驼乳目的基因PCR扩增电泳结果图，图中，M为DL2000DNAMarker；CN为空白对照；1-5分别为山羊、马、驴、牛、骆驼DNA。

图3显示为引物特异性、灵敏度检测结果图，图中1*图为引物特异性检验结果，A为山羊特异性引物，B为马特异性引物，C为驴特异性引物，D为牛特异性引物，E为骆驼特异性引物，M为DL2000DNAMarker，Y为羊DNA，N为牛DNA，L为驴DNA，M₁为马DNA；T为骆驼，CN为空白对照；2*图为灵敏度检测结果，A为山羊特异性引物扩增山羊DNA，B为马特异性引物扩增马DNA，C为驴特异性引物扩增驴DNA，D为牛特异性引物扩增牛DNA，E为驼特异性引物扩增骆驼DNA，1-6为100ng/μL的不同物种DNA模板分别按照10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍稀释的样品。

图4显示为双重PCR扩增牛乳掺伪的特种乳电泳结果图，图中，A、B、C、D分别为新鲜、巴氏杀菌、高温灭菌、冷冻干燥乳；M为DL2000DNAMarker；CN为空白对照；1-12为特种乳掺伪牛乳乳样，分别将牛乳按体积比掺入特种乳样品中，掺入牛乳的比例分别为0％、100％、50％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

实验原料：牛乳、马乳：购于乌鲁木齐市水西沟；驼乳：家养双峰驼，购于乌鲁木齐市鸿雁池；驴乳：购于乌鲁木齐种牛场；山羊乳：购于乌鲁木齐市乌拉泊，样品于牧民养殖户居住地现场采集的生鲜乳，混匀后用4℃车载冰箱带回实验室，备用。

采用的主要试剂：蛋白酶K、琼脂糖均为分析纯；PCRMix购自康为世纪生物技术有限公司；DNAMarker购自Takara公司；核酸染料购自北京BioMed生物公司。

采用的主要的仪器设备：DYCP-31DN核酸电泳仪，Gradient SL 96 PCR仪，HeraeusMultifuge 1R台式高速冷冻离心机，BIO-RAD凝胶成像系统，Nano Drop 1000核酸测定仪，ALPHA 1-2LD plus冷冻干燥机，JINGHONG恒温锅。

本发明采用的试剂和设备均可通过公共渠道购买或定制。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒

发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其中设置有以下成分：PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、空白对照、PCR反应试剂。

本发明中，所述空白对照为无模板空白对照，用双蒸水代替模板。

本发明中，所述阳性对照为牛DNA。

本发明中，所述阴性对照为骆驼DNA、驴DNA、马DNA、山羊DNA。

实施例二：一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒

本发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(2)PCR反应试剂：PCR mix、上下游引物、DNA模板和双蒸水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如表1所示：

表1：特异性引物序列

实施例三：一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用

本发明提供一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)乳样品中DNA的提取

取乳样品，1500r/min离心10min，弃脂肪及悬浮液；向沉淀中加入200μL TE，300μL0.5mol/L EDTA(pH8)重悬沉淀物，摇床振摇40～60min；将管中液体3000～5000r/min离心5～15min，沉淀内加入200μLPBS；1mLSLB及50μL蛋白酶K(20mg/ml)，70℃15～20min消化；1mL酚-氯仿(1:1)抽提消化液，5000～10000r/min离心5～10min；取上清加2.5mL无水乙醇和0.1mL 3mol/L乙酸钠(pH5.2)；-20℃冷冻3h；8000～12000r/min离心20～30min，弃上清；加0.5mL 70％乙醇清洗沉淀，5000r/min离心5～10min；晾干，加TE悬浮，-80℃保存待用。该方法利用同一种方法提取不同乳中DNA具有可行性，一定程度上减小了这种模板质量的差异。

(2)PCR扩增

在PCR检测管中加入预处理的DNA样本及PCR mix，同时设置空白对照；根据设计的特异性引物，利用以上所述试剂盒特异性同时扩增牛16S-rRNA基因片段与骆驼16S-rRNA基因片段或驴12S-rRNA基因片段或马D-LOOP基因片段或山羊D-LOOP基因片段；PCR扩增总体积为20μL，体系如下：PCR mix 10μL，1μL模板，上下游引物各1μL(10～100μmol/L)，补双蒸水至20μL；反应条件为如表2所示，结束反应，PCR产物置于4℃冰箱。

表2：PCR反应条件

(3)PCR扩增产物分析：

将步骤(2)制备的PCR扩增产物进行凝胶电泳，与阳性对照和阴性对照比较，检验乳样本所出现的电泳条带，以判断待检乳样品是否为掺伪牛乳。

实施例四：乳样品中DNA的提取

1、样品的制备及处理

将鲜牛乳按体积比掺入鲜骆驼、驴、马、山羊乳样品中，掺入牛乳的比例分别为100％、50％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％和0％，乳样总体积50mL。分别进行四组处理：(1)鲜乳：不处理；(2)巴氏杀菌液态乳：乳样品62～65℃，保持30min，冷却备用；(3)高温杀菌液态乳：乳样品100℃水浴，到达温度后维持2min，冷却备用；(4)冷冻干燥乳：乳样品-20℃至-80℃预冻24h，进行冷冻干燥备用。样品进行立即提DNA处理或放-80℃直至使用。

2、乳样品中DNA的提取

乳汁1500r/min离心10min，弃脂肪及悬浮液；向沉淀中加入200μLTE，300μL0.5mol/L EDTA(pH8)重悬沉淀物，摇床振摇40～60min；将管中液体3000～5000r/min离心5～15min，沉淀内加入200μLPBS；1mLSLB及50μL蛋白酶K(20mg/ml)，70℃15～20min消化；

1mL酚-氯仿(1:1)抽提消化液，5000～10000r/min离心5～10min；取上清加2.5mL无水乙醇和0.1mL 3mol/L乙酸钠(pH5.2)；-20℃冷冻3h；8000～12000r/min离心20～30min，弃上清；加0.5mL 70％乙醇清洗沉淀，5000r/min离心5～10min；晾干，加TE悬浮(-80℃保存)，用Nano Drop 1000核酸测定仪对DNA浓度及纯度进行测定，其中OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.0间，纯度较高。1～2％琼脂糖凝胶电泳检验提取的DNA质量，观察和拍照，通过电泳检验DNA提取质量参见附图1所示。可以看出，不同的加工处理会使DNA发生部分降解，但1-11号均有条带，虽然亮度较低，但纯度较高，可以满足后续PCR扩增实验的要求。

实施例五：双重PCR体系的建立

1、特异性引物

引物序列及所在位置和预期扩增产物大小见表3。

表3：引物序列及其产物大小

2、PCR扩增体系的建立

PCR扩增总体积为20μL，体系如下：PCR mix 10μL，上下游引物各1μL(10～100μmol/L)，1μL模板，补双蒸水至20μL；PCR反应程序如表4所示，稍加离心上述混合液，调整好反应程序，立即置PCR仪中执行扩增；结束反应，PCR产物置于4℃冰箱，经1～2％琼脂糖凝胶电泳后，拍照观察结果。

表4：PCR程序的设定

利用单重PCR反应体系分别对山羊、马、驴、牛与驼的DNA进行扩增，结果参见附图2所示。在表4的条件下，均扩增得到1个与目标大小相符的特异性条带：184、241、470、584和711bp处均有条带，且条带清晰、亮度适中，同时存在引物二聚体，但并不影响鉴定结果，说明各引物均具有高度特异性，PCR扩增成功，产物测序，测序结果与GenBank上的已知序列进行比对，序列相似性达98％。

实施例六：特异性验证和灵敏度检测

在上述实施例五提供的实验基础上，本发明进一步验证上述实施例提供的特种乳中掺伪牛乳的检测试剂盒特异性验证和灵敏度实验。

利用实施例五提供的5对引物分别对骆驼、驴、马、山羊、牛的基因组DNA在最优条件下进行扩增反应，根据对DNA有无扩增判断其特异性，同时设置空白对照。

将骆驼、驴、马、山羊、牛纯DNA模板浓度均一定量为100ng/μL，进行10倍梯度稀释，通过添加不同浓度的DNA模板进行PCR扩增，电泳检测PCR产物，根据目的条带的有无，判定其最低检测模板量，作为方法的灵敏度，并设置空白对照。

结果参见附图3所示，5对引物均具有物种特异性，其中骆驼、山羊和马DNA引物灵敏度较高，牛和驴DNA模板引物灵敏度较低。泳道3为阳性对照，均扩增出一条特异性的目的条带，没有出现非特异性条带，且与其他同源性较高乳种间的扩增均没有条带出现，泳道4～7为非目标扩增结果，与阴性对照组一致无条带扩增，表明引物特异性较好。

实施例七：特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用

1、样品的制备及处理：将鲜牛乳按体积比掺入鲜驼、马、驴、山羊乳样品中，掺入牛乳的比例分别为100％、50％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％和0％，乳样总体积50mL。分别进行四组处理：(1)鲜乳：不处理；(2)巴氏杀菌液态乳：乳样品62～65℃，保持30min，冷却备用；(3)高温杀菌液态乳：乳样品100℃水浴，到达温度后维持2min，冷却备用；(4)冷冻干燥乳：乳样品–80℃预冻24h，进行冷冻干燥备用。样品进行立即提DNA处理或放-80℃直至使用。

2、按照实施例三中的方法进行操作，将提供的试剂盒应用于掺入一定比例牛乳的新鲜、巴氏杀菌、高温灭菌和冷冻干燥骆驼乳、驴乳、马乳和山羊乳中。检测结果参见附图4所示，可以看出随着牛乳掺伪比例的降低，牛特异性条带逐渐消失，仅有特种乳特异性条带。新鲜和不同加工处理新疆特种乳乳样掺伪牛乳的检出情如表5。

表5：新疆特种乳中牛乳掺伪检出限

本试验中牛乳掺伪的检出限在不同加工方式处理的骆驼，马，山羊奶中基本一致，可达到0.1～1％之间，在驴乳中偏高，在0.5～2％之间。结果表明不同加工方式会对DNA产生一定的降解，但程度不同。

本申请提供的一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，通过应用其方法灵敏度较高，新疆特种乳中牛乳掺伪的检出限在0.1～2％之间，一般小于2％的掺伪，极可能是意外污染，已达到实际应用中的掺伪底线。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆大学

<120> 一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Camelus ferus)

<400> 1

accacatttc aactatttca aaaccg 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Camelus ferus)

<400> 2

atcggtgggt taagtttatt aagtgt 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物(Equus asinus)

<400> 3

gccctaaacc aaaatagctc accata 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Equus asinus)

<400> 4

catatgtttg gatcatggtt ttgtg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Equus caballus)

<400> 5

catacccacc tgacatgcaa tatct 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Equus caballus)

<400> 6

acacgtagtt gggagggttg ctgat 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Caprinae)

<400> 7

actccacaag cttacagaca tgcca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Caprinae)

<400> 8

gaaggctgta tgtccgcgtt atatg 25

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工引物(Bovine)

<400> 9

accctctcga ctaaacaacc aagatag 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物(Bovine)

<400> 11

tggggctagg agttaatcat ttgttg 26

Claims

1.一种特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，包括PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、空白对照、PCR反应试剂，其特征在于，所述试剂盒通过以下共建体系建成获得：

（1）引物设计及合成：根据骆驼、驴、马、山羊、牛线粒体基因序列，自行人工设计特异性引物；

（2）PCR反应试剂：PCR mix、上下游引物、DNA模板和双蒸水。

2.如权利要求1所述的特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述空白对照为双蒸水。

3.如权利要求1所述的特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为牛DNA。

4.如权利要求1所述的特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为骆驼DNA、驴DNA、马DNA、山羊 DNA。

5.如权利要求1所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的共建体系中，双峰驼16S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'-ACCACATTTCAACTATTTCAAAACCG-3'

反向引物：5'-ATCGGTGGGTTAAGTTTATTAAGTGT-3'。

6.如权利要求1所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的共建体系中，驴12S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'-GCCCTAAACCAAAATAGCTCACCATA-3'

反向引物：5'-CATATGTTTGGATCATGGTTTTGTG-3'。

7.如权利要求1所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的共建体系中，马D-LOOP基因特异性引物：

正向引物：5'-CATACCCACCTGACATGCAATATCT-3'

反向引物：5'-ACACGTAGTTGGGAGGGTTGCTGAT-3'。

8.如权利要求1所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的共建体系中，山羊D-LOOP基因特异性引物：

正向引物：5'-ACTCCACAAGCTTACAGACATGCCA-3'

反向引物：5'-GAAGGCTGTATGTCCGCGTTATATG-3'。

9.如权利要求1所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的共建体系中，牛16S-rRNA基因特异性引物：

正向引物：5'ACCCTCTCGACTAAACAACCAAGATAG-3'

反向引物：5'-TGGGGCTAGGAGTTAATCATTTGTTG-3'。

10.如权利要求1至9任意一项所述特种乳中掺伪牛乳的双重PCR检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，具体包括如下步骤：

（1）乳样品中DNA的提取：

取乳样品，1500r/min离心10min，弃脂肪及悬浮液；向沉淀中加入200μL TE，300μL0.5mol/L EDTA重悬沉淀物，摇床振摇40~60min；将管中液体3000~5000r/min离心5~15min，沉淀内加入200μL PBS；1mL SLB及50μL蛋白酶K，70℃ 15~20min消化；1mL酚-氯仿抽提消化液，5000~10000r/min离心5~10min；取上清加2.5mL无水乙醇和0.1mL 3mol/L乙酸钠；-20℃冷冻3h；8000~12000r/min离心20~30min，弃上清；加0.5mL 70%乙醇清洗沉淀，5000r/min离心5~10min；晾干，加TE悬浮，-80℃保存待用；

（2）PCR扩增：

在PCR检测管中加入预处理的DNA样本，同时设置阳性对照、阴性对照；根据设计的特异性引物，利用以上所述试剂盒特异性扩增骆驼16S-rRNA基因片段、驴12S-rRNA基因片段、马D-LOOP基因片段、山羊D-LOOP基因片段、牛16S-rRNA基因片段；PCR扩增总体积为20μL，体系为PCR mix10μL，1μL模板，上下游引物各1μL（10~100μmol/L），补双蒸水至20μL；反应条件为反应条件为，94.0℃预变性5min，94℃变性30s，骆驼、马、山羊与牛引物62.6℃退火45s、驴与牛引物55.7℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次，4℃保存；

（3）PCR扩增产物分析：

将步骤（2）制备的PCR扩增产物进行凝胶电泳，与阳性对照、阴性对照以及DNA Marker比较，检验乳样本所出现的电泳条带，通过牛乳特异性条带的出现情况判断待检乳样品是否为掺伪牛乳，并验证待检样品的物种源性。