CN109112219A - 快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，包括样品处理体系、LAMP扩增反应体系、核酸免疫胶体金试纸条、阳性标准品、阴性标准品；检测步骤主要包括提取待测样品DNA、配制LAMP反应体系、LAMP扩增反应、核酸免疫胶体金试纸条检测；操作简便、快速、精确、低价，不仅能够检测牛源性成分还能检测羊源性成分，同时又能有效区分其他反刍类的动物源，如马、驴、鹿等等，对化妆品中动物源性检测的特异性高，极大的避免假阳性，避免在口岸检测一线的检察人员与旅客产生纠纷，核酸扩增保证检测的特异性和敏感性，又通过固相化的胶体金检测，实现直观性和简便性，非常适合用于出入境的口岸检验检疫人员进行现场检测。

Description

快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种出入境关卡检测旅客携带违禁成分的新手段，特别是涉及一种快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒。
背景技术
可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies，TSE)是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病，潜伏期长，100％致死率，并可在同种动物间传播。自1730年首次报道羊搔痒病以来，目前已经在人类以及20余种动物中发现有自然发生或感染的TSE，其中包括人类的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease，CJD)以及动物的羊瘙痒病、疯牛病等。
具有美白、祛斑、抗皱、抗衰老作用的化妆品中大多含有从牛、羊的脑及神经组织、内脏、胎盘和血液中提取的成分，如果制成这些成分的原料来自于感染疯牛病的临床前期的牛，或是组织在取材时遭到了污染，或是加工过程中不能够很好地灭活感染因子，那么这些污染了疯牛病感染因子的化妆品在长期的使用中仍具有危险性。
由于疯牛病无任何有效预防和有效医治的手段，因此为了保卫我国国家安全和人民健康，从2002年开始我国颁布了一系列法律条文禁止进口和销售含有发生“疯牛病”国家或地区牛、羊的脑及神经组织、内脏、胎盘和血液(含提取物)等动物源性原料成份(简称“牛羊动物源性原料成份”)的化妆品，或者对来自疯牛病疫区国家的化妆品等一律要求提供对方国家相关机构出具的不含牛羊动物源性原料的证明，凡是不能提供的均需要卫生处理或退回处理。但是随着人民的生活水平的不断提高，人民对化妆品、日用品等的质量和功效要求越来越高，越来越多的人在国外购买日用品、化妆品等携带入境。很多入境人员没有意识到违禁物品不能带入国内的重要性，常常更换购买物品的包装或撕去配方表，导致检查人员无法有效快速检测其成分。
目前对旅客携带化妆品中怀疑有违禁成分时，一般需要进行测序方法或PCR方法。PCR虽然特异性和敏感性高，但样品前处理繁琐费时，实验周期长；需要特殊的仪器（实时定量PCR仪或普通PCR仪和凝胶电泳仪等），检测成本高；在一个反应体系中若对多种动物源进行鉴定，极易出现假阳性和假阴性，且需要专门的分析技术人员，检测场所也局限于有条件的实验室中，不能满足现场快速检测的需要。因此建立快速、灵敏、操作简便、无需仪器的检测方法对于口岸检验检疫人员现场检疫工作具有高度的意义。
环介导等温扩增技术，英文名称为loop-mediated isothermal amplification，缩写为LAMP。环介导等温扩增技术能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。该技术即可以通过核酸扩增保证检测的特异性和敏感性，又通过固相化的胶体金检测，实现直观性和简便性，非常适合用于基层和现场检测目的。目前该技术在检测化妆品中是否含有牛源和羊源性物质的应用还处于空白，有很大的应用前景。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，主要基于包括LAMP的扩增反应体系和胶体金试纸条两大技术，所述试剂盒用于解决现有技术中检查速度慢、检查手段复杂、结果不够准确的问题。
优选的，所述一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒包括样品处理体系、LAMP扩增反应体系、核酸免疫胶体金试纸条、阳性标准品、阴性标准品；所述样品处理体系包括核酸裂解液、Glass Milk、gDNA Binding Buffer、70%乙醇、无水乙醇；所述LAMP扩增反应体系包括待测样本DNA，牛、羊特异性的LAMP引物组，LAMP等温反应缓冲液，1μL Bst DNA聚合酶；所述LAMP引物组包括：F3、B3组成的外引物对，FIP、BIP组成的内引物对，LF、LB组成的环引物对；所述LAMP引物组中的F3、B3组成的外引物对分别标记生物素和地高辛；
优选地，所述阳性标准品为含有阳性DNA模板，所述阳性DNA模板包括山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛的基因组DNA；所述阳性标准品制备方法如下：采集山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛这几种易被感染疯牛病且可作为化妆品原料动物的组织，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作提取基因组DNA，或者按照分子克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中保存备用。
优选地，所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水。
优选地，所述核酸裂解液包括5%的Chelex-100，20g/L的蛋白酶K，二者以14：1的比例配制，现配现用。
优选地，所述核酸提取液1为Glass Milk，使用时每份样品中加入20μL。
优选地，所述核酸提取液2为gDNA Binding Buffer，使用时每份样品添加600μL。
优选地，所述F3、B3组成的外引物对，包括F3:5'-TCCTACAAATCCTCACAGG-3'（SEQID NO1 ）, B3:5'-ACCCATAATATAAGCCTCGT-3'（SEQ ID NO 2），F3的5’端用生物素标记，B3的5’端用地高辛标记。
优选地，所述FIP、BIP组成的内引物对，包括FIP:5'- CGGCAGATATGGGTAACAGAGG-TATTCCTAGCAATACACTACACA-3'（SEQ ID NO 3 ）,BIP:5'-GACGTGAACTACGGCTGAATCAT-CCTACGTGCATATATAAGCAG-3'（SEQ ID NO 4）。
优选地，所述LF、LB组成的环引物对，包括LF:5'- AGAATGCTGTTGTTGTGTCGGA-3'（SEQ ID NO 9）, LB:5'-CCGATACATACACGCAAACGGAG-3'（SEQ ID NO 10）。
优选地，所述LAMP扩增反应体系优选为25μL的体系，体系为：1μL提取得到的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM PrimerFIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL去离子水，共25μL；所述2×等温反应缓冲液为：40mM的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH8.8）、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、20%的Tween20、1.6M的甜菜碱、2.8mM dNTP。
优选的，所述一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒中的核酸免疫胶体金试纸条的制备方法如下：
（1）胶体金溶液的制备：取49.5mL去离子水置于处理好的锥形瓶中，加入0.5mL 1％的氯金酸，放入微波炉中加热，当溶液沸腾时加入0.8mL的1％柠檬酸钠，继续放入微波炉中加热，变为葡萄酒红色，取下冷却至室温，避光4℃保存备用；
（2）胶体金标记链霉亲和素的制备：取50mL胶体金溶液，置于三角锥瓶中，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调其pH值至8.5，用移液器吸取220μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min，加入3％的聚乙二醇0.875mL作为稳定剂，混匀15min，封住三角锥瓶的瓶口，4℃保存备用；
（3）核酸免疫胶体金试纸条的组装：所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、牛羊源性检测线T线；所述质控线C线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.5mg/mL的BSA化生物素；所述检测线T线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.25mg/mL的抗地高辛抗体；所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线C线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效；
优选的，所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL，喷量为1μL/cm～10μL/cm。
优选的，所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL，喷量为5μL/cm～10μL/cm。
优选的，所述一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，检测牛羊源性成分包括以下步骤：
（1）提取待测样品DNA：待测样品为液体时每份样品取200μL，待测样品为膏状或固态时每份样品取200mg，所述样品中加入300μL的核酸裂解液，56℃反应30min，振荡5～10s，100℃反应8min，高速振荡5～10s，13000r/min 离心3min，保留上清液；向收集的上清液中加入Glass Milk 20μL，gDNA Binding Buffer 600μL，充分混匀，65℃反应15min期间上下颠倒混匀几次，随后室温放置5min，期间上下颠倒混匀几次，4000r/min离心1min，弃上清，保留沉淀物质；向收集的沉淀中加入70%的乙醇500μL，吹打洗涤，8000r/min离心1min，重复2次，加入无水乙醇500μL，吹打洗涤，8000r/min离心1min，弃上清；再次8000r/min离心1min，弃上清，室温干燥10min；加入100μL TE或无菌去离子水，溶解保存；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：将步骤（1）中提取得到的DNA作为模板，以试剂盒中提供的阴性标准品作为阴性对照，试剂盒中提供的阳性标准品作为阳性对照；LAMP检测反应体系为：1μL的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μMPrimer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、4.5μL无菌去离子水；
（3）LAMP扩增反应：65℃水浴25min，80℃终止2min；
（4）结果检测：取步骤（3）中的每种扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
（5）结果判读：肉眼直接观察条带，进行判读；若质控线C线无条带，则试纸条无效；若质控线C线出现红色条带，检测线T线未出现红色条带，则样品为阴性；若质控线C线出现红色条带，检测线T线出现红色条带，则样品为阳性，且红色出现越强说明扩增产物越多，可怀疑含有违禁物品的成分越高；
如上所述，本发明快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，使用时，首先按照要求提取待测样本的DNA，再配制好LAMP的反应体系，放置在65℃的环境中反应25min，80℃终止2min后即可，将扩增产物稀释10倍，取100μL扩增产物稀释到试纸条的加样端，样本如携带牛羊成分，则先与胶体金结合垫上的胶体金标记的链霉亲和素反应形成复合物，由于层析作用，反应复合物沿着层析膜向前移动，被检测线T线上的抗地高辛抗体捕获而聚集，聚集的量越多，则样品阳性程度越强，此时检测结果为阳性；而当样品中没有牛羊成分或其含量低于10ng/μL时，在检测线T线没有或有极少量的复合物聚集，此时检测结果为阴性。同时，质控线C线包被的生物素反应形成一定的条带，则表明检测结果正常，如果质控线C线上不出现条带，说明待测样品在试纸条上没有正常层析。
如上所述，本发明的快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，具有以下有益效果：
（1）本发明根据牛和羊的线粒体cytB基因作为目标靶基因，设计得到的牛和羊的特异性引物制备简单，本发明选择的目标靶DNA易提取、不易降解、稳定性好；
（2）本发明的反应过程中不需要额外添加荧光染料，一般的荧光染料添加后需要同时做几管反应收集荧光或等下观察指形管内溶液的颜色变化，反应结果受指形管的透光性、指形管的本底色和环境的光照影响很大，一般的如果不是强阳性或者反应不充分时不能得到观察到明显地变色，而本发明的反应过程不需要添加荧光染料，结果显示更方便，不易受环境、人员、材料的影响，结果观察更直观准确；
（3）本发明根据牛羊的线粒体cytB基因设计引物，设计并进行试验筛选的引物不仅能够检测牛源性成分同时还能检测羊源性成分，同时又能有效区分其他常被作为化妆品原料的反刍类的动物源，如马、驴、鹿等等，对化妆品中动物源性检测的特异性高，极大的避免出现检测到其他动物源性而出现假阳性，避免在口岸检测一线的检察人员与旅客产生纠纷；
（4）本发明的灵敏度高，在化妆品中原本添加的动物源性成分就不多，而且由于一线检查要求速度、快场地设备条件有限，在提取DNA等步骤中可能出现提取不充分的情况，更容易造成提取得到的DNA含量低、杂质多的问题，而本发明对DNA要求低、敏感性高，可以检测到10ng/μL，相比较普通PCR至少需要100 ng/μL，极大的提高了敏感性和检出率；
（5）本发明的胶体金试纸条，有效保存了检测结果，试纸条的稳定性高，在室温下，未使用的试纸条可以保存一年，使用后出现的检测线T线能有效保存3-6个月，检测结果的有效保存，便于旅客、检测单位、督查组、检疫人员等对结果的复查复审，保证了一线人员执法过程的公信度。
附图说明
图1A显示为本发明第一组引物LAMP扩增结果图，图1B为第二组引物LAMP扩增结果图，图1C为第三组引物LAMP扩增结果图；
图2A显示为本发明的羊DNA的LAMP最佳反应温度筛选结果图，图2B为牛DNA的LAMP最佳反应温度筛选结果；
图3A显示为本发明的羊DNA的LAMP最佳反应时间筛选结果，图3B为牛DNA的LAMP最佳反应时间筛选结果；
图4显示为本发明的LAMP特异性检测结果图；
图5A显示为本发明的羊DNA的LAMP敏感性检测结果，图5B为牛DNA的LAMP敏感性检测结果；
图6显示为本发明的核酸免疫胶体金试纸条的示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
本发明快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒的引物组设计和选择
1、设计引物：
（1）从GenBank中检索获得黄牛、牦牛、家牛的Cytb基因序列，确定序列的准确性。序列如下：
黄牛Cytb基因序列：（SEQ ID NO 13）
牦牛Cytb基因序列：（SEQ ID NO 11）
家牛Cytb基因序列：（SEQ ID NO 12）
（2）从GenBank中检索获得山羊、绵羊的Cytb基因序列，确定序列的准确性。序列如下：（SEQ ID NO ）
山羊Cytb基因序列：（SEQ ID NO 15）
绵羊Cytb基因序列：（SEQ ID NO 14）
（3）从GenBank中检索获得梅花鹿、鹿的Cytb基因序列，确定序列的准确性。序列如下：（SEQ ID NO ）
梅花鹿Cytb基因序列：（SEQ ID NO 16）
鹿Cytb基因序列：（SEQ ID NO 17）
（4）从GenBank中检索获得马的Cytb基因序列，确定序列的准确性。序列如下：（SEQ IDNO ）
马Cytb基因序列：（SEQ ID NO 18）
（5）从GenBank中检索获得驴的Cytb基因序列，确定序列的准确性。序列如下：（SEQ IDNO ）
驴Cytb基因序列：（SEQ ID NO 19）
（6）根据上述序列，利用MEG软件进行比对，查找到黄牛、牦牛、家牛、山羊、绵羊的相对保守，且与梅花鹿、鹿、马、驴没有相似性的序列，序列如下：（SEQ ID NO 20）
（7）根据所得保守序列，利用PrimerExplorer软件进行设计引物，共筛选得到3组引物，所述引物序列如下：
引物组1：
[0070] 引物 [0071] 序列（5‘→3’）
[0072] F3 [0073] TCCTACAAATCCTCACAGG
[0074] B3 [0075] ACCCATAATATAAGCCTCGT
[0076] FIP [0077] CGGCAGATATGGGTAACAGAGG-TATTCCTAGCAATACACTACACA
[0078] BIP [0079] GACGTGAACTACGGCTGAATCAT-CCTACGTGCATATATAAGCAG
[0080] LF [0081] AGAATGCTGTTGTTGTGTCGGA
[0082] LB [0083] CCGATACATACACGCAAACGGAG
引物组2：
[0085] 引物 [0086] 序列（5‘→3’）
[0087] F3 [0088] CGAAAGTCCCACCCACTA
[0089] B3 [0090] GCAGATATGGGTAACAGAGG
[0091] FIP [0092] AGGGAACCGAAATTCGATCATGAT-AACAATGCATTCATCGACCT
[0093] BIP [0094] CCTGGGAATCTGCCTAATCCTAC-AGAATGCTGTTGTTGTGTC
[0095] LF [0096] GAATGCTGTTGTTGTGTCGGA
[0097] LB [0098] CCGATACATACACGCAAACGGAGC
引物组3：
[00100] 引物 [00101] 序列（5‘→3’）
[00102] F3 [00103] GGAATCTGCCTAATCCTACA
[00104] B3 [00105] AATATAAGCCTCGTCCTACG
[00106] FIP [00107] ACAGAGGAGAATGCTGTTGTTG-CTCACAGGCCTATTCCTAG
[00108] BIP [00109] TACCCATATCTGCCGAGACGT-CAGATAAAAAACATTGAAGCTCC
[00110] LF [00111] GAATGCTGTTGTTGTGTCGGA
[00112] LB [00113] CCGATACATACACGCAAACGGAGC
2、制备DNA样品模板：采集山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛、马、驴、梅花鹿、鹿的动物组织，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作提取基因组DNA，或者按照分子克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中，检测DNA浓度，统一稀释为500ng/μL，保存备用；
3、配制LAMP反应体系：1μL的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、4.5μL无菌去离子水；
4、LAMP扩增反应：65℃水浴25min，80℃终止2min；
5、核酸免疫胶体金试纸条的制备：
（1）胶体金溶液的制备：取49.5mL去离子水置于处理好的锥形瓶中，加入0.5mL 1％的氯金酸，放入微波炉中加热，当溶液沸腾时加入0.8mL的1％柠檬酸钠，继续放入微波炉中加热，变为葡萄酒红色，取下冷却至室温，避光4℃保存备用；
（2）胶体金标记链霉亲和素的制备：取50mL胶体金溶液，置于三角锥瓶中，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调其pH值至8.5，用移液器吸取220μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min，加入3％的聚乙二醇0.875mL作为稳定剂，混匀15min，封住三角锥瓶的瓶口，4℃保存备用；
（3）核酸免疫胶体金试纸条的组装：所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、牛羊源性检测线T线；所述质控线C线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.5mg/mL的BSA化生物素；所述检测线T线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.25mg/mL的抗地高辛抗体；
6、结果检测：取步骤4中的每种扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果（如图1所示）；
结果显示：第1组引物检测山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛均出现阳性结果，且检测马、驴、梅花鹿、鹿均为阴性结果；第2组引物检测山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛均出现阳性结果，且检测马、驴、梅花鹿、鹿均为阴性结果，但检测绵羊样本时，检测线T线为弱阳性，且等待时间较长；第3组引物检测山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛均出现阳性结果，且检测马、驴、梅花鹿、鹿均为阴性结果，但检测绵羊、山羊样本时，检测线T线均为弱阳性；结果显示第1组为最佳引物。
实施例2
本发明快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，其中LAMP最佳反应条件的建立和优化
分别采用山羊、绵羊的混合DNA，家牛、黄牛、牦牛的混合DNA作为模板，用于建立本发明中LAMP的最佳反应温度和反应时间；
1、配制LAMP反应体系：1μL的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、4.5μL无菌去离子水；
2、LAMP扩增反应：
为确定最佳扩增温度，参照上述反应体系，设置扩增温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃进行扩增以确定最佳的反应条件；（LAMP反应温度对反应产物的影响图如图2所示）。
为确定最佳扩增时间，参照上述反应体系和最佳反应温度，设置反应时间分别为15min、25min、35min、45min以确定最佳的连接反应时间（LAMP反应时间对产物的影响图如图3所示）。
3、结果检测：取步骤（3）中的每种扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
4、结果判读：肉眼直接观察条带，进行判读；
结果显示羊、牛的LAMP反应的最佳反应温度均为65℃，羊、牛的LAMP反应的最佳反应时间均为25min。
实施例3
本发明快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒的特异性检测
分别采用山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛、马、驴、梅花鹿、鹿、兔、鼠、骆驼的DNA作为模板，用于建立本发明的特异性进行检测，其中dH2O作为阴性对照；DNA模板获取方法和LAMP反应体系和条件见前，将12个物种的LAMP扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
结果显示见图4，说明本方面提供的快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒能保证对山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛的特异性检测，并不与其他物种发生交叉反应。
实施例4
本发明快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒的敏感性检测
分别采用山羊、绵羊的混合DNA，家牛、黄牛、牦牛的DNA混合物作为模板，将核酸按10倍连续梯度稀释，稀释倍数依次为101、102、103、104、105，其中dH2O作为阴性对照；依据OD值计算羊源性的核酸终浓度为30、3、3×10-1、3×10-2、3×10-3、3×10-4μg/μL牛源性的核酸终浓度为10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μg/μL；LAMP反应体系和条件见前最佳条件，将羊、牛两组混合核酸的LAMP扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
结果显示见图5，说明本方面提供的快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒能检测的山羊、绵羊的最低样本DNA模板浓度为3×10-3μg/μL，家牛、黄牛、牦牛的最低样本DNA模板浓度为1×10-3μg/μL。
实施例5
从某商场购买采集收到含有动物源性成分的化妆品共40份，这些化妆品来自不同品牌，种类众多、形状多样，采用本发明实施例1的最佳温度和时间的方法检测这些化妆品中是否含有牛、羊源性成分，同时采用PCR方法验证，比较本试剂盒的敏感性和准确性。
表1：山东省内购买动物源性化妆品牛羊源性检测结果：
检测结果如下：
[00145] [00146] 牛羊源性 [00147] 不含牛羊源性成分
[00148] PCR [00149] 23 [00150] 17
[00151] 试剂盒 [00152] 23 [00153] 17
[00154] 说明书标出牛羊成分 [00155] 20 [00156] 20
结果显示PCR方法与试剂盒结果一致，同时说明某些化妆品的标签与实际的成分不符，在口岸一线发明一种简单快速的方法十分重要。
综上所述，本发明即可以通过核酸扩增保证检测的特异性和敏感性，又通过固相化的胶体金检测，实现直观性和简便性，操作简单、快速，结果直观且易保存。不仅不需要额外添加荧光染料，而且对化妆品中动物源性检测的特异性高，有效克服了现有技术中的种种缺点，为出入境口岸一线人员提供一种新的有效检测手段，具有高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛出入境检验检疫局
赵风源
<120> 快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒
<130> 9
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcctacaaat cctcacagg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
acccataata taagcctcgt 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cggcagatat gggtaacaga ggtattccta gcaatacact acaca 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gacgtgaact acggctgaat catcctacgt gcatatataa gcag 44
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tattcctagc aatacactac aca 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cggcagatat gggtaacaga gg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cctacgtgca tatataagca g 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gacgtgaact acggctgaat cat 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
agaatgctgt tgttgtgtcg ga 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ccgatacata cacgcaaacg gag 23
<210> 11
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bos grunniens
<400> 11
atgactaaca ttcgaaagtc ccacccacta ataaaaattg taaacaatgc attcatcgac 60
cttccagccc catcaaacat ttcatcatga tggaatttcg gttccctcct gggaatctgc 120
ctaatcctac aaatcctcac aggcctattc ctagcaatac actacacatc cgacacaaca 180
acagcattct cctctgttac ccatatctgc cgagacgtga actacggctg aatcatccga 240
tacatacacg caaacggagc ttcaatgttt tttatctgct tatatatgca cgtaggacga 300
ggcttatatt atgggtccta cacttttcta gaaacatgaa atatcggagt aatccttctg 360
ctcacagtaa tagccacagc attcatagga tacgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcatcac caacctctta tcagcaatcc catacatcgg cacagattta 480
gtcgaatgaa tctgaggcgg attctcagta gacaaagcaa cccttacccg attcttcgct 540
ttccatttta tccttccatt tatcatcata gcaattgcca tagtccacct attattcctc 600
cacgaaacag gctccaacaa tccaacagga atctcctcag acgtagacaa aatcccattc 660
cacccctact ataccattaa ggacatctta ggggccctct tactaattct agctctaatt 720
ctactagtac tattcgcacc cgacctcctc ggagacccag ataactacac cccggccaat 780
ccactcaaca cacctcctca catcaaaccc gaatgatact tcttatttgc atacgcaatc 840
ttacgatcaa tccccaacaa actaggagga gtactagccc tagccttctc tatcctaatt 900
cttgctctaa tccccctact acacacctcc aaacaacgaa gcataatatt ccgaccactc 960
agccaatgcc tattctgagc cctagtagca gacctactga cactcacatg aattggagga 1020
caaccagtcg aacacccata tatcaccatt ggacaactag catctatcct atactttctt 1080
ctcatcctag tactaatacc aacagccggc acagttgaaa acaaattgct aaaatgaaga 1140
<210> 12
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 12
atgactaaca ttcgaaagtc ccacccacta ataaaaattg taaacaatgc attcatcgac 60
cttccagccc catcgaacat ttcatcatga tggaatttcg gttccctcct gggaatctgc 120
ctaatcctac aaatcctcac aggcctattc ctagcaatac actacacatc cgacacaaca 180
acagcattct cctctgttac ccatatctgc cgagacgtga actacggctg aatcatccga 240
tacatacacg caaacggagc ttcaatgttt tttatctgct tatatatgca cgtaggacga 300
ggcttatatt atgggtctta cacttttcta gaaacatgaa atatcggagt aatccttctg 360
ctcacagtaa tagccacagc attcatagga tacgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcatcac caacctctta tcagcaatcc catacatcgg cacaaattta 480
gtcgaatgaa tctgaggcgg attttcagta gacaaagcaa cccttacccg atttttcgct 540
ttccacttta tccttccatt tatcatcata gcaattgcca tagtccacct actattcctc 600
cacgaaacag gctccaacaa tccaacagga atctcctcag acgtagacaa aatcccattc 660
cacccctact ataccattaa ggacatctta ggggccctct tactaattct agctctaata 720
ctactagtac tatttgcgcc caacctcctc ggagacccag ataactacac cccagccaat 780
ccactcaaca cacctcctca catcaaaccc gagtggtact tcctatttgc atatgcaatt 840
ctacgatcaa tccccaataa actaggagga gtcctagccc tagtcttctc catcctaatc 900
cttattctca ttcccttact acacacatcc aaacagcgaa gcataatatt ccgactgctc 960
agccaatgcc tgttctgaat tttagtagca gacctactaa cactcacatg aattggagga 1020
caaccagttg aacatccata catcatcatt ggacaactag catctatcat atactttctc 1080
ctcatcctag tgctaatacc aacagccggc acagttgaaa acaacctact aaaatgaaga 1140
<210> 13
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bos sp.
<400> 13
atgactaaca ttcgaaagtc ccacccacta ataaaaattg taaacaatgc attcatcgac 60
cttccagccc catcaaacat ttcatcatga tcgaatttcg gttccctcct gggaatctgc 120
ctaatcctac aaatcctcac aggcctattc ctagcaatac actacacatc cgacacaaca 180
acagcattct cctctgttac ccatatctgc cgagacgtga actacggctg aatcatccga 240
tacatacacg caaacggagc ttcaatgttt tttatctgct tatatatgca cgtaggacga 300
ggcttatatt atgggtctta cacttttcta gaaacatgaa atatcggagt aatccttctg 360
ctcacagtaa tagccacagc attcatagga tacgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcatcac caacctctta tcagcaatcc catacatcgg cacaaattta 480
gtcgaatgaa tctgaggcgg attctcagta gacaaagcaa cccttacccg attcttcgct 540
ttccatttta tccttccatt tatcatcata gcaattgcca tagtccacct attattcctc 600
cacgaaacag gctccaacaa tccaacagga atctcctcag acgtagacaa aatcccattc 660
cacccctact ataccattaa ggacatctta ggggccctct tactaattct agctctaata 720
ctactagtac tattcgcacc cgacctcctc ggagacccag ataactacac cccggccaat 780
ccactcaaca cacctcctca catcaaaccc gaatgatact tcttatttgc atacgcaatc 840
ttacgatcaa tccccaacaa actaggagga gtactagccc tagccttctc tatcctaatt 900
cttgctctaa tccccctact acacacctcc aaacaacgaa gcataatatt ccgaccactc 960
agccaatgcc tattctgagc cctagtagca gacctactga cactcacatg aattggagga 1020
caaccagtcg aacacccata tatcaccatt ggacaactag catctatcct atactttctt 1080
ctcatcctag tactaatacc aacagccggc acagttgaaa acaaattact aaaatgaaga 1140
<210> 14
<211> 1140
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 14
atgatcaaca tccgaaaaac ccacccacta ataaaaattg taaacaacgc attcattgat 60
ctcccagctc catcaaatat ttcatcatga tgaaactttg gctctctcct aggcatttgc 120
ttaattttac agattctaac aggcctattc ctagcaatac actatacacc tgacacaaca 180
acagcattct cctctgtaac ccacatttgc cgagacgtaa actatggctg aattatccga 240
tatatacacg caaacggggc atcaatattt tttatctgcc tatttatgca tgtaggacga 300
gccctatatt atggatcata taccttccta gaaacatgaa acatcggagt aatcctccta 360
tttgcgacaa tagccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagttattac caacctcctt tcagcaattc catatattgg cacaaaccta 480
gtcgaatgaa tctgaggagg attctcagta gacaaagcta ccctcacccg atttttcgcc 540
tttcacttta ttttcccatt catcatcgca gccctcgcca tagttcacct actcttcctc 600
cacgaaacag gatccaacaa ccccacagga attccatcgg acacagataa aattcccttc 660
cacccttatt acaccattaa agacatccta ggtgctatcc tactaatcct catcctcatg 720
ctactagtac tattcacgcc tgacttactc ggagacccag acaactacac cccagcaaac 780
ccacttaaca ctccccctca catcaaacct gaatgatact tcctatttgc gtacgcaatc 840
ttacgatcaa tccctaataa actaggagga gtcctcgccc taatcctctc aatcctagtc 900
ctagtaatta tacccctcct ccatacatca aagcaacgga gcataatatt ccgaccaatt 960
agtcaatgta tattctgaat cctagtagcc gacctattaa cactcacatg aattggaggc 1020
cagccagttg aacaccccta catcattatt ggacaactag catctattat atatttcctt 1080
atcattctag tcataatacc agtagctagc atcatcgaaa acaacctcct aaaatgaaga 1140
<210> 15
<211> 1140
<212> DNA
<213> Capra hircus
<400> 15
atgaccaaca tccgaaagac ccacccatta ataaaaattg taaacaacgc atttattgac 60
ctcccaaccc catcaaacat ctcatcatga tgaaactttg gatccctcct aggaatttgc 120
ctaatcttac aaatcctgac aggcctattc ctagcaatac actatacatc cgacacaata 180
acagcatttt cctctgtaac tcacatttgt cgagatgtaa attatggctg aatcatccga 240
tacatacacg caaacggagc atcaatattc tttatctgcc tattcataca tatcggacga 300
ggtctatatt atggatcata tacctttcta gaaacatgaa acattggagt aatcctcctg 360
ctcgcgacaa tggccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattt 420
tgaggggcaa cagtcatcac taatcttctt tcagcaatcc catatattgg cacaaaccta 480
gtcgaatgaa tctgaggggg attctcagta gacaaagcca ctctcacccg atttttcgcc 540
ttccacttta tcctcccatt catcatcaca gccctcgcca tagtccacct gctcttcctc 600
cacgaaacag gatcgaacaa ccccacagga attccatcag acacagataa aatcccattt 660
cacccttact acaccattaa agatatctta ggcgccatgc tactaattct tgttctaata 720
ttactagtac tattcacacc cgacctactc ggagacccag acaactatat cccagcaaat 780
ccactcaata caccccctca cattaaacct gagtggtatt tcctatttgc atacgcaatc 840
ctacgatcaa tccccaacaa actaggagga gtcctagccc tagtcctctc aatcctaatc 900
ttagtacttg tacccttcct ccacacatct aaacaacgaa gcataatatt ccgcccaatc 960
agccaatgca tattctgaat cctggtagca gatctattaa cactcacatg aattggagga 1020
cagccagtcg aacatcccta cattattatt ggacaactag catctattat atatttcctc 1080
atcattctag taataatacc agcagctagc accattgaaa acaaccttct aaaatgaaga 1140
<210> 16
<211> 1140
<212> DNA
<213> Cervus nippon
<400> 16
atgactaata tccgaaaaac ccacccatta ataaaaattg taaacaacgc attcattgac 60
ctccccgccc catcaaatat ttcatcctga tgaaatttcg gctccctact aggaatttgt 120
ctaatcctac aaatccttac aggcctattc ctagcaatac actatacatc tgacacaata 180
acagcatttt cctctgtcac ccatatctgt cgagatgtca actatggttg aattatccga 240
tacatacacg caaacggggc atcaatattt ttcatctgcc tattcataca tgtaggacga 300
ggcctgtact acggatcata tacttttcta gagacatgaa acatcggagt aattctccta 360
tttacagtta tagccacagc attcgtagga tatgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcattac caacctcctc tcagcaattc catatattgg cacaaaccta 480
gtcgaatgga tctgaggggg cttctcagta gataaagcaa ccctaacccg atttttcgct 540
ttccacttta ttcttccatt tatcatcgca gcacttgcta tagtacactt actcttcctt 600
cacgagacag gatccaacaa cccaacagga atcccatcgg acgcagacaa aatccccttc 660
catccttact acaccattaa agatatctta ggcatcttac ttctagtact cttcctaata 720
ttactagtat tattcgcacc agacctgctt ggagatccag acaactatac cccagcaaat 780
ccactcaaca caccccctca catcaaacct gaatgatact tcctatttgc atacgcaatc 840
ctacgatcaa ttcccaacaa actaggagga gtcttagccc tagtctcatc catcctaatc 900
ttgattctca tgcctcttct tcacacgtcc aaacaacgca gcatgatatt ccgaccattc 960
agccaatgcc tattctgaat cttagtagca gacctactaa cactcacatg aattggagga 1020
caaccagttg aatatccctt tattattatt ggacaactag catctgttct atactttttc 1080
attatcctag tccttatacc gattaccagc acaatcgaaa ataacctcct aaaatgaaga 1140
<210> 17
<211> 1140
<212> DNA
<213> Cervus elaphus
<400> 17
atgaccaata tccgaaaaac ccacccacta ataaaaattg taaacaacgc atttattgac 60
ctcccagccc catcaaatat ttcatcctga tgaaatttcg gctcattact aggagtctgt 120
ctaatcctac aaatcctcac aggcctattc ctagcgatac actatacatc tgatacaata 180
acagcattct cctctgtcac ccatatctgt cgagatgtca attatggctg aattattcga 240
tatatacacg caaacggggc atcaatattt ttcatctgtc tattcataca tgtagggcga 300
ggcctgtact acggatcata tacttttcta gagacgtgaa acatcggagt agttcttcta 360
tttacagtta tagccacagc attcgtagga tatgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcatcac caaccttctc tcagcaattc catatattgg gacaaaccta 480
gtcgaatgga tctgaggagg cttttcagta gacaaagcaa ccctaacccg atttttcgct 540
ttccacttta ttctcccatt tatcatcgca gcactcgcta tagtacactt actcttcctt 600
cacgaaacag gatctaataa cccaacagga attccatcag acgcagacaa aatccccttt 660
catccttatt ataccattaa agatatctta ggcatcctac ttcttgtact cttcttaata 720
ttactagtat tattcgcacc agacctactt ggagatccag ataactacac cccagcaaac 780
ccactcaaca caccccctca tattaaacct gaatgatatt tcctatttgc atacgcaatc 840
ctacgatcaa ttcccaacaa actaggagga gtcttagccc tagtctcatc catcctagtc 900
ttaattctca tgcctcttct tcacacatcc aaacaacgca gcatgatatt ccgaccattc 960
agtcaatgcc tattctgaat cttagtagca gatctactaa cacttacatg aatcggagga 1020
caaccagtcg aatacccctt tatcattatt ggacaactag catctgtctt atatttcttc 1080
attatcctag tcctcatacc aatcaccagc acaatcgaaa acaacctcct aaaatgaaga 1140
<210> 18
<211> 1140
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 18
atgacaaaca tccggaaatc tcacccacta attaaaatca tcaatcactc ttttattgac 60
ctaccagccc cctcaaacat ttcatcatga tgaaacttcg gctccctcct aggaatctgc 120
ctaatcctcc aaatcttaac aggcctattc ctagccatac actacacatc agacacgaca 180
actgccttct catccgtcac tcacatctgc cgagacgtta actacggatg aattatccgc 240
tacctccatg ccaacggagc atcaatattt tttatctgcc tcttcattca cgtaggacgc 300
ggcctctact acggctctta cacattccta gagacatgaa acattggaat catcctactt 360
ttcacagtta tagctacagc attcatgggc tatgtcctac catgaggcca aatatccttt 420
tgaggagcaa cagtcatcac aaacctccta tcagcaattc cctacatcgg tactaccctc 480
gtcgaatgaa tctgaggtgg attctcagta gacaaagcca cccttacccg attttttgct 540
ttccacttca tcctaccctt catcatcaca gccctggtag tcgtacattt actatttctt 600
cacgaaacag gatctaacaa cccctcaggg atcccatccg atatggacaa aatcccattc 660
cacccatatt atacaattaa agacatccta ggactcctcc tcctgatctt gctcctacta 720
actctagtat tattctcccc cgacctccta ggagacccag acaactacac cccagctaac 780
cctctcagca ctccccctca tattaaacca gaatggtact tcctgtttgc ctacgccatc 840
ctacgctcca ttcccaacaa actaggaggc gtattagccc taatcctctc catcctgatc 900
ctagcactca tccccaccct ccacatatca aaacaacgaa gcataatgtt ccggcctctc 960
agccaatgcg tattctgact cttagtggca gacttactga cactaacatg aatcggcgga 1020
cagccagtgg aacacccata cgtaattatc ggccaactgg cctcaatcct ctacttctcc 1080
ctaattctca tttttatacc actcgcaagc accatcgaaa acaatcttct aaaatgaaga 1140
<210> 19
<211> 1140
<212> DNA
<213> Equus hemionus
<400> 19
atgacaaaca tccggaaatc tcacccacta attaaaatca tcaatcactc ttttattgac 60
ctaccagccc cctcaaacat ttcatcatga tgaaacttcg gctccctcct aggaatctgc 120
ctaatcctcc aaatcttaac aggcctattc ctagccatac actacacatc agacacgaca 180
actgccttct catccgtcac tcacatctgc cgagacgtta actacggatg aattattcgc 240
tacctccatg ccaacggagc atcaatattt tttatctgcc tcttcattca cgtaggacgc 300
ggcctctact acggctctta cacattccta gagacatgaa acattggaat catcctactt 360
ttcacagtta tagctacagc attcatgggc tatgtcctac catgaggcca aatatccttt 420
tgaggagcaa cagtcatcac aaacctccta tcagcaattc cctacatcgg tactaccctc 480
gtcgagtgaa tctgaggtgg attctcagta gacaaagcca cccttacccg attttttgct 540
ttccacttca tcctaccctt catcatcaca gccctggtag tcgtacattt actatttctt 600
cacgaaacag gatctaacaa ccccttagga atcccatcca atatggacaa aatcccattc 660
cacccatatt atacaattaa agacatccta ggactcctcc tcctgatctt gctcctacta 720
actctagtat tattctcccc cgacctccta ggagacccag acaactacac cccagctaac 780
cctctcagca ctccccctca tattaaacca gaatggtact tcctgtttgc ctacgccatc 840
ctacgctcca ttcccaacaa actaggcggc gtattagccc taatcctctc catcctgatc 900
ctagcactca tccccaccct ccacatatca aaacaacgaa gcataatatt ccggcctctc 960
agccaatgcg tattctgact cttagtggca gacttactga cactaacatg aatcggtgga 1020
cagccagtgg aacacccata cgtaattatc ggccaactgg cctcaatcct ctacttctcc 1080
ctaattctca tttttatacc actcgcaagc accatcgaaa acaatcttct aaaatgaaga 1140
<210> 20
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
atgactaaca ttcgaaagtc ccacccacta ataaaaattg taaacaatgc attcatcgac 60
cttccagccc catcaaacat ttcatcatga tcgaatttcg gttccctcct gggaatctgc 120
ctaatcctac aaatcctcac aggcctattc ctagcaatac actacacatc cgacacaaca 180
acagcattct cctctgttac ccatatctgc cgagacgtga actacggctg aatcatccga 240
tacatacacg caaacggagc ttcaatgttt tttatctgct tatatatgca cgtaggacga 300
ggcttatatt atgggtctta cacttttcta gaaacatgaa atatcggagt aatccttctg 360
ctcacagtaa tagccacagc attcatagga tacgtcctac catgaggaca aatatcattc 420
tgaggagcaa cagtcatcac caacctctta tcagcaatcc catacatcgg cacaaattta 480
gtcgaatgaa tctgaggcgg att 503

Claims (7)

1.一种快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于，所述快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒包括：样品处理体系、LAMP扩增反应体系、核酸免疫胶体金试纸条、阳性标准品、阴性标准品；所述样品处理体系包括核酸裂解液、Glass Milk、gDNA Binding Buffer、70%乙醇、无水乙醇；所述LAMP扩增反应体系包括待测样本DNA，牛、羊特异性的LAMP引物组，LAMP等温反应缓冲液，Bst DNA聚合酶；所述LAMP引物组包括：F3、B3组成的外引物对，FIP、BIP组成的内引物对，LF、LB组成的环引物对；所述LAMP引物组中的F3、B3组成的外引物对分别标记生物素和地高辛；所述阳性标准品为含有阳性DNA模板；所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述核酸裂解液包括5%的Chelex-100，20g/L的蛋白酶K，二者以14：1的比例配制，现配现用。
2.根据权利要求1所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述阳性DNA模板包括山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛的基因组DNA；所述阳性标准品制备方法如下：采集山羊、绵羊、家牛、黄牛、牦牛这几种易被感染疯牛病且可作为化妆品原料动物的组织，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作提取基因组DNA，或者按照分子克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中保存备用。
3.根据权利要求1所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述F3、B3组成的外引物对，包括F3: SEQ ID NO1， B3: SEQ ID NO 2，F3的5’端用生物素标记，B3的5’端用地高辛标记；所述FIP、BIP组成的内引物对，包括FIP:SEQ ID NO 3，BIP:SEQ ID NO 4；所述LF、LB组成的环引物对，包括LF: SEQ ID NO 9, LB: SEQ ID NO10。
4.根据权利要求1所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述LAMP扩增反应体系优选为25μL的体系，体系为：1μL提取得到的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μMPrimer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、4.5μL去离子水，共25μL；所述2×等温反应缓冲液为：40mM的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH8.8）、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM (NH4)2SO4、20%的Tween20、1.6M的甜菜碱、2.8mM dNTP。
5.根据权利要求1所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒中的核酸免疫胶体金试纸条的制备方法如下：（1）胶体金溶液的制备：取49.5mL去离子水置于处理好的锥形瓶中，加入0.5mL 1％的氯金酸，放入微波炉中加热，当溶液沸腾时加入0.8mL的1％柠檬酸钠，继续放入微波炉中加热，变为葡萄酒红色，取下冷却至室温，避光4℃保存备用；（2）胶体金标记链霉亲和素的制备：取50mL胶体金溶液，置于三角锥瓶中，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调其pH值至8.5，用移液器吸取220μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min，加入3％的聚乙二醇0.875mL作为稳定剂，混匀15min，封住三角锥瓶的瓶口，4℃保存备用；（3）核酸免疫胶体金试纸条的组装：所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、牛羊源性检测线T线；所述质控线C线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.5mg/mL的BSA化生物素；所述检测线T线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.25mg/mL的抗地高辛抗体；所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线C线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。
6.根据权利要求5所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL，喷量为1μL/cm～10μL/cm；所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL，喷量为5μL/cm～10μL/cm。
7.根据权利要求5所述的快速检测出入境旅客携带物中违禁成分的试剂盒，其特征在于：所述一种快速检测出入境旅客携带化妆品中违禁成分的试剂盒，检测牛羊源性成分包括以下步骤：（1）提取待测样品DNA：待测样品为液体时每份样品取200μL，待测样品为膏状或固态时每份样品取200mg，所述样品中加入300μL的核酸裂解液，56℃反应30min，振荡5～10s，100℃反应8min，高速振荡5～10s，13000r/min 离心3min，保留上清液；向收集的上清液中加入Glass Milk 20μL，gDNA Binding Buffer 600μL，充分混匀，65℃反应15min期间上下颠倒混匀几次，随后室温放置5min，期间上下颠倒混匀几次，4000r/min离心1min，弃上清，保留沉淀物质；向收集的沉淀中加入70%的乙醇500μL，吹打洗涤，8000r/min离心1min，重复2次，加入无水乙醇500μL，吹打洗涤，8000r/min离心1min，弃上清；再次8000r/min离心1min，弃上清，室温干燥10min；加入100μL TE或无菌去离子水，溶解保存；（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：将步骤（1）中提取得到的DNA作为模板，以试剂盒中提供的阴性标准品作为阴性对照，试剂盒中提供的阳性标准品作为阳性对照；LAMP检测反应体系为：1μL的DNA、12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μMPrimer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、4.5μL无菌去离子水；（3）LAMP扩增反应：65℃水浴25min，80℃终止2min；（4）结果检测：取步骤（3）中的每种扩增产物10μL，添加90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；（5）结果判读：肉眼直接观察条带，进行判读；若质控线C线无条带，则试纸条无效；若质控线C线出现红色条带，检测线T线未出现红色条带，则样品为阴性；若质控线C线出现红色条带，检测线T线出现红色条带，则样品为阳性，且红色出现越强说明扩增产物越多，可怀疑含有违禁物品的成分越高。
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