CN108342493A

CN108342493A - 一种畜类成分检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN108342493A
Application number: CN201810435101.XA
Authority: CN
Inventors: 彭丽; 韩嘉钰; 周航; 黄莉
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2038-05-08
Also published as: CN108342493B

Abstract

本发明公开了一种畜类成分检测试剂盒和方法，涉及肉制品检测技术领域。该试剂盒包括如下引物对中的一种或多种的组合：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16、SEQ ID NO.17‑18、SEQ ID NO.19‑20、SEQ ID NO.21‑22、SEQ ID NO.23‑24以及SEQ ID NO.25‑26；采用该试剂盒检测畜类动物源性成分，具有较高的特异性和灵敏度、检测结果准确可靠。

Description

一种畜类成分检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及肉制品检测技术领域，具体而言，涉及一种畜类成分检测试剂盒和方法。

背景技术

近年来，市场出现不法分子利用廉价低值肉制品，掺杂在牛肉羊肉驴肉中进行销售，“以次充好、以假乱真”的现象频出，特别是驴肉等高值肉制品常常掺假有马肉等；欧洲的“马肉风波”就是牛肉制品中掺假了马肉，疑似“挂牛头卖马肉”；我国藏区人民喜爱的手撕牦牛肉、风干牦牛肉等肉制品往往也成为普通牛肉、水牛肉掺假的重灾区；而市场上的羊肉主要包括绵羊肉和山羊肉，这两者价格差距较大，因而市场上也有不法分子将价格较低的绵羊肉掺假到山羊肉中进行销售，大大损害消费者权益，同时也使人们对食品安全信任度降低，造成不良社会影响。

为更好保证食品安全和我国畜牧业安全生产，急需开发一种快速准确技术和商业化试剂盒来进行动物源性成分的快速高通量筛查，达到执法和商检部门需求。因而，需要建立一种快速准确检测鉴定动物源性成分的方法，对我国食品安全及畜牧业安全生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种畜类成分检测试剂盒，该试剂盒可以针对常见的畜类动物源性成分检测例如可对绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡以及驴骡成分的检测，具有较高的灵敏度和特异性，还具有使用方便、检测结果可靠。

本发明的另一目的在于提供一种检测畜类成分的方法，采用该方法可以针对常见的畜类动物源性成分检测例如可对绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡以及驴骡成分的检测，具有较高的灵敏度和特异性，还具有操作简单、检测结果可视化、结果准确等特点。

本发明是这样实现的：

一种畜类成分检测试剂盒，其包括核酸组合，上述核酸组合包括如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的用于检测绵羊源性成分的第一引物对；

包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的用于检测山羊源性成分的第二引物对；

包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的用于检测黄牛源性成分的第三引物对；

包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的用于检测水牛源性成分的第四引物对；

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测牦牛源性成分的第五引物对；

包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物的用于检测马源性成分的第六引物对；

包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物的用于检测驴源性成分的第七引物对；

包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物的用于检测鹿源性成分的第八引物对；

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测猫源性成分的第九引物对；

包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物的用于检测狗源性成分的第十引物对；

包括SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ ID NO.22所示的下游引物的用于检测骆驼源性成分的第十一引物对；

包括SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ ID NO.24所示的下游引物的用于检测马CKM基因的第十二引物对；通过检测马、驴核基因CKM基因和马线粒体基因，可实现对马骡源性成分的检测；

包括SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ ID NO.26所示的下游引物的用于检测驴CKM基因的第十三引物对，通过检测马、驴核基因CKM基因和驴线粒体基因，可实现对驴骡源性成分的检测。

上述的第一引物对至第十一引物对可针对相应动物类别的Cytb基因检测。

上述13种引物对可用于同时在同一体系中进行多重PCR，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度，此外，在多重PCR的基础上还本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在膜芯片上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

需要说明是，核酸组合包括可以是包括第一引物对至第十三引物对中任意的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种的组合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括膜芯片，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.27-39所示的探针中的一种或多种。

SEQ ID NO.27所示的探针为绵羊探针，其可以与第一引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.28所示的探针为山羊探针，其可以与第二引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.29所示的探针为黄牛探针，其可以与第三引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.30所示的探针为水牛探针，其可以与第四引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.31所示的探针为牦牛探针，其可以与第五引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.32所示的探针为马探针，其可以与第六引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.33所示的探针为驴探针，其可以与第七引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.34所示的探针为鹿探针，其可以与第八引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.35所示的探针为猫探针，其可以与第九引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.36所示的探针为狗探针，其可以与第十引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.37所示的探针为骆驼探针，其可以与第十一引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.38所示的探针为马CKM探针，其可以与第十二引物对的扩增产物特异性结合。

SEQ ID NO.39所示的探针为驴CKM探针，其可以与第十三引物对的扩增产物特异性结合。

膜芯片所固定的探针类别与引物对的组合类别相对应匹配。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

上述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.43所示；

上述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.44所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.45所示。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合，而不与阴性探针结合。因此，在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合内参引物对，该内参引物对包括SEQ ID NO.40所示的上游引物和SEQ ID NO.41所示的下游引物。

该内参引物对可对actin基因扩增，提高检测结果的可靠性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有内参探针，该内参探针序列如SEQ ID NO.42所示。该内参探针可以与内参引物对的扩增产物结合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

存在于上游引物的5’端或下游引物的5’端的标记物可以使得扩增产物带有相应的标记物，当PCR产物与探针结合后，通过该标记物扩增产物易于与带有对应标记物的催化酶相结合，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置是否有相应的扩增产物，进而可判断样本中的动物源性成分类别。

当引物的5’端的标记物为地高辛时，则可采用由地高辛抗体标记的催化酶来进行显色反应。当引物的5’端的标记物为异硫氰酸荧光素时，则可采用由异硫氰酸荧光素抗体标记的催化酶来进行显色反应。当引物的5’端的标记物为生物素，则可采用由链霉亲和素标记的催化酶来进行显色反应。

该试剂盒可以针对常见的畜类动物源性成分检测例如可对绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡以及驴骡的检测，具有较高的灵敏度和特异性，还具有使用方便、检测结果可靠。

需要说明的是，上述核酸组合的各引物对可以是各自独立地的方式并以液体或粉末的形式存在，也可以是以所有引物对混合在一起的方式以液体或粉末的形式存在。

一种检测畜类成分的方法，对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

上述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ ID NO.24所示的下游引物的用于检测马CKM基因的第十二引物对；

包括SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ ID NO.26所示的下游引物的用于检测驴CKM基因的第十三引物对。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

上述13种引物对中对的两种或两种以上的组合在同一体系中进行多重PCR，可避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度。此外，在多重PCR的基础上使用上述的核酸组合还可同时进行非对称PCR(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

将上游引物与下游引物的摩尔比，或者下游引物与上游引物的摩尔比控制在1.1-1.5的范围内，在节约引物使用量的情况下，可以取得较好的扩增效果。

在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比可以是1.1、1.2、1.3、1.4、1.5中的任意一者或两者之间的范围。或者，在本发明的一些实施方案中，各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比可以是1.1、1.2、1.3、1.4、1.5中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.2，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.2。

将上游引物与下游引物的摩尔比，或者下游引物与上游引物的摩尔比控制在1.2，具有较佳的扩增效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述PCR扩增反应之后，上述方法还包括：杂交步骤；

上述杂交步骤包括：将由上述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.27-39所示的探针中的一种或多种。

采用该方法可以针对常见的畜类动物源性成分检测例如可对绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡以及驴骡成分的检测，具有较高的灵敏度和特异性，还具有操作简单、检测结果可视化、结果准确等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中提供的膜芯片的模式结构图；

图2为本发明实施例3中的对实施例1的试剂盒进行特异性检测的结果；

图3为本发明实施例4中的对实施例1的试剂盒进行灵敏度检测的结果(图中：A/B/C代表重复的实验结果)；

图4为本发明实施例5中的羊肉串样本的检测结果；

图5为本发明实施例5中的驴肉火烧样本的检测结果；

图6为本发明实施例5中的风干牛肉样本的的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种畜类成分检测试剂盒，其包括核酸组合和膜芯片。

其中，核酸组合包括如下引物对、阳性对照探针、阴性对照探针以及阳性寡核苷酸单链DNA；各引物对的下游引物的5’端标记有生物素。各引物对的上游引物和下游引物的碱基序列(5’-3’)如下：

用于检测绵羊源性成分的第一引物对：

上游引物：GGTGCTATCCTACTAATCCTCA(SEQ ID NO.1)，下游引物：biotin-TGTTAAGTGGGTTTGCTGGGG(SEQ ID NO.2)；

用于检测山羊源性成分的第二引物对：

上游引物：GGCGCCATGCTACTAATTCTTG(SEQ ID NO.3)，下游引物：biotin-TATTGAGTGGATTTGCTGGG(SEQ ID NO.4)；

用于检测黄牛源性成分的第三引物对：

上游引物：GCATTCATCGACCTTCCAGCC(SEQ ID NO.5)，下游引物：biotin-TAGGCCTGTGAGGATTTGTAG(SEQ ID NO.6)；

用于检测水牛源性成分的第四引物对：

上游引物：GGCATATACTACGGATCA(SEQ ID NO.7)，下游引物：biotin-GTATGGGATTGCTGAGAG(SEQ ID NO.8)；

用于检测牦牛源性成分的第五引物对：

上游引物：GACATCTTAGGAGCCTTATTAC(SEQ ID NO.9)，下游引物：biotin-GCAAATAAGAAGTATCATTCG(SEQ ID NO.10)；

用于检测马源性成分的第六引物对：

上游引物：CAGGAATCCCATCCAATATG(SEQ ID NO.11)，下游引物：biotin-TAGTAGGAGTAAGATCAGGAGA(SEQ ID NO.12)；

用于检测驴源性成分的第七引物对：

上游引物：GCCTTCCACTTTATTCTAC(SEQ ID NO.13)，下游引物：biotin-GAATGGGATTTTGTCTATGTCAG(SEQ ID NO.14)；

用于检测鹿源性成分的第八引物对：

上游引物：GGAGTCTTAGCCCTAGTCTC(SEQ ID NO.15)，下游引物：biotin-ATGGTCGGAATATCATGCTG(SEQ ID NO.16)；

用于检测猫源性成分的第九引物对：

上游引物：GTTACCCACATCTGTCGCGACG(SEQ ID NO.17)，下游引物：biotin-GGTGTAGGAGCCGTAGTATATTCC(SEQ ID NO.18)；

用于检测狗源性成分的第十引物对：

上游引物：GTCGCCGATCTTCTCACT(SEQ ID NO.19)，下游引物：biotin-GCGACTTGTCCGATAATGATG(SEQ ID NO.20)；

用于检测骆驼源性成分的第十一引物对：

上游引物：CATATTCTTCATCTGCTTGT(SEQ ID NO.21)，下游引物：biotin-TTCTAGGAAGGCGTAGGAA(SEQ ID NO.22)；

用于检测马CKM基因的第十二引物对：

上游引物：GCATCCATCCGTCCATGCAC(SEQ ID NO.23)，下游引物：biotin-TGCGTGCGTGGATAGTTG(SEQ ID NO.24)；

用于检测驴CKM基因的第十三引物对：

上游引物：GCATCCATGCATCCATCCAACCA(SEQ ID NO.25)，下游引物：biotin-GTTGCGTGCATGGGTGCATGC(SEQ ID NO.26)；

内参引物对：

上游引物：GAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT(SEQ ID NO.40)，下游引物：biotin-AGAAGCATTTGCGGTGGACG(SEQ ID NO.41)；

阳性寡核苷酸单链DNA：

biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC(SEQ ID NO.45)。

此外，本实施例中，膜芯片表面固定有探针，探针包括16种，各探针的碱基序列(5’-3’)如下：

内参探针，其可以与内参引物对的扩增产物特异性结合：TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA(SEQ ID NO.42)

绵羊探针，其可以与第一引物对的扩增产物特异性结合：CACGCCTGACTTACTCGGAGACCCAGAC(SEQ ID NO.27)；

山羊探针，其可以与第二引物对的扩增产物特异性结合：CCGACCTACTCGGAGACCCAGACAAC(SEQ ID NO.28)；

黄牛探针，其可以与第三引物对的扩增产物特异性结合：CATGATGAAATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATC(SEQ ID NO.29)；

水牛探针，其可以与第四引物对的扩增产物特异性结合：CGCAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACG(SEQ ID NO.30)；

牦牛探针，其可以与第五引物对的扩增产物特异性结合：CTTCTGGTACTATTCACACCCGACCTCCTCGGAGA(SEQ ID NO.31)；

马探针，其可以与第六引物对的扩增产物特异性结合：ATACAATTAAAGACATCCTAGGACTCC(SEQ ID NO.32)；

驴探针，其可以与第七引物对的扩增产物特异性结合：CTGGTAATCGTCCATCTACTATTCCTC(SEQ ID NO.33)；

鹿探针，其可以与第八引物对的扩增产物特异性结合：TCCTAATCTTGATTCTCATGCCTCTTCTT(SEQ ID NO.34)；

猫探针，其可以与第九引物对的扩增产物特异性结合：TATTTACACGCCAACGGAGCTTCTA(SEQ ID NO.35)；

狗探针，其可以与第十引物对的扩增产物特异性结合：GGAGGACAACCAGTTGAGCACCCTTTC(SEQ ID NO.36)；

骆驼探针，其可以与第十一引物对的扩增产物特异性结合：ATCCACGTGGGTCGTGGGCTTTAC(SEQ ID NO.37)；

马CKM探针，其可以与第十二引物对的扩增产物特异性结合：CCGTCCATGCACCCTCCCATCCA(SEQ ID NO.38)；

驴CKM探针，其可以与第十三引物对的扩增产物特异性结合：TGCATCCATCCAACCATCTATGC(SEQ ID NO.39)；

阳性对照探针(PC)：

GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG(SEQ IDNO.43)；

阴性对照探针(NC)：

GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC(SEQ IDNO.44)。

上述16种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在膜芯片上的相应位置。需要说明的是，在其他的实施例中，探针的固定顺序或位置可与本实施例有所不同。

需要说明的是，在其他的实施例中，膜芯片上固定的探针类型可以是上述探针中的一种或多种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

其中，上述膜芯片的制作方法可参考如下方法：

(1)探针制备：根据上述探针序列，合成5’端带有氨基修饰的探针，用0.5mol/LNaHCO₃分别稀释各探针，制备5μM探针溶液；

(2)探针固定：先对膜芯片活化使其带有羧基，将各种探针溶液按图1所示的位置顺序地分别点制到膜芯片上，探针通过末端的氨基固定在膜芯片上。

需要说明的是，膜芯片的材质可以是硝酸纤维素膜或尼龙膜，或者是聚丙烯膜，或者是硅片等能够起到固相支撑的作用的物质。本实施例中，膜芯片为硝酸纤维素膜。

(3)芯片封闭：采用氢氧化钠终止反应，封闭探针，室温晾干后，保存备用，制成膜芯片。

该试剂盒可针对常见的畜类动物源性成分检测例如对绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡以及驴骡成分的检测，其具有较高的灵敏度、特异性、结果准确可靠等特点。

实施例2

本实施例提供了采用实施例1的畜类成分检测试剂盒检测样本畜类成分的方法，步骤如下：

2.1按照CTAB法提取待测样本的基因组DNA，每50mg待测样本经DNA提取后，并用微量核酸测定仪将DNA溶液稀释至同一质量浓度(100-200ng/μL)，得到待测样本的DNA模板(100-200ng/μL)。

2.2多重PCR体系和条件

多重PCR扩增的反应体系如下：

10×PCR Buffer：5μL；

dNTP(2.5mM each)：5μL；

各引物对：上游引物(20μM)：0.5μL，下游引物(20μM)：0.6μL，将第一引物对至第十三引物对以及内参引物对加入同一体系中；

EX-Taq Polymerase(Takara,5U/μL)：0.5μL；

待测样本的DNA模板(100ng/μL)：2μL；

阳性寡核苷酸单链DNA(20μM)：0.5μL；

加ddH₂O至总体积50μL。

对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR反应条件如下：

预变性：温度95℃、时间10分钟；变性：温度95℃、时间30秒，退火：温度55℃、时间30秒，延伸：温度72℃、时间15秒，30个循环；最后延伸：温度72℃、时间10分钟。得到多重PCR产物。

2.3将得到多重PCR产物后，进行膜芯片斑点杂交检测，具体如下。

(1)将固定有探针的膜芯片放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液(100mmol/L NaOH)1mL，37℃孵育8min；

(2)加入去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)1mL，60℃孵育5min；

(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)，加入杂交体系液(将PCR后产物变性后加入杂交液(2×SSPE，0.1％SDS)中混合得到)1mL，45℃水平摇床90rpm孵育45min；

(4)吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，52℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(5)吸除杂交清洗液，加入预热好的酶孵育液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，按1:2000的比例加入到999.5μL的孵育液(2×SSPE，0.5％SDS)中)，42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30min；

需要说明的是，本实施例中，催化酶为碱性磷酸酶。在其他的实施例中，催化酶也可以是辣根过氧化物酶或者葡萄糖氧化酶。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，后续步骤所用的底物可以是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

当催化酶为葡萄糖氧化酶时，底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

(6)吸除酶孵育液，加入预热好的孵育清洗液1(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，42℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(7)吸除孵育清洗液1，加入预热好的孵育清洗液2(含：0.3mol/L NaCl，20mmol/LNaH₂PO₄，20mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4)1mL，37℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(8)吸除孵育清洗液2，加入显色液(含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL，室温静置显色15min。

需要说明的是，在其他的实施例中，当催化酶为碱性磷酸酶时，底物还可以是对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

(9)吸除显色液，加入去离子水1mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。

表1杂交流程表

(10)结果分析：

在实际的样本检测过程中，应当设置空白对照、阴性对照、阳性对照，提高检测结果的准确性。

a)空白对照：使用水作为空白对照样本作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，其余靶点不显色；

b)阴性对照：使用阴性对照样本(除绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡、驴骡以外的动物DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色；

c)阳性对照：使用阳性对照样本(含绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡、驴骡中的一种动物的或多种动物的混合的DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色，相应靶点显色(例如是阳性对照样本含绵羊DNA和黄牛DNA，则在膜芯片上固定绵羊探针和黄牛探针的靶点区域有显色)；

同时满足以上三个条件的为有效实验，则可根据显色结果判断所含畜类动物源性成分。

需要说明的是：可通过肉眼判读结果，也可采用扫描仪判读结果，以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值，设定各靶标阈值，若信号值大于阈值判定为阳性，小于阈值判定为阴性。

实施例3

检测实施例1提供的试剂盒的特异性

检测方法按实施例2的检测方法进行。

取已知物种样品包括绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、马、驴、鹿、猫、狗、骆驼、马骡、驴骡、猪、鸡、鸭、兔、貂、狐、鼠、貉、鱼、火鸡等23种物种标准DNA，作为模板，按照实施例2的检测方法进行特异性检测。

结果如图2所示，各阳性杂交点显色清晰，无漏检、多检现象，阴性样本无交叉显色，说明实施例1提供的试剂盒以及实施例2的检测方法具有良好的检测特异性。

实施例4

检测实施例1提供的试剂盒的灵敏度

检测方法按实施例2的检测方法进行。

选取三个有代表性的样本绵羊、水牛、牦牛，用鸡DNA对目标样品进行掺杂，制成含0.1％(质量百分数)目标DNA的各标准样品(例如含0.1％的绵羊DNA,99.9％的鸡DNA)，以此作为模板，进行检测，每个样品进行3次重复。

结果如图3所示，在低至0.1％的浓度下仍然能够将目标DNA检出，说明实施例1提供的试剂盒以及实施例2的检测方法具有良好的灵敏度。

实施例5

市场样本检测

采集市场样本羊肉串、驴肉火烧、风干牛肉各一个。

样品提取：采用快速裂解液对市场样品进行裂解，快速制备DNA样本，也可以采用同等效果试剂盒提取DNA；

采用实施例1的试剂盒，按实施例2的检测方法进行检测。结果如图4-6所示。

羊肉串样本的检测结果如图4所示，检出其含有绵羊源性成分，经测序确认含有绵羊源性成分。采用实施例1的试剂盒的检测结果与测序结果一致，说明采用实施例1的试剂盒的检测结果可靠准确。

驴肉火烧样本的检测结果如图5所示，检出其含有马源性成分，未检出其驴肉成分，经测序确认含有马源性成分，而不含有驴源性成分。采用实施例1的试剂盒的检测结果与测序结果一致，说明采用实施例1的试剂盒的检测结果可靠准确。

风干牛肉样本的的检测结果如图6所示，检出其含有水牛源性成分，经测序确认含有水牛源性成分。采用实施例1的试剂盒的检测结果与测序结果一致，说明采用实施例1的试剂盒的检测结果可靠准确。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华汉三创生物科技有限公司

<120> 一种畜类成分检测试剂盒和方法

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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catgatgaaa tttcggttcc ctcctgggaa tc 32

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cgcagtaata gccacagcat ttataggata cg 32

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cttctggtac tattcacacc cgacctcctc ggaga 35

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<212> DNA

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tcctaatctt gattctcatg cctcttctt 29

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<400> 45

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Claims

1.一种畜类成分检测试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合，所述核酸组合包括如下引物对中的一种或多种的组合：

2.根据权利要求1所述的畜类成分检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.27-39所示的探针中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的畜类成分检测试剂盒，其特征在于，所述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.43所示；

所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.44所示。

4.根据权利要求3所述的畜类成分检测试剂盒，其特征在于，所述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.45所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的畜类成分检测试剂盒，其特征在于，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

6.一种检测畜类成分的方法，其特征在于，对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

所述杂交步骤包括：将由所述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.27-39所示的探针中的一种或多种。

10.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。