CN108531611A

CN108531611A - 一种检测动物源性成分的方法

Info

Publication number: CN108531611A
Application number: CN201810244354.9A
Authority: CN
Inventors: 陈浩东; 云振宇; 黄盈; 韩嘉钰; 张红光; 黄莉
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明公开了一种检测动物源性成分的方法，涉及肉制品检测技术领域，本发明公开的检测方法，可以检测出样品的多种动物源性成分，具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性强、检测结果可视化、结果准确等诸多特点中的一种或多种特点，为执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力提供了保障。

Description

一种检测动物源性成分的方法

技术领域

本发明涉及肉制品检测技术领域，具体而言，涉及一种检测动物源性成分的方法。

背景技术

食品安全关系着人们身体健康，关系着人民幸福感的提高。近年来，市场出现不法分子利用廉价低值肉制品冒出高价值肉制品，以次充好，甚至将一些未经检验检疫的肉制品进行销售。这些市场行为，大大损害消费者权益，同时也使人们对食品安全信任度降低，造成不良社会影响。为更好保证食品安全生产，急需开发一种快速准确的技术和商业化试剂盒来进行动物源性成分的高通量筛查，达到执法和检测部门需求。

国内外对于动物源性成分的检测报道主要有物理、化学、免疫学、普通PCR、等温扩增、荧光定量PCR等方法，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法全面分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，这些方法不能很好满足快速、大规模、高通量检测的需求。因此研发一种快速、方便、灵敏度高、成本低、可视化和高通量的检测方法将有利于执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力，具有非常好的市场应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于动物源性成分检测的核酸组合，该核酸组合可检测出待测样品中的动物源性成分类别，具有较强的特异性、灵敏度和可靠性。

本发明的另一目的在于提供上述核酸组合的应用，将其用于制备动物源性成分检测试剂盒，有利于满足对特异性好、灵敏度高、结果可靠的动物源性成分检测试剂盒的需求。

本发明的另一目的在于提供一种动物源性成分检测试剂盒，其含有上述的核酸组合，该试剂盒具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性强、检测结果可视化、结果准确等诸多特点中的一种或多种特点，为执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力提供了保障。

本发明的另一目的在于提供一种动物源性成分的检测方法，该检测方法有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性强、检测结果可视化、结果准确等诸多特点中的一种或多种特点，为执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力提供了保障。

本发明是这样实现的：

一种用于动物源性成分检测的核酸组合，其包括如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的用于检测猪源性成分的第一引物对；

包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的用于检测羊源性成分的第二引物对；

包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的用于检测驴源性成分的第三引物对；

包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的用于检测鼠源性成分的第四引物对；

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测牦牛源源性成分的第五引物对。

其中，第一引物对可针对猪的COX1基因扩增，第二引物对可针对羊的Cytb基因扩增，第三引物对可针对驴的ND1基因扩增，第四引物对可针对鼠Cytb基因扩增，第五引物对可针对牦牛D-LOOP区扩增。

上述5种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度，此外，在多重PCR的基础上还本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增技术(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括碱基序列如SEQ IDNO.11-15所示的探针中的一种或多种。

其中，SEQ ID NO.11所示的探针为猪探针，其可以与第一引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.12所示的探针为羊探针，其可以与第二引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.13所示的探针为驴探针，其可以与第三引物对的扩增产物特异性结合。SEQ IDNO.14所示的探针为鼠探针，其可以与第四引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.15所示的探针为牦牛探针，其可以与第五引物对的扩增产物特异性结合。

上述5种引物对的扩增产物通过碱基互补原则对应地与探针杂交，经显色处理后，可显示出相应颜色，进而使得检测结果可视化，提高检测的便捷性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第一连接基团。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一连接基团为氨基。

通过对探针的5’端的氨基修饰，可以使得在制备膜芯片时，探针更容易或更稳定地结合在膜芯片上，提高其稳定性，防止探针脱落，避免出现假阴性结果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括阳性对照探针，上述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.18所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阳性对照探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第二连接基团。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第二连接基团为氨基。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括阴性对照探针，上述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阴性对照探针的进一步地，在本发明的一些实施方案中，5’端标记有用于固定至膜芯片上的氨基。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合，而不与阴性探针结合。因此，在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括用于扩增内参基因actin基因的第六引物对以及相应的actin探针；

第六引物对包括SEQ ID NO.19所示的上述引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

actin探针的碱基序列如SEQ ID NO.21所示。

第六引物对的扩增产物可特异性地与actin探针结合。

通过对内参基因的检测，可以使得检测结果可靠准确。当然，在其他的实施例中，也可以是使用其他通过内参基因，并不限于actin基因。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述各引物对中的上游引物或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物；

第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。

通过第一亲和物的标记，使得各引物对的PCR产物也带上相应的亲和物，当PCR产物与探针结合后，通过第一亲和物，可以将带有可与第一亲和物特性结合的用第二亲和物标记的催化酶固定，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置的动物源性成分的检测结果。

当然，第一亲和物的类别可根据第一亲和物的类别选择，例如，当第一亲和物是地高辛时，第二亲和物为地高辛抗体；当第一亲和物为异硫氰酸荧光素时，第二亲和物为异硫氰酸荧光素抗体；当第一亲和物是生物素时，第二亲和物为链霉亲和素。

上述的核酸组合在制备动物源性成分检测试剂盒中的应用。

一种用于动物源性成分检测的试剂盒，其包括核酸组合，上述核酸组合包括：如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测牦牛源性成分的第五引物对。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括：包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20的下游引物的用于检测内参actin基因的第六引物对。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括膜芯片，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.11-15所示的探针中的一种或多种。

其中，膜芯片可以是硝酸纤维素膜或尼龙膜，或者是聚丙烯膜，或者是硅片等能够起到固相支撑的作用的物质。较佳地，膜芯片为硝酸纤维素膜。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有阳性对照探针，上述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.18所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有阴性对照探针，上述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有生物素。

通过生物素的标记，使得各引物对的PCR产物也带上相应的生物素，当PCR产物与探针结合后，通过生物素，可以将带有可与第生物素特性结合的用链霉亲和素标记的催化酶固定，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置的动物源性成分的检测结果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括如下组分中的一种或多种：

PCR缓冲液、去活化液、去活化清洗液、杂交清洗液、含链霉亲和素标记的催化酶的酶孵育液、孵育清洗液1、孵育清洗液2以及含上述催化酶的底物的显色液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述催化酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

当催化酶为辣根过氧化物酶时，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

当催化酶为碱性磷酸酶时，底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(NitrotetrazoliμM Blue chloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

当上述催化酶为葡萄糖氧化酶时，上述底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述去活化液为：NaOH溶液；

优选的，上述去活化清洗液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述杂交清洗液为：含0.4％-0.6％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述孵育清洗液1为：含0.4％-0.6％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述孵育清洗液2含有：NaCl、NaH₂PO₄和C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述去活化液为：90-110mmol/L的NaOH溶液；

优选的，上述孵育清洗液2含有：0.25-0.35mol/L NaCl、18-22mmol/L NaH₂PO₄和18-22mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.2-7.5。

一种检测动物源性成分的方法，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

上述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测牦牛源性成分的第五引物对；

各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。

上述5种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度。

进一步地，上述反应体系中还含有：由SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ IDNO.20的下游引物的组成的用于检测内参actin基因的第六引物对。

进一步地，上述反应体系中还含有：SEQ ID NO.18所示的阳性寡核苷酸单链DNA。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

此外，在多重PCR的基础上还本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增技术(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

优选地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.2，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.2。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述PCR扩增反应之后，上述方法还包括：杂交步骤；

上述杂交步骤包括：将由上述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.11-15所示的探针中的一种或多种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有SEQ ID NO.16、17以及21所示的探针。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述杂交处理的条件包括：温度为44-46℃、转速为80-100rpm以及时间为40-50min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行杂交处理之前，上述杂交步骤还包括去活化处理；

上述去活化处理包括：

用去活化液对上述膜芯片进行孵育，36-38℃孵育8-10min；然后用去活化清洗液对上述膜芯片进行孵育，58-62℃孵育4-6min。

上述去活化液为：90-110mmol/L的NaOH溶液；

优选的，上述去活化清洗液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行杂交处理之后，上述杂交步骤还包括酶孵育处理；

上述酶孵育处理包括：将含有上述催化酶的酶孵育液与上述膜芯片接触，在温度为40-44℃、转速为80-100rpm条件下震荡孵育28-32min；

上述催化酶标记有用于与上述第一亲和物特异性结合的第二亲和物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种；

上述第二亲和物选自地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体和链霉亲和素；

优选的，上述催化酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任意一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行酶孵育处理之后，上述杂交步骤还包括显色处理；

上述显色处理包括：将显色液与上述膜芯片接触，静置5-20min

其中，上述显色液含有上述催化酶的底物。

综上，本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行多种动物源性成分检测，其工作原理是首先将针对各种物种特异性序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的特异性序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有亲和物标记例如生物素标记，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标记物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多种动物源性成分。

本发明的检测探针为寡核苷酸探针，其顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。

总之，采用本发明提供的核酸组合、试剂盒和检测方法，可以实现对五种动物源成分即猪、羊、驴、鼠以及牦牛等成分的可视化检测，具有较高的特异性和灵敏度，且操作方便、检测快速、结果可靠等特点。有助于满足对特异性好、灵敏度高、结果可靠的动物源性成分检测试剂盒的需求，可为执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力提供了保障。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的动物源性成分试剂盒的膜芯片上各探针的固定位置模式图；

图2为采用实施例1的试剂盒对猪、羊、驴、鼠、牦牛五种样本及其混合样本的检测结果；

图3为采用实施例1的试剂盒对黄牛、水牛、马、鹿、猫、狗、骆驼、猪、鸡、鸭、兔、貂、狐、貉、鱼、火鸡等16种物种的DNA的检测结果；

图4为采用实施例1的试剂盒对掺入不同比例的模板进行检测的结果；

图5为采用实施例1的试剂盒对不同质量浓度的DNA模板进行检测的结果；

图6为采用实施例1的试剂盒从市场采集的常见肉制品的动物源性成分的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例了一种检测动物源性成分试剂盒，其包括核酸组合以及膜芯片。

其中，核酸组合包括六种引物对，各引物对的上游引物和下游引物的碱基序列(5’-3’)如下：

用于检测猪源性成分的第一引物对：

上游引物：GCTTCATCTTCCTATTCACCGT(SEQ ID NO.1)，下游引物：GTAATACAATGTCTAGGGAG(SEQ ID NO.2)；

用于检测羊源性成分的第二引物对：

上游引物：TATGCATGTAGGACGAGGCCTATA(SEQ ID NO.3)，下游引物：ATTCATTCGACTAGGTTTGTGCC(SEQ ID NO.4)；

用于检测驴源性成分的第三引物对：

上游引物：GGCTATATACAACTTCGCAAAGGAC(SEQ ID NO.5)，下游引物：ATTGGTGCGATAATGAATATGGAT(SEQ ID NO.6)；

用于检测鼠源性成分的第四引物对：

上游引物：AAACATACGAAAAACACACCC(SEQ ID NO.7)，下游引物：ATGGCTAAGAAAAGACCTGT(SEQ ID NO.8)；

用于检测牦牛源性成分的第五引物对：

上游引物：CTAACAACACACATCCCCAA(SEQ ID NO.9)，下游引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA(SEQ ID NO.10)；

用于检测内参actin基因的第六引物对：

上游引物：GAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT(SEQ ID NO.19)，下游引物：AGAAGCATTTGCGGTGGACG(SEQ ID NO.20)。

以及，阳性寡核苷酸单链DNA：

CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC(SEQ IDNO.18)。

其中，每个引物对中的下游引物的5’端以及阳性寡核苷酸单链DNA的5’端带有生物素标记。

需要说明的是，在其他的实施例中，核酸组合可以包括第一至第五引物对中的一种或两种或三种或四种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

此外，本实施例中，膜芯片表面固定有探针，探针包括8种，各探针的碱基序列(5’-3’)如下：

猪探针：GGAGGTCTAACGGGCATTGTACT(SEQ ID NO.11)。

羊探针：TTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAG(SEQ ID NO.12)；

驴探针：ACTACAGCCCATCGCTGATGCC(SEQ ID NO.13)；

鼠探针：CTACCTGCCCCATCCAACATTTCA(SEQ ID NO.14)；

牦牛探针：ACATTATGTCAAACCTACTCCTA(SEQ ID NO.15)；

阳性对照探针(PC)：

GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG(SEQ IDNO.16)；

阴性对照探针(NC)：

GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC(SEQ IDNO.17)；

actin内参探针：TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA(SEQ ID NO.21)。

上述8种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在支持膜上的相应位置。在其他的实施例中，探针的固定顺序可与本实施例有所不同。

其中，上述膜芯片制作方法可参考如下方法：

(1)探针制备：根据上述探针序列，合成与5’端氨基修饰的探针，用0.5mol/LNaHCO₃分别稀释各探针，制备5μM探针溶液；

(2)探针固定：先对膜芯片活化使其带有羧基，将各种探针溶液按图1所示的位置顺序地分别点制到膜芯片上，探针通过末端的氨基进行固定在膜芯片上。其中，Blank位置点制不含探针的NaHCO₃溶液。

(3)芯片封闭：采用氢氧化钠终止反应，封闭探针，室温晾干后，保存备用，制成膜芯片。

需要说明的是，在其他的实施例中，膜芯片上固定的探针可以是上述猪探针、羊探针、驴探针、鼠探针和牦牛探针中的一种或多种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

实施例2

采用上述试剂盒检测待测样本中动物源性成分的方法，具体如下：

2.1按照CTAB法提取待测样本的基因组DNA，每50mg待测样本经DNA提取后，并用微量核酸测定仪将DNA溶液稀释至同一质量浓度(100-200ng/μL)，得到待测样本的DNA模板(100-200ng/μL)。

2.2多重PCR体系和条件

PCR扩增的反应体系：

10×PCR Buffer：5μL；

dNTP(2.5mM each)：5μL；

上游引物(20μM)：0.5μL；

下游引物(20μM)：0.6μL；

EX-Taq Polymerase(Takara,5U/μL)：0.5μL；

待测样本的DNA模板(100ng/μL)：2μL；

加ddH₂O至总体积50μL。

对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR反应条件如下：

预变性：温度95℃、时间10分钟；变性：温度95℃、时间45秒，退火：温度55℃、时间30秒，延伸：温度72℃、时间30秒，30个循环；最后延伸：温度72℃、时间10分钟。得到多重PCR产物。

2.3将得到多重PCR产物后，进行膜芯片斑点杂交检测，具体如下。

(1)将固定有探针的膜芯片放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液(100mmol/L NaOH)1mL，37℃孵育8min；

(2)加入去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)1mL，60℃孵育5min；

(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)，加入杂交体系液(将PCR后产物变性后加入杂交液(2×SSPE，0.1％SDS)中混合)1mL，45℃水平摇床90rpm孵育45min；

(4)吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，52℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(5)吸除杂交清洗液，加入预热好的酶孵育液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，按1:2000的比例加入到999.5μL的孵育液(2×SSPE，0.5％SDS)中)，42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30min；

(6)吸除酶孵育液，加入预热好的孵育清洗液1(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，42℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(7)吸除孵育清洗液1，加入预热好的孵育清洗液2(含：0.3mol/L NaCl，20mmol/LNaH₂PO₄，20mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4)1mL，37℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(8)吸除孵育清洗液2，加入显色液(含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL，室温静置显色15min。

(9)吸除显色液，加入去离子水1mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。

表1杂交流程表

(10)结果分析：

在实际的样本检测过程中，应当设置空白对照、阴性对照、阳性对照，提高检测结果的准确性。

a)空白对照：使用水作为空白对照样本作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，其余靶点不显色；

b)阴性对照：使用阴性对照样本(除猪、羊、驴、鼠、牦牛以外的动物DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色；

c)阳性对照：使用阳性对照样本(含猪、羊、驴、鼠、牦牛中的一种动物的或多种动物的混合的DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色，相应靶点显色(例如是阳性对照样本含猪DNA和羊DNA，则在芯片猪和羊的靶点区域有显色)；

同时满足以上三个条件的为有效实验，则可根据显色结果判断所含动物源性成分。

需要说明的是：可通过肉眼判读结果，也可采用扫描仪判读结果，以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值，设定各靶标阈值，若信号值大于阈值判定为阳性，小于阈值判定为阴性。

实施例3

检测实施例1提供的试剂盒的特异性

检测方法按实施例2的检测方法进行。

3.1采用猪、羊、驴、鼠、牦牛五种样本标准DNA各自独立的作为DNA模板以及将5种DNA混合作为多重PCR时的DNA模板，进行特异性检测，结果如图2所示，各标准样本靶标显色正常，无非特异显色，各样本无交叉反应，特异性较好。样品信息表见表2。

表2 DNA浓度信息表

样本	DNA浓度(ng/μL)	DNA加入量
			猪	21.3	1μL
羊	220.5	1μL
			驴	6.5	1μL
鼠	3.9	1μL
			牦牛	101.5	1μL
五种DNA混合模板	100	2μL

3.2分别采用黄牛、水牛、马、鹿、猫、狗、骆驼、猪、鸡、鸭、兔、貂、狐、貉、鱼、火鸡等16种物种标准DNA，按照实施例2的检测方法，对试剂盒特异性测试。结果如图3所示，该五种动物源成分的芯片探针与上述样本均无交叉反应，特异性较好，阴性样本也无交叉显色，说明方法具有良好的检测特异性。样品信息表见表3。

表3特异性样品信息表

注：多重预混Mix 25μL，包括2×Multiplex PCR Master Mix(多重PCR预混液)18.4μL：PCR体系最终含MgCl₂ 1.5mmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.2mmol/L，UNG酶1U/反应，Taq酶2U/反应；

每7μL Multiplex Primer Mix：包含实施例1所述的内参上游引物(20μM)：0.5μL；内参下游引物(20μM)：0.6μL；猪上游引物(20μM)：0.5μL；猪下游引物(20μM)：0.6μL；羊上游引物(20μM)：0.5μL；羊下游引物(20μM)：0.6μL；驴上游引物(20μM)：0.5μL；驴下游引物(20μM)：0.6μL；牦牛上游引物(20μM)：0.5μL；牦牛下游引物(20μM)：0.6μL；鼠上游引物(20μM)：0.5μL；鼠下游引物(20μM)：0.6μL，阳性寡核苷酸单链DNA((20μM)：0.4μL。

实施例4

检测实施例1的试剂盒的检出限和灵敏度

4.1采用不同掺入比例模板，例如用鸡肉提取DNA，对目标DNA进行掺入混合，分别配制成10％、1％和0.1％掺假成分，例如10％猪成分，其中包含10％猪DNA和90％鸡DNA(由于鸡肉是市面上最常用于掺假的物种，因此选择鸡肉DNA掺杂目标DNA，模拟市场情况)。检测其检出限的下限。结果如图4所示：10％、1％、0.1％均能检测，检测效果理想，其检出限能达到0.1％。样品信息见表4。

表4检出限测试样品信息表

4.2采用已知确认样品DNA，用核酸分析仪定量后，TE稀释到1ng、0.1ng两个梯度浓度，按照下表5进行PCR加样，检测其灵敏度。样品信息表见表5。

表5灵敏度测试样品信息表

结果如图5所示，五种动物源性成分检出限能达到0.1ng，即目标模板量达到0.1ng即可检出。

实施例5

市场样本检测

从不同地方市场上采集常见样品进行检测，包括新鲜肉、火腿肠、卤肉、风干肉干、羊肉卷、火烧等样品类型，验证试剂盒市场应用效果，样本按照实施例2的方法进行。样本信息表如表6。

表6市场样品信息表

样品编号	产品名称	来源
			样品1	鸡肉肠	成都某连锁超市
样品2	玉米肠	成都某连锁超市
			样品3	卤羊肉	成都某农贸市场
样品4	手撕风干牛肉	西藏某大型超市
			样品5	卤牦牛肉	甘肃某农贸市场
样品6	火烧驴肉	山东某驴肉火烧店
			样品7	猪肉串	成都某农贸市场副食区
样品8	牛肉丸	成都某农贸市场副食区
			样品9	羊肉块	成都某农贸市场
样品10	驴肉块	河南某农贸市场
			样品11	羔羊肉片	成都某农贸市场副食区
样品12	小鼠	四川某医院研究所
			样品13	鼠尾	四川某医院研究所
样品14	新鲜牦牛肉	四川甘孜州某农贸市场

检测结果如图6所示，样品1鸡肉肠和样品2玉米肠中检测出了猪源性成分，而产品配料表中并未标注有猪肉成分，采用PCR方法进行对比验证，经测序验证，确认样品1含有猪、鸡源性成分；

样品2含有猪、鸡源性成分，因而这两个产品可能存在掺假成分；

样品5中配料表标记为牦牛肉，但实际检测不到牦牛成分，而检出猪、羊源性成分，经荧光PCR法验证，确认含有猪、羊性成分，存在掺假；

样品6中检测猪肉成分，经荧光PCR法确认，检出猪源性成分，存在掺假；

样品8配料表是牛肉丸，但检出猪成分，经荧光PCR法确认含有猪源性成分，存在掺假；说明市场抽检的14个样品中有5个样品存在掺假情况，掺假严重。经测序或荧光PCR法验证后发现，膜芯片检测结果与荧光PCR法和测序结果一致。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 一种检测动物源性成分的方法

<120> 四川华汉三创生物科技有限公司

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcttcatctt cctattcacc gt 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaatacaat gtctagggag 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatgcatgta ggacgaggcc tata 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attcattcga ctaggtttgt gcc 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctatatac aacttcgcaa aggac 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attggtgcga taatgaatat ggat 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaacatacga aaaacacacc c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggctaaga aaagacctgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaacaacac acatccccaa 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttaagctcgt gatctagtgg a 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggaggtctaa cgggcattgt act 23

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttgcgacaa tagccacagc attcatag 28

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actacagccc atcgctgatg cc 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctacctgccc catccaacat ttca 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acattatgtc aaacctactc cta 23

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca aagtaccag 59

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggttccttga gaaatgtttt acgggattac ttccatgttt gttggatgat cctattttc 59

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctggtacttt ggacactcgt tcttctcgca ctgctcatta ttgcttctga tctggatgc 59

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagcgcaagt actctgtgtg gat 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agaagcattt gcggtggacg 20

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tccaccttcc agcagatgtg gatcagcaag caggagta 38

Claims

1.一种检测动物源性成分的方法，其特征在于，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

所述杂交步骤包括：将由所述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.11-15所示的探针中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述杂交处理的条件包括：温度为44-46℃、转速为80-100rpm以及时间为40-50min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行杂交处理之前，所述杂交步骤还包括去活化处理；

所述去活化处理包括：

用去活化液对所述膜芯片进行孵育，36-38℃孵育8-10min；然后用去活化清洗液对所述膜芯片进行孵育，58-62℃孵育4-6min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去活化液为：NaOH溶液；

所述去活化液为：90-110mmol/L的NaOH溶液；

优选的，所述去活化清洗液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行杂交处理之后，所述杂交步骤还包括酶孵育处理；

所述酶孵育处理包括：将含有所述催化酶的酶孵育液与所述膜芯片接触，在温度为40-44℃、转速为80-100rpm条件下震荡孵育28-32min；

所述催化酶标记有用于与所述第一亲和物特异性结合的第二亲和物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种；

所述第二亲和物选自地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体和链霉亲和素；

优选的，所述催化酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任意一种。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在进行酶孵育处理之后，所述杂交步骤还包括显色处理；

所述显色处理包括：将显色液与所述膜芯片接触，静置5-20min

其中，所述显色液含有所述催化酶的底物。