CN111394481A - 基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法，包含12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物以及基因组DNA。该试剂盒使用方法为提取吸血蠓饱血腹部的血液基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，再根据PCR扩增产物大小来鉴定出对应的寄主。本申请提供扩增12种常见寄主动物Cytb基因的扩增引物及寄主鉴定方法，有利于实现吸血蠓常见寄主生物准确、快速的鉴定，降低物种鉴定成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法，属于吸血蠓类寄主动物的物种鉴定领域。
背景技术
蠓科Ceratopogonidae昆虫隶属于双翅目Diptera长角亚目Nematocera，是长角亚目中最大的一个类群，我国现知37属1176种。吸血蠓(Blood sucking midges)是蠓科昆虫中能叮咬人和动物并吸食其血液的类群总称，全世界共有4属1487种，广泛分布，我国仅有库蠓属Culicoidess、蠛蠓属 Lasiohelea及细蠓属Leptoconops三属吸血蠓。蠓类雄性以花蜜为食，而雌性需吸食血液后卵子才能发育成熟。雌蠓叮咬会造成严重的皮肤损伤，发生皮炎，影响家畜和野生动物的一般健康状况。不仅如此，吸血蠓还会携带病原体并传播给人类、牲畜和野生动物等，在虫媒病的传播中发挥着重要作用。迄今，已从库蠓中分离鉴定出多达35种病毒，其中包括环状病毒 (Orbivirus)、水泡性病毒(Vesiculovirus)、暂时热病毒(Ephemerovirus)、正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)等。因此，准确鉴定吸血蠓类昆虫的寄主偏好，掌握传播媒介吸血习性是对蠓传疾病进行监测、防治的关键。
目前，免疫法和分子测序法是检测吸血蠓寄主的主要方法。免疫法是利用免疫学的方法来鉴定吸血蠓的寄主，但此类方法存在试剂昂贵、步骤复杂繁琐、检测范围有限、容易出现交叉反应导致物种鉴定错误等缺陷。分子测序法是利用通用引物对不同动物的特定基因序列进行PCR扩增，测序后经过数据库比对来鉴定吸血蠓的寄主，但这类方法所用到测序技术产生的经济成本较高，限制了较大样本的鉴定。因此，急需一种准确、快速、简便且检测成本较低的方法，来弥补传统方法的不足。
随着分子生物学的发展，分子检测技术也有了进一步的提升。线粒体DNA基因组具有分子结构简单、无重组、进化速率快、严格的母系遗传等特点，比核DNA更容易检测到，并且在物种内不同个体之间只有1％-2％的差异，而在不同物种之间差异较大。能够将亲缘关系相近或相关的物种区分或鉴定出来。 Cytb基因与线粒体其他基因相比，具有较为保守的结构和大小，包含大量的遗传信息，由于其独具的优势而被广泛的研究应用。本发明提供了12种常见寄主生物(人，牛，羊，鸭，狗，猪，鼠，马，兔，猫，鹿以及鸡)的Cytb 基因特异引物及寄主鉴定方法，有利于实现对上述寄主的快速、准确鉴定，缩短鉴定时间，降低物种鉴定成本。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒。通过提取吸血蠓腹部血粉DNA，利用不同物种的特异引物PCR扩增其Cytb基因，比对PCR产物条带大小，实现吸血蠓寄主准确且快速的鉴定。
为实现上述目标，所采用的技术方案如下：
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：
a、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA 3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA 3’；扩增片段长度为：131bp；
b、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA 3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC 3’；扩增片段长度为：728bp；
c、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG 3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：346bp；
d、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA 3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA 3’；扩增片段长度为：210bp；
e、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG 3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA 3’；扩增片段长度为：409bp；
f、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ATCCTGCCATTCATCATTACCGC3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC 3’；扩增片段长度为：485bp；
g、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA 3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG 3’；扩增片段长度为：73bp；
h、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC 3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC 3’；扩增片段长度为：271bp；
i、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT 3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT 3’；扩增片段长度为：610bp；
j、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT 3’；下游引物：5’TGTTAGGGTTAGGAGATCCGC 3’；扩增片段长度为：555bp；
k、鹿的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TATTGACCTCCCAGCCCCA 3’；下游引物：5’GGGTATTCAACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：984bp；
l、鸡的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAGCAGACACATCCCTAGCC 3’；下游引物：5’TGGTTGGCTTCCGATTCAGG 3’；扩增片段长度为：860bp。
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤一、饱血库蠓标本通过灯诱法和网扫法采集于野外，置于无水乙醇中保存；在体视镜下将饱血腹部分离、保存并做好标记，以备后续分子鉴定；其余部分制成永久玻片，以备形态学鉴定；
步骤二、将分离得到的饱血腹部用蒸馏水洗涤、浸泡，利用TIANamp Genomic DNAKit试剂盒提取其基因组DNA，置于-20℃保存备用；
步骤三、以上述待检测样本DNA、12种寄主动物DNA阳性对照以及蒸馏水阴性对照为模板，分别加入12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物，配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
步骤四、取5-10μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，与 DNA Marker或阳性对照条带进行比对判断出待测样品扩增条带的大小，或者将待测样品与阳性对照条带，即人131bp、牛728bp、羊346bp、鸭210bp、狗409bp、猪485bp、鼠73bp、马271bp、兔610bp、猫555bp、鹿984 bp、鸡860bp进行比对，确定待测样品条带大小；
步骤五、若阴性对照没有扩增出产物，而阳性对照和待测样品有相应条带，则可以根据待测样品条带大小判断出待测蠓虫腹部血粉属于哪一物种，即对应的寄主。
采用上述技术方案的有益效果是：
1、本发明利用物种特异性引物对吸血蠓腹部血粉DNA进行PCR鉴定，可确保鉴定的准确性和可靠性；
2、本发明直接以基因组DNA为模板进行PCR，流程少，操作简单快速，有效的缩短了检测时间；
3、本发明与传统免疫法和分子测序法相比，本方法只需进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，检测成本低，具有更强的适用性，适宜推广。
附图说明
图1为本发明基于物种Cytb基因的吸血蠓寄主鉴定试剂盒的使用方法流程图。
具体实施方式
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：
a、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA 3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA 3’；扩增片段长度为：131bp；
b、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA 3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC 3’；扩增片段长度为：728bp；
c、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG 3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：346bp；
d、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA 3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA 3’；扩增片段长度为：210bp；
e、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG 3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA 3’；扩增片段长度为：409bp；
f、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ATCCTGCCATTCATCATTACCGC3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC 3’；扩增片段长度为：485bp；
g、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA 3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG 3’；扩增片段长度为：73bp；
h、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC 3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC 3’；扩增片段长度为：271bp；
i、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT 3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT 3’；扩增片段长度为：610bp；
j、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT 3’；下游引物：5’TGTTAGGGTTAGGAGATCCGC 3’；扩增片段长度为：555bp；
k、鹿的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TATTGACCTCCCAGCCCCA 3’；下游引物：5’GGGTATTCAACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：984bp；
l、鸡的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAGCAGACACATCCCTAGCC 3’；下游引物：5’TGGTTGGCTTCCGATTCAGG 3’；扩增片段长度为：860bp。
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤一、饱血库蠓标本通过灯诱法和网扫法采集于野外，置于无水乙醇中保存；在体视镜下将饱血腹部分离、保存并做好标记，以备后续分子鉴定；其余部分制成永久玻片，以备形态学鉴定；
步骤二、将分离得到的饱血腹部用蒸馏水洗涤、浸泡，利用TIANamp Genomic DNAKit试剂盒提取其基因组DNA，置于-20℃保存备用；
步骤三、以上述待检测样本DNA、12种寄主动物DNA阳性对照以及蒸馏水阴性对照为模板，分别加入12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物，配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
步骤四、取5-10μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，与 DNA Marker或阳性对照条带进行比对判断出待测样品扩增条带的大小，或者将待测样品与阳性对照条带，即人131bp、牛728bp、羊346bp、鸭210bp、狗409bp、猪485bp、鼠73bp、马271bp、兔610bp、猫555bp、鹿984 bp、鸡860bp进行比对，确定待测样品条带大小；
步骤五、若阴性对照没有扩增出产物，而阳性对照和待测样品有相应条带，则可以根据待测样品条带大小判断出待测蠓虫腹部血粉属于哪一物种，即对应的寄主。
所述PCR反应体系如下：
反应条件为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，猫53℃，人、鸭、狗、兔、鹿54℃，牛、羊、鼠、马、鸡55℃，猪56℃，退火30sec， 72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存。
序列表
<110> 遵义医科大学
<120> 基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法
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<212> DNA
<213> 马(horse)
<400> 16
cgtatgggtg ttccactggc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 17
ggggagcaac cgtaatcact 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 18
tctactggtt ggcctccgat 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 猫(cat)
<400> 19
gcaattccat acatcgggac t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 猫(cat)
<400> 20
tgttagggtt aggagatccg c 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 鹿(deer)
<400> 21
tattgacctc ccagcccca 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 鹿(deer)
<400> 22
gggtattcaa ctggctgtcc t 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(chicken)
<400> 23
cagcagacac atccctagcc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(chicken)
<400> 24
tggttggctt ccgattcagg 20
Claims (3)
1.基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：
a、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA 3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA 3’；扩增片段长度为：131bp；
b、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA 3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC 3’；扩增片段长度为：728bp；
c、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG 3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：346bp；
d、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA 3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA 3’；扩增片段长度为：210bp；
e、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG 3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA 3’；扩增片段长度为：409bp；
f、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ATCCTGCCATTCATCATTACCGC 3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC 3’；扩增片段长度为：485bp；
g、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA 3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG 3’；扩增片段长度为：73bp；
h、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC 3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC 3’；扩增片段长度为：271bp；
i、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT 3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT 3’；扩增片段长度为：610bp；
j、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT 3’；下游引物：5’TGTTAGGGTTAGGAGATCCGC 3’；扩增片段长度为：555bp；
k、鹿的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TATTGACCTCCCAGCCCCA 3’；下游引物：5’GGGTATTCAACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：984bp；
l、鸡的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAGCAGACACATCCCTAGCC 3’；下游引物：5’TGGTTGGCTTCCGATTCAGG 3’；扩增片段长度为：860bp。
2.基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒的使用方法，其特征在于：它包括如下步骤：
步骤一、饱血库蠓标本通过灯诱法和网扫法采集于野外，置于无水乙醇中保存；在体视镜下将饱血腹部分离、保存并做好标记，以备后续分子鉴定；其余部分制成永久玻片，以备形态学鉴定；
步骤二、将分离得到的饱血腹部用蒸馏水洗涤、浸泡，利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取其基因组DNA，置于-20℃保存备用；
步骤三、以上述待检测样本DNA、12种寄主动物DNA阳性对照以及蒸馏水阴性对照为模板，分别加入12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物，配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
步骤四、取5-10μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，与DNA Marker或阳性对照条带进行比对判断出待测样品扩增条带的大小，或者将待测样品与阳性对照条带，即人131bp、牛728bp、羊346bp、鸭210bp、狗409bp、猪485bp、鼠73bp、马271bp、兔610bp、猫555bp、鹿984bp、鸡860bp进行比对，确定待测样品条带大小；
步骤五、若阴性对照没有扩增出产物，而阳性对照和待测样品有相应条带，则可以根据待测样品条带大小判断出待测蠓虫腹部血粉属于哪一物种，即对应的寄主。
3.根据权利要求2所述基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR反应体系如下：
反应条件为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，猫53℃，人、鸭、狗、兔、鹿54℃，牛、羊、鼠、马、鸡55℃，猪56℃，退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111979339A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-11-24 | 云南农业大学 | 与马低氧环境适应性相关的cat基因上的位点及其应用 |
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-
2020
- 2020-05-14 CN CN202010410068.2A patent/CN111394481A/zh active Pending
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