WO2021051622A1 - 一种水体粪便污染检测的引物、试剂盒及高通量溯源方法 - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for quickly tracing the source of fecal pollution in water bodies. More specifically, it uses mitochondrial DNA carried in animal feces as a marker, using nested PCR technology and high-throughput sequencing technology to combine, simultaneously Methods of screening for potential fecal contamination.
- the Chinese patent application number 201510305364.5 and the application publication date of 2015.08.19 discloses a PCR kit for simultaneous detection of dog, pig, and chicken feces contamination in water and a detection method thereof.
- the kit contains a kit designed for the above-mentioned pollution sources.
- Specific primers: Primer 1 to Primer 6, use the above-mentioned mixed primers (6 types) to carry out the amplification reaction in the same PCR system, making it possible to separate the three fecal contamination sources of pigs, dogs, and chickens in the PCR reaction system.
- the present invention can simultaneously detect fecal pollution from sources including humans, livestock and poultry, wild birds and mammals, and the steps are shown in Figure 1.
- humans, pigs, cows, sheep, chickens, ducks, geese, cats, mice, and myna are selected as representatives, and the fecal pollution water samples of various species are simulated in the laboratory to verify the applicability of the universal primers of the present invention. .
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Abstract
一种水体粪便污染检测的引物、试剂盒及高通量溯源方法，检测范围涵盖人类、畜禽类及多种野生动物类粪便污染，属于水体污染检测领域。其主要包括以下步骤：提取待测水样DNA；利用两对扩增线粒体DNA的通用引物对水样DNA进行巢式PCR扩增；将扩增产物进行高通量测序；将测序数据与线粒体DNA数据库进行比对注释，基于比对结果确定水样中存在的粪便污染来源。利用巢式PCR技术对水样中指示粪便污染的线粒体DNA进行扩增，具有极高的灵敏性，采用通用引物结合高通量测序，不仅能够同时对多种潜在粪便污染进行定性溯源，还能对各类粪便污染的程度进行相对定量，从而确定主要污染源。
Description
本发明涉及一种水体粪便污染快速溯源方法，更具体地说，是一种以动物粪便中携带的线粒体DNA为标志物，采用巢式PCR技术与高通量测序技术相结合，同时对多种潜在粪便污染进行筛查的方法。
近年来，随着人口和经济的不断增长，水污染情况日趋严重，其中粪便污染尤为突出。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成水体富营养化，而且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播。因此进行水体粪便污染防治刻不容缓。
粪便污染的潜在污染源种类繁多，包括人类生活污水、畜禽养殖废水、宠物以及野生动物排泄物等，这些污染物由于缺乏适当的处理，常常被直接排放到环境中，造成水体粪便污染。在污染事件不明的情况下，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只能停留在“见污治污”阶段，这在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分并准确定位水体中的粪便污染源，成为了解决问题的关键。
目前粪便污染溯源通常采用源标志物法，即通过检测水中能够指示粪便来源的标志物对粪便污染进行识别。研究较多的标志物包括化学标志物和微生物标志物，但现存的一些化学及微生物标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。近年来，研究者们发现粪便中存在大量来自脱落肠道细胞的线粒体DNA，由于线粒体DNA特定片段中存在大量单核苷酸多态位点，使得线粒体DNA具有种属特异性，可以通过检测粪便污染水体中的线粒体DNA片段来达到粪便污染溯源的目的。同时线粒体DNA片段中又存在一定量的保守区，使得通过设计PCR通用引物扩增不同物种的线粒体DNA片段成为可能。
经检索，现有技术已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为201510300317.1，申请公布日为2015.09.02的申请案的方法公开了一种巢式PCR引物、试剂盒以及采用含有巢式PCR引物的试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其步骤为：(1)提取待测水样DNA；(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SDF和SDR；(3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为NDF和NDR；(4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为158bp的条带，若存在，则表明水体受到了鸭粪污染。上述申请案的方法虽然能够对是否存在鸭粪污染进行较为准确的筛查，然而该方法应用范围较窄，无法应用于粪便污染较为复杂的溯源筛查。
中国专利申请号为201510305364.5，申请公布日为2015.08.19的申请案公开了一种同时 检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有针对于上述污染源设计的特异性引物：引物1～引物6，使用上述混合引物(6种)在同一个PCR体系进行扩增反应，使得PCR反应体系中区猪、狗、鸡三种粪便污染源成为可能，其检测方法如下：提取待测水样DNA，以其为DNA为模板，利用试剂盒中提供的引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg
2+溶液和ddH
20进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察，若出现390bp、490bp、和783bp的条带，则分别对应指示水中存在狗、猪、鸡粪便污染。该试剂盒可准确检测到水中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染。该申请案的方法虽然能够同时检测三种粪便污染，然而检测范围仍较为有限，对应污染源众多的水体污染无法进行高通量的检测，此外也无法相对定量的区分不同污染源的污染程度大小，限制其在水体粪便领域的检测。
基于水体粪便污染的潜在污染源种类多、识别难等问题，亟需发明一种高通量粪便污染溯源方法。
发明内容
1.要解决的问题
针对水体粪便污染的潜在污染源种类多、识别难等问题，本发明设计了能够扩增多物种种属特异性线粒体DNA片段的巢式PCR通用引物，并提供了一种结合巢氏PCR和高通量测序技术的高通量粪便(人类、畜禽类、野生鸟类和哺乳动物等)污染溯源方法，可以达到快速、准确排查和检测水体粪便污染源的目的。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种水体粪便污染检测的引物，所述引物为巢式PCR扩增序列，所述序列分别为：
AF(5’-3’):ACTGGGATTAGATACCCCACTATG；
AR(5’-3’):ACCAGCTATCACCMRGCTC；
BF(5’-3’):CCCACTATGCYTRGCCCTAAA；
BR(5’-3’):GTAYRCTTACCWTGTTACGACTT。
本发明还提供了一种水体粪便污染检测的试剂盒，包含所述的水体粪便污染检测的引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg
2+溶液和dd H
2O。
作为本发明更进一步的改进，所述PCR buffer为10×PCR buffer，所述dNTP浓度为各2.5mM，所述Taq酶浓度为5U/μL，所述Mg
2+溶液浓度为25mmol/L。
作为本发明更进一步的改进，本发明还提供了一种高通量检测水体粪便污染源的方法， 其步骤为：
(1)取待测水样，过0.22μm孔径混合纤维素酯膜后，收集滤膜，提取其表面截留物中的DNA。
(2)分别用引物AF、AR和BF、BR对水样DNA进行巢式PCR扩增。两对引物的序列如下：
AF(5’-3’):ACTGGGATTAGATACCCCACTATG；
AR(5’-3’):ACCAGCTATCACCMRGCTC；
BF(5’-3’):CCCACTATGCYTRGCCCTAAA；
BR(5’-3’):GTAYRCTTACCWTGTTACGACTT；
先用AF、AR进行第一轮PCR，以水样DNA为模板，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃30s，59℃60s，72℃45s，35个循环；72℃7min，4℃保存。再用BF、BR进行第二轮扩增，模板为第一轮PCR产物，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃30s，57℃40s，72℃45s，35个循环；72℃7min，4℃保存。
(3)将巢式PCR产物切胶回收纯化后进行高通量测序，测序结果以.fastq格式返回，去除长度短的序列，并转换成.fasta格式。
(4)构建各物种线粒体DNA数据库，将步骤(3)中得到序列与线粒体DNA数据库进行BLAST比对，以BLAST返回的物种作为潜在粪便污染源，当返回的物种数大于等于2时，各物种注释上的序列数占总序列的比例与各来源粪便污染程度呈正相关。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(3)中切取500bp处的产物进行纯化，高通量测序后去除长度小于450bp的序列。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(4)中线粒体DNA数据库为线粒体12S rRNA基因库，BLAST注释阈值为0.8。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的水体粪便污染检测的引物，可同时扩增包括人类、畜禽类、野生鸟类和哺乳动物多种物种的线粒体基因，不仅具有广谱性，同时该引物扩增的DNA序列中又包含各物种的种属特异性片段，可以通过序列比对进行物种识别，结合高通量测序技术，能够实现多物种粪便(如人、猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、猫、鼠、鹩哥)污染的高通量溯源。
(2)本发明的水体粪便污染检测的引物，对不同物种均具有良好的适用性，用于巢氏PCR扩增使第一轮和第二轮得到的产物长度均适中，与高通量测序技术结合，可同时对多种潜在粪便污染源进行定性筛查，对于粪便污染情况较复杂的水体，可达到尽快识别粪便污染源的 目的，节约时间和成本。
(3)本发明的水体粪便污染检测高通量溯源方法，利用线粒体DNA作为粪便污染源的标记物，较传统的化学和微生物标记物具有更高的源特异性，可有效减少假阳性结果的产生，用于水体粪便污染溯源具有极高的灵敏度，可检测水中的微量粪便污染。
(4)本发明的水体粪便污染检测高通量溯源方法，设计可以同时扩增多种物种线粒体基因的通用引物，同时构建线粒体DNA数据库进行比对识别，结合高通量测序，不仅能够同时对多种潜在粪便污染进行定性溯源，还能对各类粪便污染的程度进行相对定量筛查，从而确定主要污染源。
图1为本发明水体粪便污染高通量溯源方法示意图；
图2为本发明设计的通用引物对含有不同来源粪便污染水样DNA的PCR扩增图，(A)通用引物AF和AR的PCR扩增图；(B)通用引物BF和BR的PCR扩增图；
图3为高通量测序数据的序列信息图。
本发明中所使用的术语，除另行说明外，均为本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照附图，对本发明进行进一步详细描述。需注意，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本发明能够同时检测包括人类、畜禽类、野生鸟类和哺乳动物等来源的粪便污染，步骤如图1所示。本实施例选取了人、猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、猫、鼠、鹩哥为代表，在实验室模拟各物种粪便污染水样，用以验证本发明中通用引物的适用性。
采集上述物种的新鲜粪便，取少量分别加入未受粪便污染的河水中，取含粪便河水各1L，分别用0.22μm孔径混合纤维素酯膜过滤后，利用FastDNA SPIN Kit for Soil(Takara)试剂盒提取滤膜上的DNA，并以此为模板DNA，进行巢氏PCR扩增，PCR仪器为ABI Veriti96仪。图2为本发明设计的通用引物对含有不同来源粪便污染水样DNA的PCR扩增图。首先进行两轮RCR扩增。
第一轮PCR的引物序列为：AF(5’-3’):ACTGGGATTAGATACCCCACTATG，AR(5’-3’):ACCAGCTATCACCMRGCTC；PCR反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer；2.5μLdNTP；0.1μLTaq酶；2μL Mg
2+；0.5μLAF引物，0.5μL AR引物，2μL模板DNA，灭菌水补足至25μL；PCR反应条件为95℃，预变性5min，95℃30s，59℃60s，72℃45s，35个循环，72℃7min，4℃保存。
对第一轮PCR产物进行1％凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图2A所示，各物种的粪便污染水样DNA均能被通用引物AF和AR扩增，且扩增片段长度一致(约950bp)。
再以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为BF(5’-3’):CCCACTATGCYTRGCCCTAAA，BR(5’-3’):GTAYRCTTACCWTGTTACGACTT；PCR反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer；2.5μLdNTP；0.1μLTaq酶；2μL Mg
2+；0.5μLBF引物，0.5μL BR引物，2μL模板DNA，灭菌水补足至25μL；PCR反应条件为：95℃，预变性5min，95℃30s，58℃40s，72℃45s，35个循环，72℃7min，4℃保存。
对第二轮PCR产物进行1％凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图2B所示，可以看出本发明设计的巢氏PCR通用引物能够对上述各物种的粪便污染水样DNA进行扩展，各物种巢氏PCR产物长度一致(约500bp)。
上述结果表明本发明设计的巢氏PCR引物对不同物种具有良好的适用性，且巢氏PCR产物长度适中，有利于使用目前主流的二代测序平台进行高通量测序。
实施例2
利用上述10个物种的粪便模拟多重粪便污染水体的检测。将10种粪便同时加入未受粪便污染的河水中，其中牛粪投加量最多，取1L河水，用0.22μm孔径混合纤维素酯膜过滤后，利用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP bio)试剂盒提取滤膜上的DNA，并以此为模板DNA，进行巢氏PCR扩增，方法同实施例1。将巢式PCR产物进行凝胶电泳，方法同实施例1，切取500bp处的PCR产物，利用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extration Kit(Takara)试剂盒纯化后，采用IlluminaMiseq测序平台进行高通量测序，读长模式为双末端各300bp，将得到的.fastq格式的测序数据首先用prinseq-lite软件进行质量控制，保证每个碱基质量值均大于30，转换数据格式为.fasta，然后用mothur软件去除长度小于450bp的序列，得到36760条有效序列，序列信息如图3所示。
为了验证测序结果的准确性，我们构建了一个简易线粒体DNA数据库，其中包含了20个物种(表1)的线粒体12S rRNA基因，利用本地BLAST将测序数据与该简易数据库进行比对注释，BLAST注释阈值设为0.8。
简易线粒体DNA数据库物种信息和注释上的序列条数结果如表1所示，共有36160条序列成功注释，注释上的物种为人、猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、猫、鼠、鹩哥，与水样中所含粪便的物种来源完全一致，而其它物种无一被注释上，表明本发明方法具有良好的准确度和特异性。此外，在所有被注释的序列中，来源于牛的序列数最多，指示牛粪污染相对最严重，与实际情况相符，表明本发明方法能够在复杂粪便污染环境中识别主要污染源。
以BLAST返回的物种作为潜在粪便污染源，当返回的物种数大于等于2时，各物种注释上的序列数占总序列的比例与各来源粪便污染程度呈正相关。
表1简易线粒体DNA数据库物种信息和注释上的序列条数
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
- 一种水体粪便污染检测的引物，其特征在于：所述引物为巢式PCR扩增序列，所述序列分别为：AF(5’-3’):ACTGGGATTAGATACCCCACTATG；AR(5’-3’):ACCAGCTATCACCMRGCTC；BF(5’-3’):CCCACTATGCYTRGCCCTAAA；BR(5’-3’):GTAYRCTTACCWTGTTACGACTT。
- 一种水体粪便污染检测的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的水体粪便污染检测的引物、dNTP、PCRbuffer、Taq酶、Mg 2+溶液和dd H 2O。
- 根据权利要求2所述的水体粪便污染检测的试剂盒，其特征在于：所述PCRbuffer为10×PCR buffer，所述dNTP浓度为各2.5mM，所述Taq酶浓度为5U/μL，所述Mg 2+溶液浓度为25mmol/L。
- 一种水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述方法具体步骤为：(a)样品处理：取待测水样，针对水样中的DNA进行提取；(b)巢式PCR扩增：利用权利要求1所述的水体粪便污染检测的引物或权利要求2～3所述的水体粪便污染检测的试剂盒针对步骤(a)中提取的DNA进行巢式PCR扩增，得到巢式PCR产物；(c)高通量测序：将巢式PCR产物切胶回收纯化后进行高通量测序，测序结果以.fastq格式输出，过滤测序长度短的序列；(d)污染源解析：将步骤(c)中得到序列与线粒体DNA数据库进行BLAST比对，依据BLAST注释信息进行污染源解析。
- 根据权利要求4所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(b)中的巢式PCR过程为：先用AF、AR进行第一轮PCR扩增，模板为水样DNA，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃ 30s，59℃60s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 7min，4℃保存；再用BF、BR进行第二轮PCR扩增，模板为第一轮PCR产物，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃ 30s，58℃40s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 7min，4℃保存。
- 根据权利要求5所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(c)中切取500bp处的产物进行纯化，高通量测序后过滤掉长度小于450bp的序列。
- 根据权利要求6所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(d)中的线粒体DNA数据库为线粒体12S rRNA基因库。
- 根据权利要求7所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述BLAST注释阈值为0.8。
- 根据权利要求8所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(d)中以BLAST返回的物种作为潜在粪便污染源，当返回的物种数大于等于2时，各物种注释上的序列数占总序列的比例与各来源粪便污染程度呈正相关。
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