CN110499369B - 用于选择母鸡储精能力的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于选择母鸡储精能力的SNP分子标记及其应用，通过全基因组关联分析（GWAS）和限制性内切酶长度多态性（PCR‑RFLP）技术方法，在母鸡基因组上筛选到2个与母鸡储精能力相关联的SNP分子标记，位于12号染色体。该SNP位点的多态性与母鸡的储精能力DN（授精一次至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数）和FN（授精一次后母鸡所产受精蛋的个数）均显著关联，所述的2个SNP分子标记单独使用，用于选择和改良母鸡的储精能力。

Description

用于选择母鸡储精能力的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于家畜繁殖性状的分子标记选择技术领域，具体涉及2个与母鸡储精能力相关的SNPs分子标记及其应用。
背景技术
母鸡的储精能力是指母鸡在自然交配或者人工授精(Artificial insemination，AI)之后能够储存精子并持续产受精蛋的能力(Duration of fertility)。在许多品种或品系的群体中，研究者发现母鸡的储精能力均会存在明显的个体差异，反映为一次自然交配或者人工授精后母鸡产受精蛋个数(FN，The number of fertile eggs after AI)或持续天数(DN，The days post-insemination until the last fertile egg)的差异。在家禽育种和种蛋生产过程中，母鸡的储精能力长短是决定进行人工授精频率的关键因素，如火鸡的储精性状长达一至两个月，因此在火鸡种蛋的生产过程中，对其人工授精只需要一个月进行一次，甚至对于即将要开产的火鸡，可提前半个月进行人工授精来提高种蛋的获得(Bakst,2010)。而白来航(White leghorn)和京红母鸡(JingHong brown layers)的储精性状一般只有两周左右，麻鸭(Anas platyrhyncha domestica)的储精性状也只有13天左右(Lake and Stewart,1978；Blackburn et al.,2009；Liu et al.,2015)，生产上为了保证90％以上的种蛋受精率，对它们进行人工授精一般需要一周进行一次。在目前大规模集约生产中人工授精技术被普遍采用的情况下，选择储精能力长的母鸡，对母鸡储精性状进行改良，能够有效地降低种蛋生产过程中人工授精的频率，进而减少种公鸡的饲养量，从而减少饲养成本，同时减少母鸡对人工授精产生的应激反应，增加生产效益。利用全基因组关联分析(GWAS)检测与性状相关联的SNPs及基因组区域，可大大提高工作效率和统计效力。本研究是利用鸡全基因组SNP芯片(600K，Affymetrix)对鸡储精能力进行全基因组关联分析，在全基因组范围内检测与母鸡储精性状相关联SNPs及基因组区域的报道。该项研究工作在国家基金资助下完成，项目编号：31372301，2015BBA179，项目名称：鸡贮精能力差异相关新基因的筛选及其分子机制初探。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于选择母鸡储精能力的SNP分子标记及其应用，通过全基因组关联分析首次在母鸡12号染色体上筛选到2个与储精能力相关联的SNP分子标记。
本发明通过以下技术方案实现：
用于选择母鸡储精能力的SNP分子标记，位于12号染色体，所述分子标记有2个，单独使用，核苷酸序列如下所示：
分子标记1的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下所示：
ACAGCTCTGGCTTAATCTGCCTGGCRTAAAATAATAGAACTAAATATGATA
上述序列第26位碱基R是C或T，导致多态性；
分子标记2的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)如下所示：
CAGCAAAACCCGGCTGTAATTTGTTRGAGGTCTTCTTGGAAATGGTATCAG
上述序列第26位碱基R是C或G，导致多态性。
通过PCR-RFLP分析，上述分子标记1的多态性位点的基因型包括CC、TT、CT，SNP位点AX-75726307多态性与鸡储精能力FN和DN都呈显著相关(P<0.05)，TT基因型的母鸡授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数显著多于CC基因型的母鸡(P<0.05)，同时TT基因型的母鸡授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数显著多于CC与CT基因型的母鸡(P<0.05)，因此TT基因型是母鸡储精能力的有利标记。
分子标记2的多态性位点的基因型包括CC基因型，GG基因型和CG，SNP位点AX-80768537多态性与鸡储精能力FN和DN都呈极显著相关(P<0.001)，CG基因型的母鸡授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数显著多于CC型及GG基因型的母鸡(p<0.001)，同时CG基因型的母鸡授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数显著多于CC型及GG基因型的母鸡(p<0.001)，因此CG基因型是母鸡储精能力的有利标记。
上述SNP分子标记通过下述方法筛选获得：
1)实验样品采集：采集试验鸡血样用于DNA提取；人工授精后收集试验鸡产蛋用于测定母鸡储精能力性状；
2)母鸡储精能力的测定：测量试验鸡一次人工授精后母鸡产受精蛋个数(FN)和持续天数(DN)，重复测量三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精能力；
3)鸡基因组DNA的提取与检测：从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，制备母鸡全基因组DNA样品；
4)基因型判定及基因型与鸡储精能力的关联分析：将试验鸡血样中提取的基因组DNA在与鸡600K高密度SNP芯片(Affymetrix Axiom)杂交，然后采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，利用TASSEL统计分析软件将试验储精能力与基因型进行关联分析，从中选取达到全基因组的基因组水平显著的SNP。
所述的2个SNP分子标记的多态性与母鸡储精能力DN(授精一次至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数)和FN(授精一次后母鸡所产受精蛋的个数)显著关联(P<0.05)，可以单独使用于母鸡储精性状的选择及改良。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明运用全基因组关联分析(GWAS,Genome wide association study)技术方法在母鸡全基因组范围内筛选得到与鸡储精能力(Duration of fertility)相关的SNPs分子标记，进一步采用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment lengthpolymorphism)分析方法在扩大的群体里对这两个SNP与鸡储精能力(Duration offertility)的相关性进行了验证。利用分子标记辅助育种，为母鸡储精能力进行选择和改良提供了2个新的SNP分子标记。
具体实施方式
实施例1与母鸡储精能力相关的SNP分子标记的筛选
1)实验样品：
试验群体为701只健康母鸡，来源于“京红1号”蛋鸡核心育种鸡场，父母代群体(200日龄)，所有母鸡同批次孵化而来。饲养于武汉峪口禽业有限公司，执行单笼饲养，14小时光照制度，自由采食及饮水。在饲养期间，温度、湿度、通风、光照等条件均相同，为常规方法。
2)鸡储精能力的测定：
以20天为一个周期，对公鸡一次采精，精液中要求无粪便、羽屑、血液污染，否则一律废弃。利用混合精液对母鸡进行输精(20微升/只)，输精时避免输精器械的刺激，同时为避免发生输精感染，做到每输精一次后，更换一次输精器头。具体操作按照《鸡人工授精技术规程》(DB12/T290—2006)执行。收集种蛋并标记笼号。同批次种蛋恒温孵化(37.8℃，相对湿度50％)7天后照蛋，记录受精与未受精的种蛋。
测量试验鸡一次人工授精后母鸡产受精蛋个数(FN，The number of fertileeggs after AI)和持续天数(DN，The days post-insemination until the last fertileegg)，重复测量FN和DN三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精能力。
母鸡储精性状测定实验结束后，对试验鸡群翅下静脉采血0.5mL，置于1.5mL事先加入0.3mL抗凝剂的EP管中，混匀后-20℃保存以备DNA提取。
3)鸡基因组DNA的提取与检测：
采用苯酚-氯仿法从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，再用凝胶电泳判断DNA的完整性；对提取后的DNA进行质量检测；调整浓度至50ng/μL，制备母鸡全基因组DNA样品。
4)基因型判定及基因型数据与鸡储精能力的关联分析：
根据前一部分中701只母鸡群体的储精能力，筛选储精能力长和短的母鸡各60只，将他们提取的基因组DNA与鸡600K高密度SNP芯片(Affymetrix Axiom)杂交。在全基因组范围内成功检测到552395个SNPs位点的基因型信息，通过质量控制(剔除检出率(Call rate)小于90％的SNPs；剔除最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)小于5％的SNPs)，最后剩下的SNPs数目为341176个。申请人利用TASSEL统计分析软件将试验鸡群的储精能力与基因型数据进行关联分析，关联分析模型为混合线性模型：
Y＝S+K+e
其中Y表示表型值；S表示基因型效应；K表示亲缘关系矩阵，作为模型的随机效应；e为残差效应。
当某个SNP符合P<4.18E-06条件时，我们就认为这个SNP达到了全基因组的基因组水平显著。
5)分析结果
关联分析发现2个与母鸡储精性状显著关联的SNP(AX-75726307和AX-80768537，P<4.18E-06)，见表1。
表1与母鸡储精能力显著关联的SNP位点
Figure GDA0002896926340000041
Figure GDA0002896926340000051
*P<4.18E-06；
实施例2验证筛选的SNP分子标记的有效性
为了验证对全基因组关联分析结果的可靠性，我们利用已测定储精能力的近800只母鸡群体，对全基因组关联分析中与储精性状显著关联的2个SNP(AX-80768537和AX-75726307)进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，比较不同基因型个体的储精能力DN和FN，结果见表2。结果显示这2个SNP位点的多态性均与储精能力DN和FN显著关联(P<0.05)。
表2 2个SNP位点与母鸡储精能力关联分析结果
Figure GDA0002896926340000052
注：DN＝授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数)；FN＝授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数；同一性状中具有不同肩标的SNP基因型之间表示差异显著(P<0.05)。*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著P<0.01；表中性状值为平均数±标准差。
通过PCR-RFLP分析，得到744只母鸡SNP位点AX-80768537的基因型信息，其中CC基因型有343个，GG基因型有30个，CG基因型有371个。SNP位点AX-80768537多态性与鸡储精能力FN和DN都呈极显著相关(P<0.001)，CG基因型的母鸡授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数显著多于CC型及GG基因型的母鸡(p<0.001)。同时CG基因型的母鸡授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数显著多于CC型及GG基因型的母鸡(p<0.001)，因此CG基因型是母鸡储精能力的有利标记。
通过PCR-RFLP分析，得到751只母鸡SNP位点AX-75726307的基因型信息，其中CC基因型有364个，TT基因型有28个，CT基因型有359个。SNP位点AX-75726307多态性与鸡储精能力FN和DN都呈显著相关(P<0.05)，TT基因型的母鸡授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数显著多于CC基因型的母鸡(P<0.05)。同时，TT基因型的母鸡授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数显著多于CC与CT基因型的母鸡(P<0.05)，因此TT基因型是母鸡储精能力的有利标记。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 用于选择母鸡储精能力的SNP分子标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagctctgg cttaatctgc ctggcrtaaa ataatagaac taaatatgat a 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcaaaacc cggctgtaat ttgttrgagg tcttcttgga aatggtatca g 51

Claims (1)

1.SNP分子标记在选择京红1号母鸡储精能力方面的应用，其特征在于：
SNP分子标记1的核苷酸序列为ACAGCTCTGGCTTAATCTGCCTGGCRTAAAATAATAGAACTAAATATGATA，上述序列第26位碱基R是C或T，导致多态性，该位点的基因型包括CC、TT、CT，TT基因型是母鸡储精能力的有利标记；
SNP分子标记2的核苷酸序列为CAGCAAAACCCGGCTGTAATTTGTTRGAGGTCTTCTTGGAAATGGTATCAG，上述序列第26位碱基R是C或G，导致多态性，该位点的基因型包括CC、GG、CG，CG基因型是母鸡储精能力的有利标记；
所述的储精能力为授精一次至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数和授精一次后母鸡所产受精蛋的个数。
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