CN111593048B - 引物组合、试剂盒、扩增方法、a19疫苗检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测技术领域，公开了一种引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO.4。所述试剂盒包含有：2×Taq PCR MasterMix，10μM引物组混合液，无菌双蒸水，阳性对照品布鲁氏菌2308株DNA，阴性对照品无菌双蒸水。本发明提供的引物组及PCR试剂盒可鉴别区分自然感染的布病阳性牛和A19疫苗免疫牛。与传统的病原生化鉴定方法相比，本发明提供的试剂盒操作简便、高效特异、生物安全性高、检测结果分析易于标准化，能解决目前牛布病防控中的实际生产问题。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用，具体涉及一种引物组合、试剂盒、扩增方法、鉴别区分A19疫苗与自然感染病原检测中的应用。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，简称“布病”。该病主要发生于牛、山羊、绵羊、骆驼、猪、鹿和犬等家畜和野生动物。动物发病的明显临床症状是公畜睾丸炎和附睾炎，母畜流产、死胎和不孕，可造成畜牧业重大损失。带菌的感染动物及其污染的产品或环境是人感染布病的主要传染源。我国自2000年以来，布病流行率呈逐年上升趋势，致使肉、奶等产品存在严重的安全隐患，不仅影响牛羊等动物产品的对外贸易，也对我国公共卫生安全造成了极大的隐患。
鉴于我国布病流行地区牛羊饲养密度相对高，动物基数大、阳性动物比例高的现状，布病流行区采取以疫苗接种为主、检疫-扑杀为辅的防控策略。在实际生产中，我国牛接种的布病疫苗主要是A19疫苗，其基因分型属于牛种生物1型。该疫苗为弱毒活疫苗，已在我国生产应用约50余年，为控制牛布病提供了重要保障。但同时也存在关键技术缺陷，影响其广泛使用。首先是A19疫苗活菌在动物体内残存时间较长，泌乳牛排菌期长、公牛生殖系统受损害的风险较高，食品公共安全隐患较大；其次是缺乏鉴别诊断标记，常规的布病血清学检测方法无法区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体，造成疫苗接种牛与布病自然患病牛无法甄别，法定检疫措施严重受阻，病原扩散蔓延造成的疫情状态难以消除，使布病防控耗时费力且控制困难重重。
近十年家畜布病流行病学研究数据表明，我国牛布病主要以羊种和牛种3型布鲁氏菌为优势菌种型的流行病学特征，目前牛布病防控的A19疫苗属于牛种1型。鉴于以上牛布病布鲁氏菌的流行病学特征，经典的布鲁氏菌分类鉴定采取的主要方法是从菌株的形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。但该鉴定方法耗时、判读结果繁琐、实验过程均以活菌为实验材料，存在实验室生物安全隐患。PCR方法以其敏感、特异、安全等优点被广泛应用于布鲁氏菌的鉴定，AMOS-PCR法可鉴别区分布鲁氏菌部分种型，但无法鉴别区分A19疫苗及其他牛种生物亚型的布鲁氏菌。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)A19疫苗为弱毒活疫苗，常规的布病血清学检测方法无法区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体，造成疫苗接种牛与布病自然患病牛无法甄别，法定检疫措施严重受阻，从而引起布病防控中无法控制和监督动物移动。
(2)经典的布鲁氏菌分类鉴定采取的主要方法是从病料中分离培养并获得纯化的布鲁氏菌(时间周期为7d)，该实验过程中布鲁氏菌分离率低，且常规生化鉴定方法耗时(时间周期为3d)、判读结果繁琐、实验过程均以活菌为实验材料，实验过程中菌量浓度较大，存在实验室生物安全隐患，必须在生物安全三级实验室完成。
解决以上问题及缺陷的难度为：布病是一种人畜共患病，患病动物或污染的畜产品是人感染布病的主要传染源，因此保障检测和操作人员的生物公共安全尤为重要。第一，本发明中应用的一步PCR方法操作简便，在1d内可获得检测结果，且操作人员生物安全有保障。第二，本发明中待检样品(乳、分泌物、流产物、精液等)采集也简单易得，范围广，成本低。第三，本发明中的所用引物组(4条引物)同时在一个PCR反应体系内使用互不干扰，检测结果中出现的片段大小差异明显，即使混合感染的检测结果也非常容易分辨，且检测结果分析易于标准化，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定，为布病防控中传染源的清除、动物移动的控制和监管提供了技术支撑。
解决以上问题及缺陷的意义为：按照国家规定的血清学方法检测出的布病阳性牛需进行无害化处理(扑杀掩埋)，但A19疫苗免疫后可能长期持续存在免疫抗体的牛约占10％，这些牛在每年国家布病强制的“一年两检”中呈布病阳性，但又无法与布病自然感染阳性牛进行鉴别区分。为了避免对检出布病的阳性牛造成错杀和漏杀而带来的经济损失，本发明基于我国牛布病的流行病学特征，取血清学检测为布病阳性牛的乳样或分泌物，提取其基因组DNA为样本，应用本发明的试剂盒进行检测，确诊并判定布病自然感染阳性牛与免疫牛。该鉴定方法简单、快速、成本低、操作安全，不仅能及时清除牛群中的传染源，同时也为动物移动的控制和监管提供了科学技术依据，为我国布病防控提供了强有力的技术支撑。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种引物组合、试剂盒、扩增方法、鉴别区分A19疫苗与自然感染病原检测中的应用。
本发明是这样实现的，一种引物组合，核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO3：、SEQ ID NO：4。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述引物的试剂盒，所述试剂盒包含有：2×Taq PCR MasterMix，10μM引物组混合液，无菌双蒸水，阳性对照品布鲁氏菌2308株DNA，阴性对照品无菌双蒸水。
本发明的另一目的在于提供一种基于所述引物组合组的扩增方法，所述扩增方法采用25μL反应体系，含有2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，10μM引物组混合液1μL，待检样品DNA模板2μL，无菌双蒸水补足至25μL。
进一步，所述扩增方法的PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火90s，72℃延伸90s，40个循环，72℃延伸10min。
本发明的另一目的在于提供一组所述引物在鉴定区分布病自然感染阳性牛与A19疫苗免疫牛的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。应用该引物组、优化PCR反应组分、集成并包装为用于检测区分自然感染布病阳性牛和A19疫苗免疫牛的试剂盒。本发明的引物组和试剂盒具有操作简便、高效特异、生物安全性高的优点，且检测结果分析易于标准化，以此来甄别自然感染的布病阳性牛与A19疫苗免疫牛，解决了目前布病防控中的实际生产问题。以此检测试剂盒应用一步PCR方法可甄别布病A19免疫牛和自然感染布病阳性牛。
经典的布鲁氏菌分类鉴定采取的主要方法是从菌株的形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。但该鉴定方法耗时、判读结果繁琐、实验过程均以活菌为实验材料，存在实验室生物安全隐患。PCR方法以其敏感、特异、安全等优点被广泛应用于布鲁氏菌的鉴定。AMOS-PCR法可鉴别区分布鲁氏菌部分种型，但无法鉴别区分A19疫苗及其他牛种生物亚型的布鲁氏菌。本发明提供的引物组及PCR试剂盒可鉴别区分自然感染的布病阳性牛和A19疫苗免疫牛。与传统的病原生化鉴定方法相比，本发明提供的试剂盒操作简便、高效特异、生物安全性高、检测结果分析易于标准化，能解决目前牛布病防控中的实际生产问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的引物的扩增方法流程图。
图2是本发明实施例提供的一步PCR鉴定布病牛病原的电泳检测图；
图中：M:DNAMarker DL2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：布鲁氏菌2308株DNA(CVCC788)；2：阴性对照(H2O)；3：A19疫苗株；4：牛布鲁氏菌生物3型；5：羊种布鲁氏菌。
图3是本发明实施例提供的临床布病阳性牛样品的病原DNA检测示意图；
图中：M：DNAMarker(2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；2：布鲁氏菌M5株DNA(天康)；3：布鲁氏菌2308株DNA(CVCC788)；4：牛布鲁氏菌生物3型；5-48：待检布病阳性牛DNA样品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一引物组合、试剂盒、扩增方法、鉴别区分A19疫苗免疫牛与布病自然感染牛检测中的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供的引物分别是A19疫苗株特异的上游引物F-A1、牛种布鲁氏菌生物3型特异的上游引物F-A3、羊种布鲁氏菌特异的上游引物F-M1和所有布鲁氏菌共有的插入序列片段为下游引物R-Br。
A19疫苗上游引物(F-A1)：5’-acgaacggaatttttccaatcc-3’。
牛种布鲁氏菌生物3型上游引物(F-A3)：5’-gcgcagcgttgcggc aattga-3’。
羊种布鲁氏菌上游引物(F-M1)：5’-aaatcgcgtccttgctggtctg-3’。
布鲁氏菌下游引物(R-Br)：5’-gccgatcacttaagggccttca-3’。
本发明提供的一组引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：1核苷酸序列为：
5’-acgaacggaatttttccaatcc-3’
SEQ ID NO：2核苷酸序列为：
5’-gcgcagcgttgcggcaattga-3’
SEQ ID NO：3核苷酸序列为：
5’-aaatcgcgtccttgctggtctg-3’
SEQ ID NO：4核苷酸序列为：
5’-gccgatcacttaagggccttca-3’
本发明的其他序列如下：
SEQ ID NO：5，A19疫苗PCR产物序列(CP030752.1)492bp acgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgat cggc
SEQ ID NO：6，牛种布鲁氏菌生物3型PCR产物序列(CP022880.1)1741bp gcgcagcgttgcggcaattgaaagttttgaccccgcaaccgggattctgcaagcgcaagcgggggtgctgctaagcgagatcatcggttttgttgcaccccacggttattttctgccggtcacgccgggcacccgttttgtgacgcttggcggcgccattgccaatgatgtgcatggcaagaaccaccatctgcgcggtacctttggttgtcagttggaaagtctggagcttctgcgctcggacggcgtgcaatatcattgctctctgcatgaaaatgaagggctttttgcggccaccatcggtggaatgggcctgacgggcgttgaaaaatccgcgcccggtatctggcccattttaatgcgttgtgtggcatcaagataaatataggtgtcccaatacataggcccgatggggacagcgagcggcatggcaagaaggcctgcaagaacaaccagtattaaacacagccagaacacaggtgatttaaaaatttcggcatagccgagcctgccagaaagaatgaagctgttcaaaatgtccccccactattgatgtcgccatcatacgcccgcttttggcggatgccttacgccccgattcgtatatagattttcattaattacggaaacatggatccgttctgtcaggctctggcatctgacgtcggtggcagcttgtaaagcttcgcgccgttttcatttccgttttcgtgataaccgatgatctggaaccaacggataatttccggccggtccagccagattcgtgaatgaatgggcatattgccggaaagcgcctgaatcttgcggatgtgcttcttgcagaagcgcaccgttttcgcgctgaaaaactcgtccttggccgcaaaaagcgtattggtggcgtcatcgctctcgcgccaggaaatgatggcaaccacgtcatcgccctgcaccagcgcatgggcgcggccttccttcatgttcatcatgaggtcgtcgtaggcaagttttgcatctttaccggcggtgatatattccgcgaccatccgtttcgacagatcacaaaataccgtctcaagatcgcctaccgttgcagaacgtgcgcgcatatgaacctcccggattctgtcatgactggcccttgtcagaggttagcgtcgatgacgacgaagtccagtcagagttaattgtcacctcattattgtgatgccaaaggcgtgaataggagaaaagggagcggattttttggcccttggtcagcgccacatttagctgattcaacacggcctgaaacagcatgttttaaaggcattgtgctgtagttgtagcgcaacaaagttgatagttgcgacacggaaatttaagggatagtgctgcgattggttaaagcgcgattgttgtattcggaatgcaacaaaatcgtcgataaaaccggaaaaacggcttttctgtctatgagacacgcgcagacacgcaataacaatcaagacacaagaatcttctagggcgtgtctgcattcaacgcaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatgcgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattggccttggatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggc
SEQ ID NO：7，羊种布鲁氏菌PCR产物序列(CP026005.1)731bp aaatcgcgtccttgctggtctgattaagtttttcaccaacagcttcgatatcgttataaatttcttcataaccccggatatgaatctgaaccagcttatttgtctgaacgtttactacctctccggtgcacacaagccgctcatattcaccgtctttgacgtaaatcgcggtcatgacacccaaacttagccatggtgcaccatcgactataagaagtttcttgtcgtgaatcgccttaacaagcggcacccctaaaaaatcaggagtgtttcggctcagaataatccacagaaggtagagcagtaatatccaatagacgccattaacaatagcgagattggaatagcttacccgccaatcttcgccctgccaccagccaataacggcaattatcgctgtcactgttgcaagtatggcagcgagcgctctagcgtgacgaagcactgtctttctgacaatttccagattcacccctagggcgtgtctgcattcaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaagcccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttgggacactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagattgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggc
本发明用于鉴定布病自然感染阳性牛与A19疫苗免疫牛的一步PCR试剂盒内含有：2×Taq PCRMasterMix，引物组混合液(10μM)，无菌双蒸水。
本发明的试剂盒内包含阳性对照品布鲁氏菌2308株DNA(CVCC788)，阴性对照品(无菌双蒸水)。
如图1所示，本发明提供的引物扩增方法包括以下步骤：
S101：采用25μL反应体系，含有2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，10μM引物组混合液1μL，待检样品DNA模板2μL，无菌双蒸水补足至25μL。
S102：PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火90s，72℃延伸90s，40个循环，72℃延伸10min。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
1、实验步骤：
PCR反应体系：采用25μL反应体系，含有2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，10μM引物组混合液1μL，待检样品DNA模板2μL，无菌双蒸水补足至25μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火90s，72℃延伸90s，40个循环，72℃延伸10min。
2、结果检测：PCR反应结束后取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测并在凝胶成像仪上观察结果。
3、结果判定：当DNAmarker分子质量标准、阳性对照和阴性对照同时成立时。根据检测结果出现的目的条带大小判定布鲁氏菌的种型，从而鉴定布病阳性牛与A19疫苗免疫牛。被检样品电泳道出现492bp大小的目的条带，判为A19疫苗免疫牛；被检样品电泳道如出现1741bp或731bp大小的目的条带时，判为布病阳性牛；其中出现1741bp大小的目的条带，判为布鲁氏菌牛种3型感染布病阳性牛；其中出现731bp大小的目的条带，判为羊种布鲁氏菌感染布病阳性牛(图2)。
本发明是建立在病原分子生物学基础上，基于我国布病阳性牛病原的流行病学特征，分别对A19疫苗、牛种布鲁氏菌生物3型、羊种布鲁氏菌设计特异性引物，建立一步PCR方法检测和区分这三种布鲁氏菌，以此来甄别牛群中A19免疫牛和自然感染的布病阳性牛。本发明中的引物组对于实际生产种存在的三种布鲁氏菌的鉴别具有特异性高的优点，检测方法简便，检测结果中出现的片段大小差异明显，即使混合感染的检测结果也非常容易分辨，且结果分析易于标准化，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定，为布病防控中传染源的清除提供了技术支撑。
本发明中的试剂盒主要应用设计的一组引物对被检样品进行PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳，根据电泳图中出现特异性条带判断被检样品感染病原的种型，以此鉴别疫苗免疫牛和自然感染布病阳性牛。本发明相关的操作过程包括按照国家标准GB/T18646-2018《动物布鲁氏菌病诊断技术血清学检测》确诊为布病阳性牛的牛乳、阴道分泌物或流产物中提取全基因组DNA，配制含4条引物和全基因组DNA模板的PCR反应体系，本试剂盒内的引物组同时在一个PCR反应体系内使用互不干扰，表明该方法和试剂盒具有较好的稳定性和特异性。
4、临床样品检测试剂盒的应用：
选择新疆畜牧科学院兽医研究所细菌实验室保存的44份布病阳性牛DNA样本对该方法进行检测、验证。样本为牛乳26份，流产物7份，精液5份，阴道分泌物6份，在70℃下30分钟灭活细菌，采用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA于-20℃冰箱保存备用。取待检样品DNA2μL作为模板，PCR反应过程、反应体系(除模板DNA不同外，其它均相同)均与以上实验步骤相同。具体实验结果如图3所示。
图3实验结果表明该检测试剂盒均能检出44例临床阳性样本，检出A19免疫牛5份(如20，26，33，41，45号样本)；自然感染阳性布病牛39份，其中牛种3型布鲁氏菌感染布病阳性牛6份，羊种布鲁氏菌感染布病阳性牛33份。同时对于免疫后的牛感染了布病的情况也能准确判定，如图中样品7，3，17，48号所示。实验结果显示该试剂盒扩增效果优异，条带清晰且易于结果判定。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）
<120> 引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgaacggaa tttttccaat cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcagcgtt gcggcaattg a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaatcgcgtc cttgctggtc tg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgatcact taagggcctt ca 22
<210> 5
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgaacggaa tttttccaat cccatcgttt ccgtttcact tggcctgccg gcaacgtttc 60
agtttggcgg aatgaaacgg acggacccga tcaccaaata tatcctgcac catggcgacg 120
tggttgtctg gggcgggccg tcgcggcttt tctatcacgg tattctacca ttgaagtctg 180
gcgagcatga gcggctgggg ccgtttcggc ttaatctgac cttccgaaag gcgttctagg 240
gcgtgtctgc atttaacgta accagatcat agcgcatgcg agatggacga aacccatgaa 300
tgcggtcaat gttttctcgc atcgcagcgc aatacgacga tagcgtttca acttgttaaa 360
aaagcattca atctgatggc gttccttgta cagcctccag tcgattgttg gggcactgga 420
acgtgttgga ttgaccttga tctgagccgt tgccttgaga tcgctggcaa tgaaggccct 480
taagtgatcg gc 492
<210> 6
<211> 1741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcagcgtt gcggcaattg aaagttttga ccccgcaacc gggattctgc aagcgcaagc 60
gggggtgctg ctaagcgaga tcatcggttt tgttgcaccc cacggttatt ttctgccggt 120
cacgccgggc acccgttttg tgacgcttgg cggcgccatt gccaatgatg tgcatggcaa 180
gaaccaccat ctgcgcggta cctttggttg tcagttggaa agtctggagc ttctgcgctc 240
ggacggcgtg caatatcatt gctctctgca tgaaaatgaa gggctttttg cggccaccat 300
cggtggaatg ggcctgacgg gcgttgaaaa atccgcgccc ggtatctggc ccattttaat 360
gcgttgtgtg gcatcaagat aaatataggt gtcccaatac ataggcccga tggggacagc 420
gagcggcatg gcaagaaggc ctgcaagaac aaccagtatt aaacacagcc agaacacagg 480
tgatttaaaa atttcggcat agccgagcct gccagaaaga atgaagctgt tcaaaatgtc 540
cccccactat tgatgtcgcc atcatacgcc cgcttttggc ggatgcctta cgccccgatt 600
cgtatataga ttttcattaa ttacggaaac atggatccgt tctgtcaggc tctggcatct 660
gacgtcggtg gcagcttgta aagcttcgcg ccgttttcat ttccgttttc gtgataaccg 720
atgatctgga accaacggat aatttccggc cggtccagcc agattcgtga atgaatgggc 780
atattgccgg aaagcgcctg aatcttgcgg atgtgcttct tgcagaagcg caccgttttc 840
gcgctgaaaa actcgtcctt ggccgcaaaa agcgtattgg tggcgtcatc gctctcgcgc 900
caggaaatga tggcaaccac gtcatcgccc tgcaccagcg catgggcgcg gccttccttc 960
atgttcatca tgaggtcgtc gtaggcaagt tttgcatctt taccggcggt gatatattcc 1020
gcgaccatcc gtttcgacag atcacaaaat accgtctcaa gatcgcctac cgttgcagaa 1080
cgtgcgcgca tatgaacctc ccggattctg tcatgactgg cccttgtcag aggttagcgt 1140
cgatgacgac gaagtccagt cagagttaat tgtcacctca ttattgtgat gccaaaggcg 1200
tgaataggag aaaagggagc ggattttttg gcccttggtc agcgccacat ttagctgatt 1260
caacacggcc tgaaacagca tgttttaaag gcattgtgct gtagttgtag cgcaacaaag 1320
ttgatagttg cgacacggaa atttaaggga tagtgctgcg attggttaaa gcgcgattgt 1380
tgtattcgga atgcaacaaa atcgtcgata aaaccggaaa aacggctttt ctgtctatga 1440
gacacgcgca gacacgcaat aacaatcaag acacaagaat cttctagggc gtgtctgcat 1500
tcaacgcaac cagatcatag cgcatgcgag atggacgaaa cccatgaatg cggtcaatgt 1560
tttctcgcat cgcagcgcaa tgcgacgata gcgtttcaac ttgttaaaaa agcattcaat 1620
ctgatggcgt tccttgtaca gcctccagtc gattgttggg gcactggaac gtgttggatt 1680
ggccttggat ctgagccgtt gccttgagat cgctggcaat gaaggccctt aagtgatcgg 1740
c 1741
<210> 7
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaatcgcgtc cttgctggtc tgattaagtt tttcaccaac agcttcgata tcgttataaa 60
tttcttcata accccggata tgaatctgaa ccagcttatt tgtctgaacg tttactacct 120
ctccggtgca cacaagccgc tcatattcac cgtctttgac gtaaatcgcg gtcatgacac 180
ccaaacttag ccatggtgca ccatcgacta taagaagttt cttgtcgtga atcgccttaa 240
caagcggcac ccctaaaaaa tcaggagtgt ttcggctcag aataatccac agaaggtaga 300
gcagtaatat ccaatagacg ccattaacaa tagcgagatt ggaatagctt acccgccaat 360
cttcgccctg ccaccagcca ataacggcaa ttatcgctgt cactgttgca agtatggcag 420
cgagcgctct agcgtgacga agcactgtct ttctgacaat ttccagattc acccctaggg 480
cgtgtctgca ttcaacgtaa ccagatcata gcgcatgcga gatggacgaa gcccatgaat 540
gcggtcaatg ttttctcgca tcgcagcgca atacgacgat agcgtttcaa cttgttaaaa 600
aagcattcaa tctgatggcg ttccttgtac agcctccagt cgattgttgg gacactggaa 660
cgtgttggat tgaccttgat ctgagccgtt gccttgagat tgctggcaat gaaggccctt 720
aagtgatcgg c 731
Claims (1)
1.一种用于鉴别区分自然感染的布病阳性牛和A19疫苗免疫牛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：2×Taq PCR MasterMix，引物组混合液10μM，无菌双蒸水，阳性对照品布鲁氏菌2308株DNA，阴性对照品无菌双蒸水；
所述引物组混合液包括如SEQ ID NO：1所示的A19疫苗株特异的上游引物、如SEQ IDNO：2所示的牛种布鲁氏菌生物3型特异的上游引物、如SEQ ID NO：3所示的羊种布鲁氏菌特异的上游引物和如SEQ ID NO：4所示的所有布鲁氏菌共有的插入序列片段的下游引物； 其中，A19疫苗的PCR产物序列如SEQ ID NO：5所示，牛种布鲁氏菌生物3型的PCR产物序列如SEQ ID NO：6所示，羊种布鲁氏菌的PCR产物序列如SEQ ID NO：7所示。
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