CN109943648A

CN109943648A - 用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合及实时荧光pcr检测方法

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Publication number: CN109943648A
Application number: CN201910379723.XA
Authority: CN
Inventors: 刘立兵; 王建昌; 郭春海; 娄巧哲; 孙晓霞; 王金凤
Original assignee: Hebei Institute Of Inspection And Quarantine Science And Technology; Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Shijiazhuang Customs Technology Center
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-05-08
Also published as: CN109943648B

Abstract

本发明涉及肉制品检测技术领域，具体公开一种于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合，其序列分别如SEQ ID NO:1～3所示。本发明还公开了利用所述引物和探针通过TaqMan Real‑time PCR法检测肉制品中鹿源性成分的方法，提取样品的DNA，在含有上述引物和探针的反应体系中进行扩增，鹿源性成分具有典型的扩增曲线。本发明的引物和探针在Real‑time PCR反应体系中能够特异性地检测鹿源性成分，其他物种均不产生干扰，并且灵敏度高，能检测线为0.01％，不同浓度DNA对数值与Ct值呈良好的线性关系，能够准确对样品中鹿源性成分进行定量检测。

Description

用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合及实时荧光 PCR检测方法

技术领域

本发明涉及肉制品检测技术领域，具体涉及一种用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合，以及采用该引物和探针组合进行TaqMan Real-timePCR检测的方法。

背景技术

鹿在我国是比较重要的经济动物，具有较高的药用、观赏和食用价值。鹿肉含有较丰富的蛋白质、脂肪、无机盐、糖和一定量的维生素，且易于被人体消化吸收，其营养价值比牛、羊、猪肉的都高许多。除了营养丰富，鹿肉的风味也不同于其他肉类。另外，鹿肉还具有低脂肪、低胆固醇、高蛋白的特点，鹿肉具有养血生肌之功效，是冬季进补，御寒之佳品。鹿肉不仅在国内市场，在国外市场上也是供不应求的。鹿肉肉质比较细嫩、味道鲜美、瘦肉比较多、结缔组织很少，具有很好的咀嚼性和适口性，不仅可直接食用，还可做成加工食品以及用在医疗保健等方面。鹿肉的营养特点决定其不但可以为人体提供丰富的营养，还可对人体的血液循环系统、神经系统有良好的调节作用，其中含有的维生素等比较容易被人体吸收，还能提高身体的抗疲劳能力。因此，受利益的驱使，一些不法商贩以廉价肉冒充鹿肉进行售卖，严重损害了消费者权益，干扰了鹿肉市场秩序。

目前已有相关检测鹿肉的方法，但大都存在灵敏度不高或操作复杂等问题，因此，建立一种特异、灵敏且易于操作的检测肉制品中鹿源性成分的方法，对于遏制鹿肉制品市场上制假掺假现象的发生具有重要意义。

发明内容

针对以上技术现状，本发明的目的是提供一种特异、灵敏且易于操作的检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合以及检测方法。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合，F引物、R引物和探针的序列分别如下：

F引物(SEQ ID NO:1)：5’-CTTAGCCCTAGTCTCATCCATCCT-3；

R引物(SEQ ID NO:2)：5’-TGAATGGTCGGAATATCATGCT-3’；

探针(SEQ ID NO:3)：

5’-FAM-CTCATGCCTCTTCTTCACACATCCAAACAA-Eclipse-3’。

本发明还提供一种TaqMan Real-time PCR法检测肉制品中鹿源性成分的方法：提取样品的基因组DNA作为模板DNA，加入含有上述引物和探针的Real-time PCR反应体系中进行扩增，通过是否出现扩增曲线来判断样品中是否含有鹿源性成分。

进一步地，所述Real-time PCR反应体系中包括2×Probe qPCR Master Mix、模板DNA以及所述引物和探针。

更进一步地，所述F引物、R引物和探针的浓度均为10μmol/L。

更进一步地，所述模板DNA的浓度为100ng/μL。

更进一步地，所述Real-time PCR反应体系的反应条件为：95℃30sec，1个循环；95℃10sec，60℃35sec，40个循环。

本发明方法还可以实现样品中鹿源性成分的定量检测：以梯度浓度的鹿肉DNA为模板，在所述Real-time PCR反应体系中进行扩增，建立Ct值和DNA拷贝数浓度的对数值的标准曲线，用样品的Ct值在该曲线中计算样品中鹿源性成分DNA的拷贝数浓度，从而定量检测出样品中鹿源性成分的含量。

进一步地，所述鹿肉DNA的梯度浓度分别为：1×10⁸copies/μL、1×10⁷copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL。。

采用本发明的引物和探针，在Real-time PCR反应体系中能够特异性地检测鹿源性成分，其他物种均不产生干扰，并且灵敏度高，能够检测到含量为0.01％的鹿肉混合样品的DNA。实时荧光定量PCR的R²与扩增效率决定荧光定量的检测能力，本发明中不同浓度DNA对数值与Ct值的标准曲线的斜率为-3.274，R²为0.9998，扩增效率为1.02，接近1，呈良好的线性关系，能够准确对样品中鹿源性成分进行定量检测。

附图说明

图1是本发明实施例2中不同物种样品的扩增曲线；其中，横坐标为扩增循环数Ct值；纵坐标为荧光强度；曲线1：鹿肉DNA；曲线2-19：分别为羊、牛、猪、马、驴、鸵鸟、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、袋鼠、火鸡、猫、狗、兔、貉子、貂和狐狸肉DNA。

图2是本发明实施例3中含有不同浓度鹿肉样品的扩增曲线；其中，横坐标为扩增循环数Ct值，纵坐标为荧光强度；曲线1-6：鹿肉含量分别为10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％；曲线7：ddH₂O。

图3是本发明实施例5中Ct值和DNA浓度对数值的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供一种用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合，其是根据Genebank登录的鹿细胞色素b(cytochrome b，Cyt b)DNA序列进行设计，具体序列如表1所示。

表1鹿细胞色素b基因特异性引物探针序列

实施例2

本实施例利用实施例1的引物和探针进行鹿源性成分检测的特异性试验：

分别取鹿、羊、牛、猪、马、驴、鸵鸟、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、袋鼠、火鸡、猫、狗、兔、貉子、貂和狐狸肉共20种动物肉粉提取的DNA为模板，进行Real-time PCR检测。根据典型扩增曲线和各反应体系循环阈(cycle threshold，Ct)值的不同来验证实施例1的引物和探针对于不同物种的DNA模板的特异性。

样品DNA的提取：参照美国Promega公司Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒操作说明，进行肉粉样品基因组DNA的提取，使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定DNA浓度，-20℃保存备用。

Real-time PCR反应体系：2×Probe qPCR Master Mix 12.5μL、上游引物-F(10μmol/L)1μL、下游引物-R(10μmol/L)1μL、探针-P(10μmol/L)1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，补水至25μL。

Real-time PCR反应条件：95℃30sec，1个循环；95℃10sec，60℃35sec，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。

扩增结果如图1所示，只有鹿肉样品出现典型的扩增曲线，其他19种物种均未检测到荧光信号，表明本发明的引物和探针具有高度的特异性。

实施例3

本实施例利用实施例1的引物和探针进行鹿源性成分检测的灵敏性试验：

将鹿肉与牛肉以一定比例混合，制成鹿肉含量分别为10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％的混合样品，在实施例2的反应体系和反应条件下进行Real-time PCR检测，每次试验设3个平行，结果如图2所示。结果表明，当混合样品中鹿肉含量为0.01％时，仍出现典型的扩增曲线，Ct值为34.17±0.04，含量为0.001％和0.0001％时无特异性扩增曲线。表明本发明所用的引物和探针最低检出限为0.01％，具有较高的灵敏性。

实施例4

本实施例利用实施例1的引物和探针对市售鹿肉制品样品进行鹿源性成分检测：

从不同超市购买20份不同品牌的鹿肉制品，采用实施例2的real-timePCR方法对所有样品的DNA进行扩增检测，检测是否含有鹿源性成分。结果如表2所示。结果显示，17份样品中检出鹿源性成分，样品的Ct值在15.24～29.43，3份样品未检出鹿源性成分。

表2市售鹿肉制品中鹿源性成分检测结果

实施例5

本实施例利用实施例1的引物和探针进行鹿源性成分的定量检测：

标准曲线的建立：将1×10⁸copies/μL的鹿肉基因组模板DNA加入灭菌的双蒸水进行10倍倍比稀释，稀释至1×10³copies/μL，以不同稀释浓度的DNA为模板在实施例2的反应体系和条件下进行real-time PCR扩增，每次试验设3个平行。通过不同Ct值和DNA拷贝数浓度的对数值建立鹿源性成分的标准曲线，最终得到的线性方程如图3所示。结果表明，鹿肉DNA拷贝数浓度对数值与其对应的Ct值呈线性关系，以Ct值为纵轴，模板DNA拷贝数浓度对数值为横轴得到回归方程，即：y＝-3.274x+44.895，R²＝0.9998，扩增效率为1.02，线性关系良好，将检测肉制品的鹿源性成分的Ct值带入标准曲线中的公式，可得到相应肉制品中鹿源性的DNA拷贝数浓度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北省检验检疫科学技术研究院

<120> 用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合及实时荧光PCR检测方法

<130> 2019.05.05

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> F引物

<400> 1

cttagcccta gtctcatcca tcct 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> R引物

<400> 2

tgaatggtcg gaatatcatg ct 22

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 探针

<400> 3

ctcatgcctc ttcttcacac atccaaacaa 30

Claims

1.用于检测肉制品中鹿源性成分的引物和探针组合，其特征在于，F引物序列如SEQ IDNO:1所示，R引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种TaqMan Real-time PCR法检测肉制品中鹿源性成分的方法，其特征在于，提取样品的基因组DNA作为模板DNA，加入含有权利要求1所述引物和探针的Real-time PCR反应体系中进行扩增。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Real-time PCR反应体系中包括2×Probe qPCR Master Mix、模板DNA以及所述引物和探针。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述F引物、R引物和探针的浓度均为10μmol/L。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述模板DNA的浓度为100ng/μL。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Real-time PCR反应体系的反应条件为：95℃30sec，1个循环；95℃10sec，60℃35sec，40个循环。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：以梯度浓度的鹿肉DNA为模板，在所述Real-time PCR反应体系中进行扩增，建立Ct值和DNA浓度的标准曲线，用样品的Ct值在该曲线中计算样品中鹿源性成分的DNA浓度，从而定量检测出样品中鹿源性成分的含量。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鹿肉DNA的梯度浓度分别为：1×10⁸copies/μL、1×10⁷copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL。