CN103122373B - 特异性检测鲑科鱼类的实时荧光pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP和DNA聚合酶、SEQ ID NO.1或2所示的上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物、SEQ ID NO.4所示的荧光探针；其检测方法包括：1)提取待测样本DNA；2)对样本DNA和阴性对照样品进行PCR反应，并进行荧光检测；3)选择FAM荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。本发明能快速、准确地检测和鉴定鲑科鱼类成分，降低常规PCR扩增的假阳性率。

Description

特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，特别是涉及一种涉及食品、饲料和其它鱼类加工产品中特异性检测和鉴定鲑科鱼类的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来食品以次充好及假冒伪劣事件在我国乃至国际上时有发生，且越发严重。鲑科鱼类多为深海洄游鱼类，目前科学家已发现世界上共有鲑科鱼类品种66个。由于鲑科鱼肉，尤其是其中的“三文鱼”含有较高蛋白质和OMEGA-3脂肪酸，脂肪含量很低，具有很高的营养价值和食疗作用，因此受到广大消费者的喜爱。目前国内市场对鲑科鱼类的需求越来越大，而其价格不菲，受利益驱使，市场上鲑科鱼类是鱼龙混珠，以次充好现象时有发生。新鲜鱼肉本来就很难鉴别真伪，经过加工后，鲑鱼产品的真伪就更难分辨。

目前我国还没有相应的检测方法对进出口食品、饲料及加工产品中鲑科鱼类成分进行鉴别检测，也就是说目前进出口食品、饲料等产品中鲑科鱼类成分的鉴伪仍处于空白。这在一定程度上制约着我国食品进出口贸易的发展和我国水产品市场的有序进行。为了减少水产品进出口贸易摩擦、维护消费者知情权和自身利益、确保食品质量安全，促进市场上鲑科鱼类品种名称的规范化和统一化，迫切需要建立和制订进出口食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类成分的检测和鉴别方法。目前国内外还没有食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类成分检测方法的报道。

综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类检测方法。因此，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高、简便快速的食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类检测和鉴定方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒及检测方法。通过根据鲑科鱼类生长激素基因，设计特定的引物和TaqMan荧光探针，实现实时荧光PCR检测试剂盒的制备，并通过该检测试剂盒，能对鲑科鱼类进行快速、准确、简便和特异地检测和鉴定。

为解决上述技术问题，本发明的特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒，包括：PCR缓冲液、dNTP和DNA聚合酶，其中，还包括SEQ ID NO.1或2所示的上游引物(F1、F2)、SEQ ID NO.3所示的下游引物(R1)、SEQ ID NO.4所示的荧光探针(P1)。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括SEQ ID NO.5所示的马苏大麻哈鱼(鲑科鱼类代表性品种)生长激素基因DNA标准品。

另外，本发明还提供一种特异性检测和鉴定鲑科鱼类的荧光PCR检测方法，包括步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)采用上述PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行目的基因的实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；

(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

所述步骤(2)中的阴性对照样品，可按本领域常规方法选择，即选择非鲑科鱼类DNA样本，包括其它科、目的鱼类样品或其它动物组织DNA样品。

所述方法，还可同时以梯度浓度的上述DNA标准品溶液在与样品DNA相同条件下，进行PCR扩增反应，以DNA标准品溶液浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值(域值循环数)为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的浓度，从而对样品DNA进行定量检测。

所述PCR反应条件可按参照本领域常规实时荧光PCR方法，如本发明中PCR反应条件可为：50℃2分钟，95℃10分钟；进入循环，95℃15秒、60℃60秒，进行45个循环扩增。

PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×实时荧光PCR预混液(上海辉睿生物科技有限公司)、0.25μM上游引物F1、0.25μM上游引物F2、0.5μM下游引物R1、0.2μM实时荧光探针P1，加入2-5μL DNA模板(50-100ng)，反应总体积通常为25μL。也可等比例配制20μL或50μL反应体系。

本发明通过特异性引物和荧光探针序列的设计，而试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作鲑科鱼类的定性检测，也可采用标准品做标准曲线后进行定量检测。本发明能够快速、准确地检测和鉴定食品、饲料和其它鱼类加工产品中鲑科鱼类成分，而且检测灵敏度高，特异性好，操作简便、快速，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是实时荧光PCR特异性实验结果图，其中，A为鲑科鱼类的实时荧光PCR检测结果图，B为非鲑科鱼类的实时荧光PCR检测结果图；

图2是鲑科鱼类实时荧光定量PCR标准品检测结果图，其中，图中的1-5分别为0.0067、0.067、0.67、6.7、67ng/μL标准品。

图3是图2的实时荧光定量PCR的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：特异性引物和荧光探针的特异性测试

1、样品DNA的提取和纯化

采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取DNA，或采用具有相同效果的动物组织DNA提取试剂盒，如目前商业化的DNA抽提试剂盒，如采用德国QIAGEN公司的DNA Mini Kit或其它试剂盒进行DNA提取。

其中，CTAB法提取DNA的具体步骤如下：

1)提取待测样本DNA

对于新鲜鱼样：小心切开鱼组织，从内部挖取适量鱼肉，完全冷冻后，用组织研磨机将其打碎成肉沫；

对于干样：取适量样品，采用样品粉碎仪或研磨机，将样品充分粉碎并搅拌均匀；

2)取约100mg研磨好的样品放入2mL离心管中，加入500μL 2.0％CTAB缓冲液，涡旋振荡30s混匀，加入5μL蛋白酶K溶液(上海辉睿生物科技有限公司)，涡旋振荡30s混匀；

3)将2mL离心管放入恒温孵育器或水浴锅，65℃恒温30min，待离心管冷却到室温后，15000×g，离心10min；

4)吸取上清液至一新的2mL离心管中，加入200μL氯仿，涡旋振荡30s混匀，室温静置2min后，15000×g，离心10min；

5)吸取上清液至一1.5mL离心管中，加入2倍体积的0.5％CTAB缓冲液，颠倒混匀，室温静置1h后，15000×g，离心5min，弃上清液；

6)短暂离心，将离心管底部残余液体吸尽，加入350μL 1.2M NaCl溶液，室温放置10min，使DNA全部溶解(可在60℃温浴2min加速溶解)；

7)加入10μL RNase A溶液(上海辉睿生物科技有限公司)，37℃温浴20min后，加入350μL氯仿，涡旋振荡30s混匀，15000×g离心10min；

8)取上清液至一新1.5mL离心管中，记录上清液体积，加入0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，15000×g离心10min后，弃尽上清液，加入200μL 70％乙醇，颠倒混匀，15000×g离心2min；

9)弃尽上清液，加入500μL 70％乙醇，颠倒混匀，15000×g离心2min；

10)重复步骤9)一次；

11)短暂离心，将残余上清液吸尽后，将离心管放于生物安全柜中，将DNA晾干，加入100μL 1×TE缓冲液，使DNA完全溶解；

12)将提取的DNA样品保存于-20℃备用。

2、仪器

ABI7500实时荧光PCR仪

3、引物及探针设计与合成

以鲑科鱼类生长激素基因(马苏大麻哈鱼生长激素基因，GenBank编号：EU090916)为模板，使用Primer ExpressTM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选出了如下的最佳组合：

上游引物F1：5’-CACAGGGGAGCCAGGATG-3’(SEQ ID NO.1所示)

上游引物F2：5’-CACAGGGGAGCCAGGAMG-3’(SEQ ID NO.2所示)，其中，M为：A或C或G；

下游引物R1：5’-CAGGTTCTGGTAGTAGTTCCCGTAG-3’(SEQ ID NO.3所示)荧光探针P1：5’-FAM-TGAGCCTGGATGACAATGACTCTCAG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.4所示)，其中，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

其中，引物、探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。

4、特异性检测

PCR反应液总体积为25μL，按如下组成配制(终浓度)：：1×实时荧光PCR预混液(上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix，Code：HR-RT01-50，包含有PCR缓冲液、dNTP和DNA聚合酶)、0.25μM上游引物F1、0.25μM F2、0.5μM下游引物、0.2μM实时荧光探针P1，2-5μL DNA模板(50-100ng)，DEPC水补足至25μl。

用ABI7500荧光检测系统进行检测，其中，PCR反应条件：50℃2分钟，95℃10分钟；进入循环，95℃15秒、60℃60秒，进行45个循环扩增。

共选取表1中鲑科鱼类(包括鲑亚科、白鲑亚科，茴鱼亚科的鱼类样品)以及非鲑科鱼类(表2)DNA样品进行特异性检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长(如r＞0.9999)，则判断为阳性。

图1显示所有包括鲑亚科、白鲑亚科和茴鱼亚科DNA样品中均出现明显的阳性荧光增长信号，而非鲑科鱼类和动物组织DNA样品中均无荧光增长信号，说明建立的实时荧光PCR检测方法特异于鲑科鱼类的检测。

表1实时荧光PCR检测方法特异性测试样品明细

表2非鲑科鱼和动物样品明细

样品编号	样品名称	样品编号	样品名称
				Non01	黄菇鱼	Non16	鲥鱼
Non02	白菇鱼	Non17	狗头鱼
				Non03	香鱼	Non18	白斑狗鱼
Non04	格陵兰鳙蝶鱼	Non19	鲢鱼
				Non05	巴沙鱼	Non20	接吻鱼
Non06	金线鱼	Non21	鳕鱼
				Non07	黄鳍棘鲷鱼	Non22	罗非鱼
Non08	大眼菇鱼	Non23	马鲛鱼
				Non09	金枪鱼	Non24	鸡
Non10	虎头鱼	Non25	鸭
				Non11	黄鳍金枪鱼	Non26	鹅
Non12	鲐鱼	Non27	猪
				Non13	金枪鱼	Non28	羊
Non14	旗鱼	Non29	牛
				Non15	银鱼

另外，本实施例中，还可同时以梯度浓度的DNA标准品(SEQ ID NO.5所示的马苏大麻哈鱼生长激素基因DNA标准品)溶液，在与样品DNA相同条件下，进行实时荧光定量PCR扩增反应。其中，DNA标准品的定量标准如下：

用紫外分光光度计测的DNA浓度为67ng/μl，作为标准品，再分别倍比稀释至6.7、0.67、0.067、0.0067ng/μL，用荧光实时定量PCR方法进行检测，结果如图2所示，而且该荧光实时定量PCR方法的检测敏感性达到2×0.0067ng/μl。

同时，以上述的DNA标准品溶液浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图3所示。由此，可根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的浓度，从而对样品DNA进行定量检测。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种用于特异性检测鲑科鱼类的PCR检测引物，其特征在于：所述引物序列包括：SEQID NO.1或2所示的上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物。

2.一种用于特异性检测鲑科鱼类的PCR检测探针，其特征在于：所述探针序列包括：SEQID NO.4所示的荧光探针。

3.一种特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒，包括：PCR缓冲液、dNTP和DNA聚合酶，其特征在于：还包括SEQ ID NO.1或2所示的上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物、SEQ ID NO.4所示的荧光探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQ ID NO.5所示的马苏大麻哈鱼生长激素基因DNA标准品。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒应用于特异性检测和鉴定鲑科鱼类的用途。

6.一种特异性检测鲑科鱼类的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括步骤：

（1）提取待测样本DNA；

（2）采用如权利要求3所述的PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；

（3）选择FAM荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的阴性对照样品，为非鲑科鱼类DNA样本。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：

以梯度浓度的马苏大麻哈鱼生长激素基因DNA标准品溶液在与样品DNA相同条件下，进行PCR扩增反应，以DNA标准品溶液浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的浓度。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR反应条件为：50℃2分钟，95℃10分钟；进入循环，95℃15秒、60℃60秒，进行45个循环扩增。