CN102094088A - 一种羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于对羊早期胚胎的性别进行鉴定的试剂盒。本发明的羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒内有两对特异引物、两个探针和金标试纸，其中：两个特异引物分别为SRY基因引物和内标Callipyge基因引物，两个探针分别为SRY探针和Callipyge探针；金标试纸是由用胶体金包被BIOTIN抗体的结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维膜构成的其上分别包被有用FITC抗体包被的检测区和位于检测区下游的用DIG抗体包被的质控区。

Description

一种羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒及这种检测试剂盒的使用方法，确切讲本发明是一种用于对羊早期胚胎的性别进行鉴定的试剂盒。

背景技术

动物性别控制是一项能显著提高动物繁殖率的生物工程技术，它对动物的育种、生产和遗传疾病的防治都有非常重要的意义。早期胚胎的性别鉴定是性别控制的主要途径。通过控制后代的性别比例，可以充分发挥受性别限制的生产性状和受性别影响的生产性状的最大经济效益。如一些经济性状肉、蛋、乳、毛、茸等的生产都需要特定性别的动物来进行生产。控制后代的性别比例还可增加选择强度，加快育种进程，促进了高效畜牧业的发展。性别控制的实现还可避免不理想的隐性性别，防止性连锁疾病，加速动物遗传进展，加快群体更新，参见：吕碧文.家畜胚胎性别鉴定的分子生物学方法及现状[J].浙江畜牧兽医，1998，(3)：15～16。如通过控制胚胎性别可以克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。性别鉴定技术对保护珍惜动物和濒危物种，保持生物多样性维护生态平衡具有重要意义，见：张思仲，周荣家.大熊猫SRY基因的PCR扩增和克隆[J].遗传学报，1994，21(4)：281～286；扬晓娟.大熊猫与熊类动物性别的分子鉴定[J].应用与环境生物学报，1995，5(3)：288～290。在保护珍惜动物的执法过程中，也需要对动物进行性别鉴定。在某些案件中对被捕获的动物进行性别鉴定是判断狩猎者是否触犯法律法规的这样依据(徐艳春，马立新，白素英等.应用PCR方法通过毛发进行哺乳动物性别鉴定[J].东北林业大学学报，2000，28(6)：72～77)。因此，对早期胚胎进行性别鉴定，在动物生产中具有重要的商业价值和科学价值。

目前，用于绵、山羊早期胚胎性别鉴定的方法有H-Y抗原法、Y-染色体特异性DNA探针杂交法、PCR、LAMP法等。H-Y抗原法可通过免疫荧光分析和细胞毒性分析进行性别鉴定，免疫荧光分析对胚胎损伤小，但鉴定准确率低于87％，参见：Andersib，G.B.1987.Identification of embryonic sex by detection of H-Y antigen.Theriogenology 27：87-97.。细胞毒性分析虽然有较高的准确率，但却要以毁掉雄原核为代价，参见：Bredbacka，P.and J.Peippo.1992.Sex diagnosis of ovine and bovine embryos by enzymatic amplification and digestion of DNA from the ZFY/ZFX locus.Agric.Sci.Fin.2：233-238.。另外，H-Y抗原是弱抗原，抗体特异性不高，荧光强弱的判断具有一定的主观性，往往影响鉴定的准确性，参见Monk，M.and A.H.Handyside.1988.Sexing of preimplantation mouse embryos by measurement of X-linked gene dosage in a single blastomere.J.Reprod.Fert.82：365-368.。Y-染色体特异性DNA探针杂交法鉴定的准确率可达90％，但必须要以流式细胞仪分离Y-精子，建立Y-染色体片段文库，挑选特异性强的探针等一系列步骤为前提，因而耗时长，过程复杂，不利于商业化生产，参见：Lemos，D.C.Lopesrios，A.F.Caetano，L.C.Lobo，R.B.Vila，R.A.Martelli，L.Takeuchi，P.L.and Ramos，E.S.2005.Use of TSPY gene for sexing cattle.Genet.Mol.Biol.28：117-119.Lu K H，Cran D G，Seidel G E，et al.In vitrofertiliza-tion with flow-cytometrically sorted bovine sperm[J].Theriogenology，1999，52(8)：393-40。利用PCR技术扩增Y染色体特异序列进行胚胎的性别鉴定，能够用较少的时间取得较高的可靠性，准确率可达到95％～100％.目前，PCR技术在牛、羊早期胚胎性别鉴定中已取得了突破性的进展，Herr于1990年首先采用PCR技术扩增Y染色体特异多重复序列来鉴定牛、羊的胚胎性别，准确率分别达到91.6％和96.5％，参见：Herr C M，Matthaei K，Steel，et al.Rapid Y-chromo-some assay sexing of peripheral blood lymphocytesfrom Bovine of known phenotypic sex[J].Therigeneol-ogy，1990，33：240。同时Sinclair，Gubbay和Koopman也都先后发现了哺乳动物的性别决定基因SRY，通过PCR技术来检测SRY基因的有无便可判定胚胎的性别，参见：Handyside A H，Kontogianni E H.Pregancies from bi-opsied human preimplant embryos sexed by Y-specific amplification[J].Nature，1990，19(344)：768-770；Sinclair A 1，Berta P，Palmer M S，et al.A gene from the human sex-determining region decodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motify[J].Nature，1990，346：240-244；Koopman P，Gubbay J，Vivian N，et al.Male develop-ment of chromosomally female mice transgenic for SRY[J].Nature，1991，351：117-121。但应用PCR性别鉴定在PCR产物扩增、检测过程中需要应用PCR仪、高速离心机、电泳仪、凝胶成像系统等大中型设备，且整个检测时间超过需要3小时，使胚胎活性降低，限制了其在临床性别鉴定中的应用。

发明内容

本发明提供一种羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒，采用这本发明的用于鉴定羊早期胚胎的性别可克服现有技术不足。

本发明的羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒内有两对特异引物、两个探针和金标试纸，其中：

a.两个特异引物分别为SRY基因引物和内标Callipyge基因引物，其中：

SRY上游引物5′-ACGCCTTCATTGTGTGGTCTCG-3′，

SRY上游引物5′BIOTIN-CCTTTTCCACTCGTATCCCAGC-3′；

Callipyge上游引物：5′-CGTGTCCTGGTCTATTTTCGG-3′，

Callipyge下游引物：5′BIOTIN--ATCACCCACACCCTGCCTT-3′；

b.两个探针分别为SRY探针和Callipyge探针，其中：

SRY探针为′-GGTGGCTCTAGAGAATCCCAAATTGCAAAACTC-3′-DIG，

allipyge探针为5′-GGATCTGACAGGTGGTCCCAGCCCTCGGGCCCC3′-FITC；

c.金标试纸是由包括首尾衔接依次固定于PVC衬板材料上的用多孔纤维材料构成的加样吸水层、位于加样吸水层尾端并与加样吸水层相连的吸附有用胶体金包被BIOTIN抗体的结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层构成，其中在反应垫上分别包被有用FITC抗体包被的检测区和位于检测区下游的用DIG抗体包被的质控区。

本发明的羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒的使用方法是：以在其中加入胚胎处理液定容并经55℃水浴一小时后的羊胚胎提取细胞为模板，分别以SRY引物和Callipyge引物进行HAD不对称恒温扩增反应，再分别在反应产物中加入1ul5uM的SRY探针和1ul 5uM Callipyge探针及100ulpH值为8.0的磷酸缓冲液，经加热至95℃5分钟后冷却到室温，然后将其滴加到金标试纸的加样吸水层，根据检测区和质控区显色的情况判定样品的性别。

本发明是以赖解旋酶恒温基因扩增方式复制动物DNA，并在扩增产物中加入相应的探针作为被检测样，用金标试纸进行相应的检测。赖解旋酶恒温基因扩增(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)是模拟动物体内DNA的复制机制的一种新的体外恒温基因扩增技术。该技术依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白(SSB)单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。HDA和其它恒温基因扩增技术相比，具有操作简单、结果准确、反应灵敏、无需特殊仪器等优点。

本发明是一种胚胎性别鉴定的快速、简便、准确的新手段。本发明改进了现有技术进行动物胚胎性别鉴定存在的缺点，在胚胎性性别鉴定过程中，应用HAD恒温扩增技术进行SRY基因、Callipyge基因扩增，摆脱了核酸扩增对PCR仪的依赖，使核酸扩增仅使用水浴锅就能完成。在核酸产物检测过程中应用金标试制条进行检测，从而摆脱了对使高速离心机、电泳仪、凝胶成像系统等大中型设备的依赖。同时本检测技术与PCR检测技术相比，大大缩短了检测时间，整个检测时间仅需1.5小时，从而提高胚胎移植的成功率。

附图说明

图1为本发明中PCR产物电泳检测图。

图2为金标试制条检测检测结果，其中：C为质控线T为检测线，其检测结果是1为.阳性(公)，2为阴性(母)。

图3为绵羊血液羊SRY基因层析试纸条检测结果。

具体实施方式

以下为本发明的实施例：

1)两个特异引物SRY基因引物和内标Callipyge基因引物均由大连宝生物公司合成，其中：

SRY上游引物5′-ACGCCTTCATTGTGTGGTCTCG-3′，

SRY上游引物5′BIOTIN-CCTTTTCCACTCGTATCCCAGC-3′；

Callipyge上游引物：5′-CGTGTCCTGGTCTATTTTCGG-3′，

Callipyge下游引物：5′BIOTIN--ATCACCCACACCCTGCCTT-3′；

2)两个探针SRY探针和Callipyge探针均由大连宝生物公司合成，其中：

SRY探针为′-GGTGGCTCTAGAGAATCCCAAATTGCAAAACTC-3′-DIG，

Callipyge探针为5′-GGATCTGACAGGTGGTCCCAGCCCTCGGGCCCC3′-FITC；

3)金标试纸的制备

在PVC衬板材料上首尾衔接依次固定于用多孔纤维材料构成的加样吸水层、位于加样吸水层尾端的由硝酸纤维膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层。在反应垫上用胶体金包被BIOTIN抗体的结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层构成，其中在反应垫上分别包被有用DIG抗体包被的检测区和位于检测区下游的用FITC抗体的质控区。

胶体金的制备

(1)胶体金溶液的制备

取0.01％氯金酸水溶液100mL，加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.7mL，金黄色氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其直径在15nm左右。

(2)胶体金标记抗体的制备

将BIOTIN抗体蛋白质溶液以3000r/min，离心20min，去除多余的盐离子及杂质。用0.1mol/L K2CO3调节胶体金的pH值至9.0。根据待标记蛋白质的要求，调节胶体金溶液至pH 9.0后，分装10管，每管10mL。将BIOTIN抗体用0.005mol/L，pH 9.0的硼酸盐缓冲液做系列稀释成60μg/mL，分别取10mL加入1管金溶胶内，在搅拌下将金溶胶液和抗体蛋白混合，10min后再加5％BSA使其最终浓度为1％，防止抗体蛋白和胶体金聚合和沉淀。将胶体金标记抗体先用1500r/min低速离心20min，弃去沉淀。再将上清液以4℃15000r/min离心40min，弃去上清液，将得到的胶体金蛋白质结合物放入pH 8.2的TBS溶液中，即为包被了蛋白质的金溶胶，也即金标BIOTIN抗体，4℃保存。

(3)试纸条的装配

用0.05mol/L，pH 8.5的TBS稀释胶体金标记抗体，充分混匀后，将吸水纤维浸入胶体金标记抗体溶液中，取出后阴干备用；依次将硝酸纤维素膜、胶体金吸水纤维、吸水滤纸贴于塑料衬板上(用双面胶带粘合)，切成0.4cm宽的长条；在硝酸纤维素膜的不同位置将2mg/ml浓度的FITC抗体包被于检测线位置(即C线对照位置)，将2mg/ml浓度的DIG抗体包被于质控线位置(即T线检测点)。

以上所使用的BIOTIN抗体、DIG抗体、FITC抗体均有商品销售。本发明以上实施例所用的抗体系从北京欣博盛生物科技有限公司、英国AbD Serotec公司购得。

检测实例

(一)DNA提取

10供体(无角陶赛特X小尾寒羊F1)用CIDR(Fluorogestone acetate 300毫克)(新西兰)连续处理12天，从10日至13日每间隔12小时用剂量递减法(1.5ml 2天，1.0ml2天)用oFSH(绵羊卵泡刺激素20mg/ml)(加拿大)进行超排。第12天，拆除海绵栓，肌肉注射PMSG(300IU)(加拿大)肌内注射(IM)，12小时后用试情公羊检测是否发情。发情后用无角陶赛特公羊进行新鲜精液宫腔内人工授精两次，配种后

天取胚胎。

在显微镜下收集胚胎，从10个供体中共获得胚胎67枚。用PBS净冼3次置无菌室内，静置0.5h，在培养液中，评定其发育时期、胚龄及级别。使用玻璃针法，从绵羊胚胎(绵羊4胞期胚胎切取1～2个细胞、桑葚胚胚胎切取2～10个细胞，囊胚期胚胎滋养层细胞切取2～10个细胞)中取1-2个细胞，然后再用0.145mol/L NaCl冼2次，加入胚胎处理液[10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/LMgCl2，0145％NP240，0.45％Tween-20，0.1μg/μL蛋白酶K]，使总体积为20μL，将胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min。然后将此胚胎溶解物直接作为PCR反应的模板。分离后的胚胎应用1XPBS、0.4％BSA在10℃温浴10小时，待性别鉴定试验完成后用于胚胎移植到用FGA+eCG处理的受体羊子宫中(2枚同性别胚胎/受体羊)。

(二)HAD不对称恒温扩增的操作步骤

根据HDA法的特性，参考有关文献，结合预实验拟立操作步骤如下：φ)配制反应液I、II。反应液I由引物、MgS04，ThermoPol II buffer组成。反应液II含dNTPs，dATP，Bst Polymerase，Tte-UvrD helicase，Tte-Mutt ThermoPol II buffer。②)依次移2μL羊基因组DNA、13μL反应液I至一洁净的微量反应管，混匀；③在95℃水浴中加热8min，冰浴中5min退火。(4)加入等量的反应液II，混匀即为扩增体系。(5)置扩增体系于64℃热水中扩增1h。

(二)HDA法检测胚胎性别电泳鉴定方法的建立

用1X TAE缓冲液配制4.0％的琼脂糖凝胶，加入10mg/mL EB.至终浓度为1μg/mL，取5μL PCR产物，在100V下电泳。当加载染料到达一定位置后，停止电泳，在紫外透射仪下观察。以本研究设计的特异性引物扩增羊血液基因组DNA，产物与预计大小一致，约107、117bp，电泳结果见图5。

(三)本发明试纸检测

将HAD不对称恒温扩增的PCR产物20ul，加入SRY探针(5uM)1ul、Callipyge探针(5uM)1ul、PBS缓冲液(Ph＝8.0)100ul 95℃加热5分钟，冷却到室温，滴加在制备的金标试纸条上进行检测，5分钟后显示结果。检测结果如下：如C线和T线同时显色，羊的性别为雄性(公羊)，若仅有C线显色，羊的性别为雌性(母羊)。

(四)试纸条灵敏度检测

9只绵羊(5公，4母)血液基因组DNA用HAD不对称恒温扩增后，按照前述检测方法进行检测，检测结果与实际性别完全相符。金标试纸条灵敏度检测结果(如图3)显示，在DNA浓度(最低)达到10pg时仍能够检出。

(五)绵羊胚胎性别金标试制条检测

采用51枚胚胎用于性别检测和胚胎移植检测试验，其中5枚在体外发育24后检测发育不正常，共有45枚胚胎移植到22个受体羊中，移植5周后检测发现共有17只移植成功，6为雄性，11只雌性，与胚胎性别鉴定结果完全一致。

Claims (2)

1.一种羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒，其特征在于试剂盒内有两对特异引物、两个探针和金标试纸，其中：

a.两个特异引物分别为SRY基因引物和内标Callipyge基因引物，其中：

SRY上游引物5′-ACGCCTTCATTGTGTGGTCTCG-3′，

SRY上游引物5′BIOTIN-CCTTTTCCACTCGTATCCCAGC-3′；

Callipyge上游引物：5′-CGTGTCCTGGTCTATTTTCGG-3′，

Callipyge下游引物：5′BIOTIN--ATCACCCACACCCTGCCTT-3′；

b.两个探针分别为SRY探针和Callipyge探针，其中：

SRY探针为′-GGTGGCTCTAGAGAATCCCAAATTGCAAAACTC-3′-DIG，

Callipyge探针为5′-GGATCTGACAGGTGGTCCCAGCCCTCGGGCCCC3′-FITC；

c.金标试纸是由包括首尾衔接依次固定于PVC衬板材料上的用多孔纤维材料构成的加样吸水层、位于加样吸水层尾端并与加样吸水层相连的吸附有用胶体金包被BIOTIN抗体的结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层构成，其中在反应垫上分别包被有用DIG抗体包被的检测区和位于检测区下游的用FITC抗体的质控区。

2.权利要求所述的羊早期胚胎性别鉴定的试剂盒的使用方法，其特征是以在其中加入胚胎处理液定容并经55℃水浴一小时后的羊胚胎提取细胞为模板，分别以SRY引物和Callipyge引物进行HAD不对称恒温扩增反应，再分别在反应产物中加入1ul 5uM的SRY探针和1ul 5uM Callipyge探针及100ulpH值为8.0的磷酸缓冲液，经加热至95℃5分钟后冷却到室温，然后将其滴加到金标试纸的加样吸水层，根据检测区和质控区显色的情况判定样品的性别。

Images