CN112444631A - 一种检测鹤性别的试剂盒 - Google Patents

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CN112444631A CN201910836944.5A CN201910836944A CN112444631A CN 112444631 A CN112444631 A CN 112444631A CN 201910836944 A CN201910836944 A CN 201910836944A CN 112444631 A CN112444631 A CN 112444631A
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贾婷
王伟
赵素芬
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张成林
李晓光
李静
杜洋
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Abstract

本发明公开了一种检测鹤性别的试剂盒。本发明提供了一种检测鹤性别的试剂盒，包括单独包装的雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条。本发明制备检测鹤性别的试剂盒,其内含有检测雌性鹤的胶体金试纸和检测雄性鹤的胶体金试纸，克服了现有技术无法同时检测雌二醇和睾酮的缺点，并且该试剂盒中各个试纸条单独包装，不交叉影响结果，能够实现对样品中雌二醇和睾酮进行快速、现场和灵敏的检测。

Description

一种检测鹤性别的试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种检测鹤性别的试剂盒。
背景技术
目前常规检测性激素的方法为液相色谱，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。
以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，而同时检测雌二醇和睾酮的速测卡还未见有公开报道。
发明内容
为了解决同时检测雌二醇和睾酮，本发明提供了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种检测鹤性别的试剂盒，包括单独包装的雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条；
所述雌二醇胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记雌二醇抗体的金标垫、含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜、和吸水垫，所述雌二醇检测线T由雌二醇抗原或其溶液形成；
所述睾酮胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记睾酮抗体的金标垫、含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜、和吸水垫，所述睾酮检测线T由睾酮抗原或其溶液形成。
上述试剂盒中，所述雌二醇抗体为雌二醇单克隆抗体；
或，所述睾酮抗体为睾酮单克隆抗体；
或，所述雌二醇抗原为E2抗原，
或，所述睾酮抗原为T抗原。
上述试剂盒中，所述包被有胶体金标记雌二醇抗体的金标垫为将胶体金标记雌二醇抗体溶液喷于金标垫上形成；
所述包被有胶体金标记睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记睾酮抗体溶液混匀后喷于金标垫上形成；
或，所述胶体金标记雌二醇抗体溶液的浓度为0.4mg/ml；
或，所述胶体金标记睾酮抗体溶液的浓度为0.4mg/ml。
上述试剂盒中，所述E2抗原溶液的浓度为1.0mg/mL；
或，所述T抗原溶液的浓度为1.0mg/mL；
或，所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；
或，所述IgG抗体溶液的浓度具体为1mg/ml。
本发明另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)制备雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条；
所述制备雌二醇胶体金试纸条的方法包括如下步骤：制备包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫和制备含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜；再将所述包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫、样品垫、所述含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到雌二醇胶体金试纸条；
所述包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫为将胶体金标记的雌二醇抗体喷于金标垫上，得到的；
所述含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜为将浓度为1.0mg/mLE2抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T线作为检测线，且将浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗溶液在所述硝酸纤维素膜上划C线作为质控线，得到的；
所述制备睾酮胶体金试纸条的方法包括如下步骤：制备包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫和制备含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜；再将所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫、样品垫、所述含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到所述睾酮胶体金试纸条；
所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记的睾酮抗体喷于金标垫上，得到的；
所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记的T抗体喷于金标垫上，得到的；
所述含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜为将浓度为1.0mg/mLT抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T线作为检测线，且将浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗溶液在所述硝酸纤维素膜上划C线作为质控线，得到的；
2)将所述雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条单独包装，得到上述的试剂盒。
上述试剂盒或所述试剂盒中雌二醇胶体金试纸条和/或睾酮胶体金试纸条的在制备检测或辅助检测鹤性别产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述产品为试剂盒。
本发明还有一个目的是提供如下方法：
本发明提供一种检测或辅助检测鹤性别的方法，包括如下步骤：
1)用有机溶液对待测鹤的粪便进行提取，得到提取液；
2)用上述试剂盒中的所述雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条检测所述提取液；
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为或候选为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为或候选不为雌性；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为或候选为雄性；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为或候选不为雄性。
上述用有机溶液对待测鹤的粪便进行提取，得到提取液，即为待测样本，方法具体如下：
取单只鹤的0.4g粪便样本加入80％(体积百分含量)甲醇水溶液4ml，震荡5分钟，5000rpm离心3分钟，取2ml上清液于5ml离心管中。60°吹干，加0.2ml 10％(体积百分含量)甲醇水溶液与0.2ml正己烷于离心管中充分震荡溶解，5000rpm离心3分钟，取下层清液75μL作为待测样本(提取液)。
或，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样品中是否含有雌二醇和/或睾酮的方法，包括如下步骤：用上述试剂盒中的雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条检测待测样本；
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测样本中含有或候选含有雌二醇；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测样本中不含有或候选不含有雌二醇；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测样本中含有或候选含有睾酮；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测样本中不含有或候选不含有睾酮。
本发明制备检测鹤性别的试剂盒,其内含有检测雌性鹤的胶体金试纸和检测雄性鹤的胶体金试纸，克服了现有技术无法同时检测雌二醇和睾酮的缺点，并且该试剂盒中各个试纸条单独包装，不交叉影响结果，能够实现对样品中雌二醇和睾酮进行快速、现场和灵敏的检测。
附图说明
图1为试纸条组装示意图；1、底板；2、NC膜；3、吸水纸；4、金标垫；5、样品垫；6、T线；7、C线。
图2为雌二醇胶体金试纸条的灵敏性。
图3为睾酮胶体金试纸条的灵敏性。
图4为雌二醇胶体金试纸条检测结果。
图5为雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液的配方如下表1:
表1
品名 用量
氯化钠 8g
十二水合磷酸氢二钠 3.35g
氯化钾 0.2g
磷酸二氢钾 0.2g
纯水 1L
下述实施例中采用的pH 7.4，0.2mol/L PBS配方如下:8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L。
下面结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1、检测鹤性别的试纸
一、检测雌二醇胶体金试纸的制备
1、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备
1)、包被抗原的制备
E2抗原(购自上海佑隆生物科技有限公司，产品目录号：BC2111)，也可为由雌二醇(购自sigma)羟基基团与BSA蛋白的氨基基团共价偶联得到产物；
将E2抗原用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.0mg/mL得到E2抗原溶液，作为检测线T的包被抗原。
羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗(购自杭州隆基)溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml。
2)、包被
选取PALL170的硝酸纤维素膜(NC膜)用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的E2抗原溶液以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜。
2、金标垫的制备
1)胶体金制备
a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。
b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末(购于sigma)于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存。
c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠(购自sigma)溶解于99ml超纯水中，混匀。
d)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml。倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金溶液(其中胶体金的粒径为40nm；浓度为万分之一)。
2)抗体标记
e)抗体的标记：取1.5ml上述1)制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，加入20ug雌二醇单克隆抗体(购自上海佑隆生物科技有限公司，产品目录号：BC2124)，混合均匀，室温反应40min。加入10％的BSA终止，静置30min。
f)标记抗体纯化：先用低速(1500r/min)离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速(8500r/min)离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％(质量百分含量)BSA的0.1M PBS(PH7.4)复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金雌二醇抗体溶液，浓度为0.4mg/ml。
3)喷金与划膜
将上述2)制备的浓度为0.4mg/ml标记胶体金雌二醇抗体溶液以1.0μL/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫。
试纸条中，雌二醇抗体和E2抗原之间的质量比5:4。
3、胶体金试纸条的组装
胶体金试纸条按照层析方向依次由样品垫、上述2制备的固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜(PALL170)和吸水垫固定在底板上；胶体金试纸条结构示意图见图1。
组装步骤如下：将样品垫和吸水垫裁剪成2.5cm宽，金标垫0.6cm宽。(1)在底板1上粘贴上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜2；(2)粘贴上述2制备的金标垫4，将金标垫的2-3mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(3)粘贴样品垫5，将样品垫的2-3mm覆盖在金标垫上；(4)粘贴吸水垫3，将吸水垫的4-5mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(5)用衔接胶带固定每层的衔接部分；(6)将组装好的底板裁剪成4mm宽的试纸条，密封保存备用，得到胶体金试纸条。
二、检测睾酮胶体金试纸的制备
1、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备
1)、包被抗原的制备
T抗原(购自上海佑隆生物科技有限公司，产品目录号：BC2311)，也可为由睾酮(购自sigma)羟基基团与BSA蛋白的氨基基团共价偶联得到产物；
将T抗原用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到T抗原溶液，作为检测线T的包被抗原。
羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗(购自杭州隆基)溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml。
2)、包被
选取PALL170的硝酸纤维素膜(NC膜)用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的T抗原溶液以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜。
2、金标垫的制备
1)胶体金制备
与一的方法一样，得到胶体金溶液(其中胶体金的粒径为40nm；浓度为万分之一)。
2)抗体标记
a)抗体的标记：取1.5ml上述1)制取好的胶体金，用0.1M的K2CO3调节pH值，加入20ug睾酮单克隆抗体(上海佑隆生物科技有限公司产品目录号：BC2324)，混合均匀，室温反应40min。加入10％的BSA终止，静置30min。
b)标记抗体纯化：先用低速(1500r/min)离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速(8500r/min)离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％(质量百分含量)BSA的0.1M PBS(PH7.4)复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金睾酮抗体溶液，浓度为0.4mg/ml。
3)喷金与划膜
将上述2)制备的标记胶体金睾酮抗体溶液以1.0μL/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用。
试纸条中，睾酮抗体和T抗原之间的质量比5:4。
3、胶体金试纸条的组装
与一的3的组装方式一样。
试纸条按照层析方向依次由样品垫、上述2制备的金标垫、上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜(PALL170)和吸水垫固定在底板上。结构示意图见图1。
三、检测鹤性别试剂盒的制备
将上述一制备的雌二醇胶体金试纸条和上述二制备的睾酮胶体金试纸条单独包装，作为检测鹤性别的试剂盒的组分。
四、检测鹤性别试剂盒的检测方法
1、待测样本的制备
样品可以为单只鹤的粪便，也可以为雌二醇睾酮标准品或者睾酮标准品。
取单只鹤的0.4g粪便样本于15ml离心管中，加入80％(体积百分含量)甲醇水溶液4ml，震荡5分钟，5000rpm离心3分钟，取2ml上清液于5ml离心管中。60°吹干，加0.2ml 10％(体积百分含量)甲醇水溶液与0.2ml正己烷于离心管中充分震荡溶解，5000rpm离心3分钟，取下层清液75μL作为待测样本进行检测。
2)检测
将上述待测样本取75μl分别滴加于上述三所示试剂盒中的雌二醇胶体金试纸条的样品垫上和睾酮胶体金试纸条的样品垫上，5-8min内判定结果。
根据T线、C线的显色情况判断待测鹤是雄性还是雌性。
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为雄性；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为雄性；
若睾酮胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测。
实施例2、检测鹤性别的试剂盒的灵敏性
1、雌二醇胶体金试纸条的灵敏性
以不同浓度的雌二醇标准品作为待测样本：用pH 7.4、浓度为0.2mol/L PBS缓冲液将雌二醇标准品分别稀释到0、20、50、100ng/ml进行检测。
将上述待测样本取75μl滴加于实施例1制备的雌二醇胶体金试纸条的样品垫上，5-8min内判定结果。
根据T线、C线的显色情况判断待测鹤是雄性还是雌性。
若雌二醇胶体金试纸条的有T线和C线，则待测鹤为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条的有C线且无T线，则待测鹤不为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测；
结果如图2所示，可以看出，该产品检测雌二醇的灵敏度可达100ng/ml。
选择如下不同的抗原浓度(划膜浓度)和不同的标记胶体金抗体溶液浓度(喷金浓度)按照实施例1的方法制备雌二醇胶体金试纸条。
按照实施例1的方法，分别检测在T线达到同样色度的情况下雌二醇的检出限，结果如表2所示，可以看出，本发明实施例1中速测卡的灵敏度最高结果如下表2所示：
表2
抗原浓度 标记胶体金抗体溶液浓度 雌二醇检出限
实施例1 1mg/ml 0.4mg/ml 10ng/ml
对比例 0.2mg/ml T线达不到所需色度 ——
对比例 0.5mg/ml 1.2mg/ml 23ng/ml
对比例 0.75mg/ml 0.7mg/ml 17ng/ml
对比例 1.5mg/ml 0.3mg/ml 16ng/ml
对比例 2mg/ml 0.25mg/ml 20ng/ml
2、睾酮胶体金试纸条的灵敏性
以不同浓度的睾酮标准品作为待测样本：用pH 7.4、浓度为0.2mol/L PBS缓冲液将睾酮标准品分别稀释到0、10、20ng/ml进行检测。
将上述待测样本取75μl滴加于实施例1制备的睾酮胶体金试纸条的样品垫上，5-8min内判定结果。
根据T线、C线的显色情况判断待测鹤是雄性还是雌性。
若睾酮胶体金试纸条的有T线和C线，则待测鹤为雄性；
若睾酮胶体金试纸条的有C线且无T线，则待测鹤不为雄性；
若睾酮胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测；
结果如图3所示，可以看出，该产品检测睾酮的灵敏度可达20ng/ml。
选择如下不同的抗原浓度(划膜浓度)和不同的标记胶体金抗体溶液浓度(喷金浓度)按照实施例1的方法制备睾酮胶体金试纸条。
按照实施例1的方法，分别检测在T线达到同样色度的情况下睾酮的检出限，结果如表3所示，可以看出，本发明实施例1中睾酮胶体金试纸条的灵敏度最高结果如下表3所示：
表3
抗原浓度 标记胶体金抗体溶液浓度 睾酮检出限
实施例1 1mg/ml 0.4mg/ml 20ng/ml
对比例 0.2mg/ml T线达不到所需色度 ——
对比例 0.5mg/ml 1.2mg/ml 50ng/ml
对比例 0.75mg/ml 0.7mg/ml 35ng/ml
对比例 1.5mg/ml 0.3mg/ml 33ng/ml
对比例 2mg/ml 0.25mg/ml 40ng/ml
实施例4、试纸条在检测鹤性别中的应用
1、待测样本的制备
取单只鹤的0.4g粪便样本于15ml离心管中，加入80％(体积百分含量)甲醇水溶液4ml，震荡5分钟，5000rpm离心3分钟，取2ml上清液于5ml离心管中。60°吹干，加0.2ml 10％(体积百分含量)甲醇水溶液与0.2ml正己烷于离心管中充分震荡溶解，5000rpm离心3分钟，取下层清液75μL作为待测样本进行检测。
将上述待测样本取75μl分别滴加于实施例1制备的雌二醇胶体金试纸条的样品垫上和睾酮胶体金试纸条的样品垫上，5-8min内判定结果。
根据T线、C线的显色情况判断待测鹤是雄性还是雌性。
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为雄性；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为雄性；
若睾酮胶体金试纸条无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测。
胶体金试纸条结果如图4、图5(5A为睾酮胶体金试纸条结果，5B为雌二醇胶体金试纸条结果)和表4所示：
表4为胶体金试纸条
Figure BDA0002192472100000091
Figure BDA0002192472100000101

Claims (10)

1.一种检测鹤性别的试剂盒，包括单独包装的雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条；
所述雌二醇胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记雌二醇抗体的金标垫、含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜、和吸水垫，所述雌二醇检测线T由雌二醇抗原或其溶液形成；
所述睾酮胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记睾酮抗体的金标垫、含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜、和吸水垫，所述睾酮检测线T由睾酮抗原或其溶液形成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述雌二醇抗体为雌二醇单克隆抗体；
或，所述睾酮抗体为睾酮单克隆抗体；
或，所述雌二醇抗原为E2抗原，
或，所述睾酮抗原为T抗原。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述包被有胶体金标记雌二醇抗体的金标垫为将胶体金标记雌二醇抗体溶液喷于金标垫上形成；
所述包被有胶体金标记睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记睾酮抗体溶液混匀后喷于金标垫上形成；
或，所述胶体金标记雌二醇抗体溶液的浓度为0.4mg/ml；
或，所述胶体金标记睾酮抗体溶液的浓度为0.4mg/ml。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述E2抗原溶液的浓度为1.0mg/mL；
或，所述T抗原溶液的浓度为1.0mg/mL。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；
或，所述IgG抗体溶液的浓度具体为1mg/ml。
6.一种制备权利要求1-5中任一所述的试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)制备雌二醇胶体金试纸条和睾酮胶体金试纸条；
所述制备雌二醇胶体金试纸条的方法包括如下步骤：制备包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫和制备含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜；再将所述包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫、样品垫、所述含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到雌二醇胶体金试纸条；
所述包被有胶体金标记的雌二醇抗体的金标垫为将胶体金标记的雌二醇抗体喷于金标垫上，得到的；
所述含有雌二醇检测线T和雌二醇质控线C的硝酸纤维素膜为将浓度为1.0mg/mLE2抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T线作为检测线，且将浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗溶液在所述硝酸纤维素膜上划C线作为质控线，得到的；
所述制备睾酮胶体金试纸条的方法包括如下步骤：制备包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫和制备含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜；再将所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫、样品垫、所述含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到所述睾酮胶体金试纸条；
所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记的睾酮抗体喷于金标垫上，得到的；
所述包被有胶体金标记的睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记的T抗体喷于金标垫上，得到的；
所述含有睾酮检测线T和睾酮质控线C的硝酸纤维素膜为将浓度为1.0mg/mLT抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T线作为检测线，且将浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗溶液在所述硝酸纤维素膜上划C线作为质控线，得到的；
2)将所述雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条单独包装，得到权利要求1-5中任一所述的试剂盒。
7.权利要求1-5中任一中的所述试剂盒或所述试剂盒中雌二醇胶体金试纸条和/或睾酮胶体金试纸条的在制备检测或辅助检测鹤性别产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
9.一种检测或辅助检测鹤性别的方法，包括如下步骤：
1)用有机溶液对待测鹤的粪便进行提取，得到提取液；
2)用权利要求1-5中任一所述试剂盒中的所述雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条检测所述提取液；
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为或候选为雌性；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为或候选不为雌性；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测鹤为或候选为雄性；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测鹤不为或候选不为雄性。
10.一种检测或辅助检测待测样品中是否含有雌二醇和/或睾酮的方法，包括如下步骤：用权利要求1-5中任一所述试剂盒中的所述雌二醇胶体金试纸条和所述睾酮胶体金试纸条检测待测样本；
若雌二醇胶体金试纸条有T线和C线，则待测样本中含有或候选含有雌二醇；
若雌二醇胶体金试纸条有C线且无T线，则待测样本中不含有或候选不含有雌二醇；
若睾酮胶体金试纸条有T线和C线，则待测样本中含有或候选含有睾酮；
若睾酮胶体金试纸条有C线且无T线，则待测样本中不含有或候选不含有睾酮。
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