CN105181915B - 一种植物油中污染物快速免疫检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物油中污染物快速免疫检测的方法和应用，所述检测方法包括：1）将污染物的抗体包被在纳米金或量子点或荧光微球上，并用亲水性聚合物在抗体周围形成亲水性保护层；2）根据植物油中污染物限量要求，将植物油与纯净水或提取溶液按照一定比例混合；3）剧烈振荡10‑60秒，使植物油和纯净水或提取溶液充分混合均匀；4）不必分离油相，直接将混合液滴到免疫层析检测卡的加样孔上，或直接用免疫层析检测试纸蘸取混合液，进行检测；以及该快速免疫检测方法在植物油中污染物检测中的应用。本发明不需要使用有机溶剂，不需要分离油相，在油水混合体系中直接使抗体与污染物反应，因此操作更简单、方便，检测时间更短。

Description

一种植物油中污染物快速免疫检测方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种植物油中污染物快速免疫检测方法和应用。

背景技术

植物油中的污染物主要来自于原材料、生产过程、包装材料中的污染。例如植物油中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素以及农药残留主要来自于受污染的榨油原料；植物油中的苯并(α)芘主要来自于榨油工序的原料炒制过程；而邻苯二甲酸酯类化合物、双酚A等主要来自于生产过程的塑料器皿或塑料包装材料。我国现行食用油国家标准《食用植物油卫生标准》(GB2716-2005)规定花生油、玉米胚油黄曲霉毒素B1残留限量为20μg/kg，其它油中黄曲霉毒素B1残留限量为20μg/kg；苯并(α)芘残留限量为10μg/kg；农药残留按照GB2763的规定执行。

现有检测植物油中污染物的方法必须经过一个比较复杂的样品前处理过程。典型步骤包括：1)用极性有机溶剂与植物油振荡混合；2)静置或离心，使极性有机溶剂与植物油分离；3)取极性有机溶剂相，加入非极性有机溶剂，除去其中残余油脂；4)用旋转蒸发仪、或氮吹仪将除去油脂的极性有机溶剂相蒸干或吹干；5)用水、缓冲溶液、或有机试剂将残余物复溶，用色谱或免疫方法、或其它方法进行检测。显然，现有植物油中污染物检测方法存在操作复杂、样品处理时间长、需要用大量有机溶剂、需要配套样品前处理仪器等缺陷，难以实现现场快速检测。

直接在油水混合体系中进行免疫检测的研究至今未见报道。其原因在于在油水混合体系中，非极性的油脂会与抗体蛋白或目标化合物的非极性部分结合，从而改变蛋白构象，干扰抗原、抗体反应。

相关文献可参见：

1)D.Zhang,P.Li,Y.Yang,Q.Zhang,W.Zhang,Z.Xiao and X.Ding,Talanta,2011,85,736-742.

2)Bao L.；Liang C.；Trucksess M.W.；Xu Y.；Lv N.；Wu Z.；Jing P.；Fry F.S.JAOAC Int 2012,95(6),1689-1700.

3)鲍蕾；吕宁；吴振兴；静平；许艳丽；王彦斐；王丽；王江；果旗；王雄.粮食科技与经济2012(05),16-18.

4)《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》(GB/T 18979-2007)

5)《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》(GB/T23504-2009)

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种不需要分离油相、直接用免疫试剂在油水混合物体系中快速检测食用油中污染物的检测方法和应用，该检测方法是通过对包被在纳米金、量子点、荧光微球、磁性微球等标记材料上的污染物抗体进行亲水性保护实现的。所谓对抗体进行亲水性保护，是指将抗体按一定量包被在上述标记材料上以后，在材料上再结合一层亲水性聚合物，使抗体处于水化层保护中。本发明可以实现在油水混合物中免疫检测的原因在于1)标记材料表面的水化层阻止了油脂靠近抗体，从而保护了抗体活性；2)油脂中的污染物根据分配定律，会有一部分通过扩散进入水相，在油水充分混合的条件下，很快达到平衡，在水相中的污染物会扩散到抗体表面，与抗体发生免疫反应。

与现有植物油中污染物检测方法相比，本方法操作更简单、检测更方便、检测时间更短，无需有机溶剂、经济环保，无需其他辅助样品处理设备，适合现场检测。

针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种植物油中污染物检测方法，包括以下步骤：

1)根据污染物在植物油中的残留限量，按适当的重量体积比将植物油与纯净水或提取溶液混合；

2)然后，剧烈振荡10-60秒，使植物油和纯净水或提取溶液充分混合均匀；

3)再然后，直接将混合液滴到免疫层析检测卡的加样孔上，或直接用免疫层析检测试纸蘸取混合液，反应3-5分钟。

4)最后，直接观察检测卡或检测试纸T线和C线出现情况，定性判断植物油中污染物是否超标；也可以利用检测卡/检测试纸读数仪，根据T线和C线显色情况，定量检测植物油中污染物残留量。

另一方面，本发明还提供一种本发明在用于植物油中污染物残留检测中的应用。

优选地，所述植物油中污染物残留检测包括植物油中黄曲霉毒素、苯并(α)芘、农药残留、邻苯二甲酸酯类化合物、玉米赤霉烯酮、双酚A、呕吐毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素等的检测。

在发明内容中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式部分中进一步详细说明。本发明内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。

以下结合附图，详细说明本发明的优点和特征。

附图说明

本发明的下列附图在此作为本发明的一部分用于理解本发明。附图中示出了本发明的实施方式及其描述，用来解释本发明的原理。在附图中，

图1为抗体亲和性保护的原理示意图；其中，1为纳米金、量子点、荧光微球、磁性微球等标记材料，2为污染物抗体，3为亲水性聚合物，4为由亲水性聚合物形成的标记性材料表面水化层。

图2为免疫层析检测卡结构示意图；其中，5为样品垫，6为金标垫，7为T线，8为C线，9为塑料底板，10为硝酸纤维素膜，11为吸水纸

图3为检测植物油中苯并(α)芘时，当油水重量体积比为1:4时，本发明检测方法对植物油中苯并(α)芘的检测标准曲线。图中横坐标为苯并(α)芘浓度(μg/Kg)，纵坐标为T线相对荧光值(T％)的自然对数。

具体实施方式

在下文的描述中，提供了大量的细节以便能够彻底地理解本发明。然而，本领域技术人员可以了解，如下描述仅涉及本发明的较佳实施例，本发明可以无需一个或多个这样的细节而得以实施。此外，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

实施例1

1)取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH值为7.5，向溶液中加入浓度为3μg/mL的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，反应30分钟后，加入含亲水性聚合物PV－3的封闭缓冲液，继续反应30分钟。标记与封闭完成后，如附图1所示，纳米金表面形成保护抗体的水化层。经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用纳米金稀释液将标记有抗体的纳米金重悬。用喷金划膜仪将重悬后的纳米金以1.5μL/cm速度喷到玻璃纤维素膜上；然后室温真空干燥20小时，制成金标垫；用喷金划膜仪以0.8μL/cm速度将AFB1-BSA偶联蛋白(0.04mg/mL)及羊抗鼠抗体(0.2mg/mL)分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线位置，37℃干燥4小时，制成抗原包被膜；将玻璃纤维素膜浸在样品垫处理液(溶液组成：0.1M pH 8.0TRIS-HCL缓冲液，含0.5％BSA，2％Brij－35,0.03％Proclin-300)中，2秒钟后取出，37℃干燥4小时，制成样品垫；按照本领域公知的方法，将金标垫、抗原包被膜、样品垫组装成黄曲霉毒素B1免疫层析检测卡。室温保存备用。

2)按1:1的重量体积比将植物油与纯净水混合。

3)然后，剧烈振荡10-60秒，使植物油和纯净水充分混合均匀；

4)再然后，直接将混合液滴到黄曲霉毒素B1免疫层析检测卡的加样孔上，反应3分钟。

5)最后，直接观察如图2所示检测卡T线和C线出现情况，当样品中黄曲霉毒素B1含量小于1.5μg/Kg时，检测卡T线、C线位置均有红色金线出现；当样品中黄曲霉毒素B1含量大于1.5μg/Kg时，检测卡T线位置没有红色金线出现。因此，可以根据检测卡T线是否出现判定样品中黄曲霉毒素含量是否大于1.5μg/Kg。

实施例2

1)黄曲霉毒素B1免疫层析检测卡制备方法同实施例1

2)按1:4的重量体积比将不同植物油样品与纯净水混合。

3)然后，剧烈振荡10-60秒，使植物油和纯净水充分混合均匀；

4)再然后，直接将混合液滴到黄曲霉毒素B1免疫层析检测卡的加样孔上，反应3分钟。

5)最后，直接观察检测卡T线和C线出现情况，T线位置出现红色金线，记为阴性，即油样中黄曲霉毒素B1含量小于2μg/Kg，T线位置不出现红色金线，记为阳性，即油样中黄曲霉毒素B1含量大于2μg/Kg。

6)同时，利用国标方法《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》(GB/T 18979-2007)的免疫亲和层析净化高效液相色谱法对测定上述植物油样品中黄曲霉毒素B1含量。两种检测结果的对比如表1所示.。结果表明。本发明所述检测方法对植物油样品中黄曲霉毒素B1的检测结果与国标方法相符，具有良好的准确性。

表1、本发明所述检测方法对植物油样品中黄曲霉毒素B1的检测结果与国标方法的对比

样品类型及编号	国标方法(μg/Kg)	本发明方法(μg/Kg)
			花生油1号	<0.5	阴性
花生油2号	<0.5	阴性
			花生油3号	1.11	阴性
花生油4号	2.96	阳性
			花生油5号	2.00	阳性
花生油6号	0.66	阴性
			玉米油1号	<0.5	阴性
玉米油2号	<0.5	阴性

大豆调和油1号	<0.5	阴性
			大豆调和油2号	<0.5	阴性

实施例3

1)取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH值为7.5，向溶液中加入浓度为5μg/mL的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，反应30分钟后，加入含亲水性聚合物PV－3的封闭缓冲液，继续反应30分钟。标记与封闭完成后，如附图1所示，纳米金表面形成保护抗体的水化层。经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用纳米金稀释液将标记有抗体的纳米金重悬。用喷金划膜仪将重悬后的纳米金以1.5μL/cm速度喷到玻璃纤维素膜上；然后室温真空干燥20小时，制成金标垫；用喷金划膜仪以0.8μL/cm速度将ZEN-BSA偶联蛋白(0.2mg/mL)及羊抗鼠抗体(0.4mg/mL)分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线位置，37℃干燥4小时，制成抗原包被膜；将玻璃纤维素膜浸在样品垫处理液(溶液组成：0.1M pH 7.6磷酸盐缓冲液，含0.5％BSA，2％Tween－20,0.03％Proclin-300)中，2秒钟后取出，37℃干燥4小时，制成样品垫；按照本领域公知的方法，将金标垫、抗原包被膜、样品垫组装成玉米赤霉烯酮免疫层析检测卡。室温保存备用。

2)按1:6的重量体积比将不同玉米油样品与表面活性剂溶液(0.2％脂肪醇聚氧乙烯醚溶液)混合。

3)然后，剧烈振荡10-60秒，使玉米油和表面活性剂溶液充分混合均匀；

4)再然后，直接将混合液滴到玉米赤霉烯酮免疫层析检测卡的加样孔上，反应3分钟。

5)最后，直接观察检测卡T线和C线出现情况，T线位置出现红色金线，记为阴性，即油样中玉米赤霉烯酮含量小于200μg/Kg，T线位置不出现红色金线，记为阳性，即油样中玉米赤霉烯酮含量大于200μg/Kg。

6)同时，利用国标方法《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》(GB/T 23504-2009)测定上述玉米油样品中玉米赤霉烯酮含量。两种检测结果的对比如表2所示.。结果表明。本发明所述检测方法对玉米油样品中玉米赤霉烯酮的检测结果与国标方法相符，具有良好的准确性。

表2、本发明所述检测方法对玉米油样品中玉米赤霉烯酮的检测结果与国标方法的对比

样品类型及编号	国标方法(μg/Kg)	本发明方法(μg/Kg)
			玉米油1号	86.2	阴性
玉米油2号	41.8	阴性
			玉米油3号	128.1	阴性
玉米油4号	20.1	阴性
			玉米油5号	631.6	阳性

实施例4

1)取平均粒径为80nm的羧基修饰量子点的溶液，用EDC/NHS活化30分钟，向溶液中加入浓度为1μg/mL的苯并(α)芘单克隆抗体，反应60分钟后，加入含蛋白BSA、OVA、KLH的封闭缓冲液，继续反应60分钟。标记与封闭完成后，如附图1所示，量子点表面形成保护抗体的水化层。经4℃、12000r/min离心30分钟后，去除上清，然后用量子点稀释液将标记有抗体的量子点重悬。用喷金划膜仪将重悬后的量子点以1.5μL/cm速度喷到玻璃纤维素膜上；然后室温真空干燥20小时，制成量子点垫；用喷金划膜仪以0.8μL/cm速度将BaP-BSA偶联蛋白(0.1mg/mL)及羊抗鼠抗体(0.4mg/mL)分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线位置，37℃干燥4小时，制成抗原包被膜；将玻璃纤维素膜浸在样品垫处理液(溶液组成：0.05M pH 7.4磷酸盐缓冲液，含0.1％曲拉通X－100，2％Brij－35,0.03％Proclin-300)中，2秒钟后取出，37℃干燥4小时，制成样品垫；按照本领域公知的方法，将量子点垫、抗原包被膜、样品垫组装成苯并(α)芘免疫层析检测卡。室温保存备用。

2)按1:4的重量体积比将不同植物油样品与表面活性剂溶液(含0.5％NP－40和0.1％Rhodasurf ON-870)混合。

3)然后，剧烈振荡10-60秒，使植物油和表面活性剂溶液充分混合均匀；

4)再然后，直接将混合液滴到苯并(α)芘免疫层析检测卡的加样孔上，反应3分钟。

5)最后，用量子点读数仪检测卡T线和C线荧光值，得到T线相对荧光值(T％)，带入内置苯并(α)芘定量曲线，计算样品中苯并(α)芘含量。苯并(α)芘定量标准曲线如图3所示。

综合实施例1-4，可见本发明的优势和特点在于：

1)通过在抗体周围用水化层保护的设计，使油脂无法靠近抗体，因此不需要分离油相，可以直接在油水混合物中进行免疫反应。

2)由于上述特点，使得本方法可以避免传统方法繁琐的样品提取净化过程，操作更加简单。

3)由于操作简单，本方法消耗的检测时间相比类似方法更短。

4)本方法不用有机溶剂，因此更加环保，且节省检测费用。

5)本方法既可以用于植物油中污染物的定性检测，也可以用于定量检测。

6)本方法虽然只列举了针对植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、苯并(α)芘三种污染物的检测实例，但是由于三种污染物分别为弱极性、非极性、强非极性，因此可以证明本方法具有广泛的适应性。

本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。

Claims (4)

1.一种植物油中污染物快速免疫检测方法，所述方法不需要分离油相、不需要有机溶剂、可直接用免疫试剂在油水混合物体系中进行检测，提取溶液为低浓度酸、碱溶液、添加了表面活性剂的缓冲溶液、表面活性剂的水溶液，其包括以下步骤：

1)根据污染物在植物油中的残留限量，按适当的重量体积比将植物油与水或提取溶液混合；

2)然后，剧烈振荡10-60秒，使植物油和水或提取溶液充分混合均匀；

3)再然后，直接将混合液滴到免疫层析检测卡的加样孔上，或直接用免疫层析检测试纸蘸取混合液，反应3-5分钟；

4)最后，直接观察检测卡或检测试纸T线和C线出现情况，定性判断植物油中污染物是否超标；也可以利用检测卡/检测试纸读数仪，根据T线和C线显色情况，定量检测植物油中污染物残留量，所述检测卡或检测试纸中包含有包被在标记材料上的污染物抗体；抗体处于亲水性保护中，所述亲水性保护是指将抗体按照一定量包被在标记材料上以后，在材料上再结合一层亲水性聚合物，亲水性聚合物包括BSA蛋白、OVA蛋白、KLH蛋白中的一种或几种；所述标记材料是纳米金、量子点、荧光微球或磁性微球。

2.根据权利要求1所述的植物油中污染物快速免疫检测方法，其特征在于，将植物油和水或提取溶液充分混合均匀后，不必将油相分离去除，直接对油水混合物检测即可。

3.根据权利要求1所述的植物油中污染物快速免疫检测方法，其特征在于，所述的表面活性剂类型为：Tween-20，Tween-60，Tween-80，TritonX-100，Brij-35，NP-40，Tetronic1307，RhodasurfON-870，十二烷基二甲基甜菜碱或脂肪醇聚氧乙烯醚。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述植物油中污染物检测包括对黄曲霉毒素、苯并(α)芘、农药残留、邻苯二甲酸酯类化合物、玉米赤霉烯酮、双酚A、呕吐毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素的检测，所述苯并(α)芘检测所用标记材料为量子点。