CN106119390A - 一种基于mgb探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测方法，试剂盒包括用于实时荧光定量PCR检测的PCR反应液，所述PCR反应液包括驴和马ckm基因通用性引物ckm‑F/ckm‑R，驴MGB探针MGB‑Lv，马MGB探针MGB‑Ma，质控引物，质控探针，Taq DNA聚合酶，无水D‑(+)‑海藻糖；KCl；MgCl2；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白；ROX参比染料。本发明创新性使用MGB探针技术，MGB探针与模板DNA能够完全结合，因而稳定性更好，结果更准确；此外，本试剂盒通过优化反应液成分，降低对检测人员的技术素质要求，简化实际操作步骤，更便于阿胶生产企业的实际应用。

Description

一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测方法。
背景技术
《中华人民共和国药典》(2010)规定阿胶为马科动物驴(Equus asinus L.)的干皮或鲜皮经煎煮、浓缩而制成的。阿胶具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，是重要的国家级非物质文化遗产，千百年来一直深受历代医家和广大百姓的青睐。然而近年来，我国驴存栏量逐年下滑，导致各大阿胶企业均饱受驴皮资源紧缺之困，各地均出现了用其他动物皮熬制的伪品。采用杂皮、骨胶等熬制的胶类假药不仅临床效果差，而且还可能出现中毒现象。因此阿胶生产企业在收购阿胶原料驴皮时，需要对皮张进行物种鉴定，防止其他动物皮冒充驴皮。国内市场上常见的驴皮伪品有马皮、骡子皮、牛皮、小水牛皮、小黄牛皮、绵羊皮、山羊板皮等，但以马皮、骡子皮、牛皮混入者较多。驴皮中混入的牛皮、小水牛皮、小黄牛皮等皮张在外观上与驴皮相差较大，用传统方法即可鉴别出，相对较为容易；而马、骡子与驴的亲缘关系较近，这三种动物的干皮张外表非常相似，仅凭肉眼难以鉴别，尤其是在除去毛发并剪成小块后，仅凭肉眼是无法鉴别的，因此，阿胶原料的真伪鉴别成为阿胶生产中迫切需要解决的技术难题。当前，鉴定驴皮、马皮和骡子皮较为前沿的技术为DNA鉴定技术。DNA鉴定主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。
经过对现有技术的检索发现，公开号为102608117A的专利公布了一种宏观观察法和显微镜观察法鉴定驴皮的方法，但该方法具有一定的主观性，且无法鉴定去除毛发的动物皮张。公开号为105223291A的专利公开了一种利用液质联用技术鉴定驴皮的方法，但该方法无法区分马皮和马骡皮。申请号为201510623447.9的专利公开了一种检测及鉴别驴、马或牛皮气味成分的方法及其鉴别标准，但该方法无法鉴别骡子皮，而骡子皮是掺假较多的动物皮张之一。上述3项专利所公布的方法属于传统鉴定方法，所用技术较为滞后，均存在一定的局限性，达不到阿胶生产企业对驴皮、马皮、骡子皮进行鉴定的技术要求。公开号为CN1605868A的专利公布了一种通过细胞色素B基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法制备的DNA指纹图谱来鉴定驴皮的方法，但该方法不能对骡与驴或骡与马进行区分。公开号为CN104046700A的专利将线粒体16SrRNA基因和CKM核基因两者相结合，使用分子信标探针(MB)技术进行5重多色荧光定量PCR同时检测驴、马、马骡及驴骡四种成分。对于本领域技术人员而言，5重多色荧光定量PCR难度较大，不同引物探针之间产生的错配容易导致假阳性结果，且5条分子信标导致检测成本较高；另一方面，阿胶生产企业实际检测需求是对驴、马、骡三种动物皮张进行区分，无需区分马骡和驴骡，该专利在实际应用中过于繁琐。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明从阿胶企业生产实际需求出发，根据驴和马CKM核基因的碱基差异，利用MGB探针技术对差异碱基进行区分，无需分析多个基因，从而达到快速准确鉴定驴皮、马皮和骡子皮的目的。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，所述试剂盒中包括用于实时荧光定量PCR检测的PCR反应液。
具体的，所述PCR反应液包括驴和马ckm基因通用性引物ckm-F/ckm-R，驴MGB探针MGB-Lv，马MGB探针MGB-Ma，质控引物和质控探针；
其中，所述驴和马ckm基因通用性引物序列为：
ckm-F：5‘-CAAGCTCTCCTAAACACCTATC-3‘；
ckm-R：5‘-CTGACCTAAAGCCTACGTA-3‘；
所述驴MGB探针序列为：
MGB-Lv：5‘-AGCCATTCATTACGCCT-3‘；
所述马MGB探针序列为：
MGB-Ma：5‘-CGTTACCGTTACATAC-3‘；
所述质控引物序列为：
16SRNA-F：5‘-ACCTGAAACTAGAACTGACTT-3‘；
16SRNA-R：5‘-GCTTCAATGGGTCCAATGTGAC-3‘；
所述质控探针序列为：
16SRNA-P：5‘-CTTGAATCCTGACGTCTGGCT-3‘；
进一步的，所述PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶，无水D-(+)-海藻糖；Tris-HCl；KCl；MgCl2；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白(BSAV)；ROX参比染料；
进一步的，所述驴MGB探针5‘端修饰FAM荧光基团，3‘端修饰MGB基团；
进一步的，所述马MGB探针5‘端修饰HEX荧光基团，3‘端修饰MGB基团；
进一步的，所述质控探针5‘端修饰JOE荧光基团，3‘端修饰Dabcyl基团；
进一步的，所述驴和马ckm基因通用性引物序列浓度均为250nM；所述驴和马的MGB探针浓度均为500nM；所述质控引物浓度均为250nM；所述质控探针浓度为500nM；所述TaqDNA聚合酶活性浓度为：0.05U/μL；所述无水D-(+)-海藻糖浓度为8％；所述Tris-HCl浓度为20mM，pH为8.3；所述KCl浓度为100mM；所述MgCl2浓度为7mM；所述dNTPs浓度为0.4mM；所述甘油体积分数为20％(v/v)；所述牛血清白蛋白浓度为1μgμL-1；所述ROX参比染料浓度为1μM；
一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用市售动物基因组DNA提取试剂盒提取待检样品DNA；
(2)配置扩增反应体系；
(3)将步骤(2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环；
(4)结果判定：Ct值≤36为阳性反应，Ct值＞36为阴性反应，按下表对结果进行判定：
进一步的，所述步骤(2)中扩增反应体系包括：PCR反应液10μL，所述步骤(1)制备样品DNA2μL，使用无菌水补足至20μL；同时设置用无菌水代替DNA的空白对照，以监测反应是否被污染。
本发明的原理是：驴与马同属马科动物，亲缘关系较近，其CKM核基因序列一致性高达99.6％以上，普通Taqman探针难以进行区分。本申请创造性的选用MGB探针进行检测，MGB探针在3‘端有MGB基团，可以提高探针的Tm值，与普通TaqMan探针相比，MGB探针可以设计的更短，具有更低的荧光背景、更高的信噪比，MGB探针与模板的单碱基不匹配即可抑制两者的结合，因而是检测单核苷酸多态性(SNP)的理想手段；同时，使用MGB探针既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。基于此，本发明利用MGB探针技术对驴和马CKM基因上不同碱基进行区分，结合骡子与驴和马的遗传关系，从而对驴、马、骡进行准确鉴定。
具体的，如前所述，本探针试剂盒包含的关键引物与探针为1对驴和马CKM核基因通用引物(扩增序列大小为121bp)，2条驴和马MGB探针，另外还包括哺乳动物16sRNA基因保守区的扩增引物与Taqman探针，以作为内源性质控探针来监测样品DNA提取的质量。根据驴马骡的遗传关系，骡子体内同时含有驴和马的CKM核基因，因此，当检测样本中只有驴CKM核基因为阳性时为驴皮，只有马CKM核基因为阳性时为马皮，驴和马CKM核基因同时为阳性时则为骡子皮，加入的质控引物与探针可以对样品DNA质量进行监控，以排除假阴性的干扰。同时，由于动物组织成分更为复杂，提取的DNA溶液中容易掺杂难以去除的PCR抑制成分因而容易导致结果呈现假阴性。申请人通过大量实验分析最终确定在本申请中联合使用BSAV(牛血清白蛋白)和无水D-(+)-海藻糖可对样本DNA中存在的抑制剂发挥较强的耐抑制性，有效避免因提取DNA样品中掺杂难以去除的PCR抑制成分而导致结果呈现假阴性。因此检测人员使用市售动物基因组DNA提取试剂盒来提取样品DNA即可，无需使用特殊方法，方便无专业背景知识的人员使用。
本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对检测方法和仪器检测条件进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
1、创新性使用MGB探针技术，所述MGB探针与模板DNA能够完全结合，因而稳定性更好，结果更准确；克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点，此外，本试剂盒通过优化反应液成分，降低了对检测人员的技术素质要求，简化了实际操作步骤，而且不需要特殊的试剂和昂贵仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系；
2、本发明中使用3重复合实时荧光PCR，对驴马骡鉴定的检测极限为0.05ng，检测极限极低，更适合阿胶生产企业的实际应用；
3、本发明公布的方法适用于3通道及以上的荧光定量仪，对仪器要求低，因而适用的范围更广，通用性更好。
总之，本发明所述试剂盒及检测方法具有测定准确、操作简单方便、快速准确、重复性好、灵敏度高、对检测人员技术素质要求低、不需要特殊的试剂和昂贵仪器设备，更有利于于阿胶生产企业的实际应用。
附图说明
图1A：MGB-Lv探针检测极限测试；
图1B：MGB-Ma探针检测极限测试；
图2A：盲样测试，MGB-Lv为阳性，MGB-Ma为阴性，鉴定为驴皮；
图2B：盲样测试，MGB-Ma为阳性，MGB-Lv为阴性，鉴定为马皮；
图2C：盲样测试，MGB-Ma和MGB-Lv同时为阳性，鉴定为骡子皮；
图3A：试剂盒耐抑制性测试(MGB-Lv检测，未优化试剂盒)；
图3B：试剂盒耐抑制性测试(MGB-Lv检测，本发明试剂盒)；
图4A：试剂盒耐抑制性测试(MGB-Ma检测，未优化试剂盒)；
图4B：试剂盒耐抑制性测试(MGB-Ma检测，本发明试剂盒)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1试剂盒特异性测试
一种基于MGB探针法鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，所述试剂盒中包括用于实时荧光定量PCR检测的PCR反应液。
具体的，所述PCR反应液包括：驴和马ckm基因通用性引物ckm-F/ckm-R，驴MGB探针MGB-Lv，马MGB探针MGB-Ma，质控引物，质控探针，Taq DNA聚合酶，无水D-(+)-海藻糖；KCl；MgCl2；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白；ROX参比染料；
其中，驴和马ckm基因通用性引物序列为：
ckm-F：5‘-CAAGCTCTCCTAAACACCTATC-3‘
ckm-R：5‘-CTGACCTAAAGCCTACGTA-3‘
浓度各为250nM；
MGB-Lv序列为：
MGB-Lv：5‘-AGCCATTCATTACGCCT-3‘
5‘端修饰FAM荧光基团，3‘修饰MGB基团，浓度为500nM
MGB-Ma序列为：
MGB-Ma：5‘-CGTTACCGTTACATAC-3‘
5‘端修饰HEX荧光基团，3‘修饰MGB基团，浓度为：500nM
质控引物序列为：
16SRNA-F：5‘-ACCTGAAACTAGAACTGACTT-3‘
16SRNA-R：5‘-GCTTCAATGGGTCCAATGTGAC-3‘
浓度各为250nM，
质控探针序列为：
16SRNA-P：5‘-CTTGAATCCTGACGTCTGGCT-3‘
5‘端修饰JOE荧光基团，3‘修饰Dabcyl基团，浓度为：500nM
Taq DNA聚合酶活性浓度为：0.05U/μL，
无水D-(+)-海藻糖浓度为8％；
Tris-HCl浓度为20mM，pH为8.3；
KCl浓度为100mM；
MgCl2浓度为7mM；
dNTPs浓度为0.4mM；
甘油体积分数为20％(v/v)；
牛血清白蛋白浓度为1μgμL-1；
ROX参比染料浓度为1μM。
使用市售动物基因组DNA提取试剂盒(D1700-50，Solarbio)分别提取驴、马、骡子、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉基因组DNA并将其浓度稀释为25ngμL-1，配置20μL实时荧光PCR反应体系，所述实时荧光PCR反应体系包括：PCR反应液10μL，各基因组DNA2μL，使用无菌水补足至20μL；
同时设置用无菌水代替DNA的空白对照，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。结果如表1，表明该试剂盒特异性较强，适用于驴皮、马皮和骡子皮的鉴定。
表1试剂盒特异性测试结果
注：“+”表示Ct值小于36，为阳性扩增；“-”表示Ct值大于36或无明显扩增，为阴性扩增。实施例2试剂盒检测极限测试
用市售动物基因组DNA提取试剂盒(D1700-50，Solarbio)分别提取驴皮、马皮、骡子皮基因组DNA，稀释至25ngμL-1作为原始DNA溶液，并依次梯度稀释至2.5ngμL-1、0.25ngμL-1、0.025ngμL-1、0.0025ngμL-1，则按照实施例1所述方法配置的PCR反应液中基因组DNA的量依次为50ng、5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng。PCR结果如图1A、B显示，随着基因组DNA量的降低，扩增曲线的Ct值依次减小，当目的DNA低至0.05ng时，MGB-LV对应的Ct值为35.31，MGB-MA对应的Ct值为35.42，接近阳性结果的极限；当基因组DNA继续降低至0.005ng时，Ct值在38以上或无明显扩增，表明该试剂盒对驴、马、骡的检测极限为0.05ng。
实施例3试剂盒实验室内重演性测试
为验证该试剂盒由不同人员使用时的重演性，邀请实验室内3位检测人员分别使用试剂盒对驴皮、马皮和骡子皮进行检测。使用动物基因组DNA提取试剂盒(D1700-50，Solarbio)提取驴皮马皮骡子皮基因组DNA。然后3位检测人员分别按照实施例1所述方法配置PCR反应扩增体系，同时设置用无菌水代替DNA的空白对照，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。结果如表2，3位检测人员所得Ct值的标准方差SD的范围为0.72-0.86，RSD范围为2.76％-2.84％，说明该试剂盒具有良好重演性。
表2试剂盒实验室内重演性测试结果
注：Ct Mean为样本Ct值平均值，Ct SD为Ct值的标准偏差，Ct RSD为Ct值的相对标准偏差。
实施例4试剂盒不同实验室间再现性测试
为验证该试剂盒在不同实验室间使用时的再现性，邀请3家实验室分别使用试剂盒对驴皮、马皮和骡子皮进行检测。使用动物基因组DNA提取试剂盒(D1700-50，Solarbio)对驴皮马皮骡子皮DNA进行提取。然后3家实验室分别按照实施例1配置PCR反应扩增体系，同时设置用无菌水代替DNA的空白对照，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。结果如表3，3家实验室所得Ct值的标准方差SD范围为0.60-0.84，RSD范围为2.16％-2.78％，说明该反应液在不同实验室间具有良好的再现性。
表3试剂盒不同实验室间再现性测试结果
注：Ct Mean为样本Ct值平均值，Ct SD为Ct值的标准偏差，Ct RSD为Ct值的相对标准偏差。
实施例5盲样检测
盲样的制备：由一位检测人员将4份驴皮、4份马皮、4份骡子皮各剪出一小块，混合后随机编号为盲样1-12，该检测人员知晓并记录盲样1-12成分，然后将12份盲样交由另一位检测人员使用本试剂盒进行鉴定。
盲样鉴定：用动物基因组DNA提取试剂盒提取12份样品的DNA，按照实施例1所述方法配置PCR反应扩增体系，同时设置用无菌水代替DNA的空白对照，进行PCR扩增反应。PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。PCR结果如图2和表4，鉴定结果与已知成分一致。
表4盲样的检测结果
实施例6试剂盒耐抑制性测试
将本试剂盒PCR反应液中去除8％无水D-(+)-海藻糖和1μgμL-1牛血清白蛋白这两种成分后的试剂盒定义为未优化试剂盒。
为验证本试剂盒对PCR抑制成分具有良好的耐受性，将PCR抑制剂hemin(氯高铁血红素)加入PCR反应中，同时进行未优化试剂盒检测和本试剂盒检测。
提取驴皮和马皮基因组DNA，分别使用未优化试剂盒和本试剂盒按实施例1分别配置PCR反应扩增体系，并向体系中加入hemin使其终浓度依次为0.01ngμL-1、0.1ngμL-1、1.0ngμL-1、10ngμL-1、50ngμL-1和100ngμL-1，以测试本试剂盒对PCR抑制剂的耐受性。PCR结果如图3、4所示，在GMB-Lv和GMB-Ma检测中，使用未优化试剂盒时，当hemin添加量为0.1ngμL-1时，Ct值分别为35.1和35.3，接近检测极限，当hemin添加量继续升高至1.0ngμL-1及以上时，PCR无明显扩增，反应被完全抑制，此时对hemin的耐抑制性为0.1ngμL-1；使用已优化的本试剂盒时，当hemin添加量为50ngμL-1时，Ct值分别为35.4和35.6，接近检测极限，当hemin添加量继续升高至100ngμL-1及以上时，PCR无明显扩增，反应被完全抑制，此时耐抑制性为50ngμL-1，优化后的本试剂盒与未优化试剂盒相比耐抑制性提高了500倍，效果显著。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括用于实时荧光定量PCR检测的PCR反应液。
2.如权利要求1所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括驴和马ckm基因通用性引物ckm-F/ckm-R，驴MGB探针MGB-Lv，马MGB探针MGB-Ma，质控引物和质控探针；
其中，所述驴和马ckm基因通用性引物序列为：
ckm-F：5‘-CAAGCTCTCCTAAACACCTATC-3‘；
ckm-R：5‘-CTGACCTAAAGCCTACGTA-3‘；
所述驴MGB探针序列为：
MGB-Lv：5‘-AGCCATTCATTACGCCT-3‘；
所述马MGB探针序列为：
MGB-Ma：5‘-CGTTACCGTTACATAC-3‘；
所述质控引物序列为：
16SRNA-F：5‘-ACCTGAAACTAGAACTGACTT-3‘；
16SRNA-R：5‘-GCTTCAATGGGTCCAATGTGAC-3‘；
所述质控探针序列为：
16SRNA-P：5‘-CTTGAATCCTGACGTCTGGCT-3‘。
3.如权利要求1或2所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶，无水D-(+)-海藻糖；Tris-HCl；KCl；MgCl2；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白；ROX参比染料。
4.如权利要求2所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述驴MGB探针5‘端修饰FAM荧光基团，3‘端修饰MGB基团。
5.如权利要求2所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述马MGB探针5‘端修饰HEX荧光基团，3‘端修饰MGB基团。
6.如权利要求2所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述质控探针5‘端修饰JOE荧光基团，3‘端修饰Dabcyl基团。
7.如权利要求2所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述驴和马ckm基因通用性引物序列浓度均为250nM；所述驴和马的MGB探针浓度均为500nM；所述质控引物浓度均为250nM；所述质控探针浓度为500nM。
8.如权利要求3所述的一种基于MGB探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶活性浓度为0.05U/μL；所述无水D-(+)-海藻糖浓度为8％；所述Tris-HCl浓度为20mM，pH为8.3；所述KCl浓度为100mM；所述MgCl2浓度为7mM；所述dNTPs浓度为0.4mM；所述甘油体积分数为20％(v/v)；所述牛血清白蛋白浓度为1μgμL-1；所述ROX参比染料浓度为1μM。
9.利用权利要求1～8任意一项所述试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用市售动物基因组DNA提取试剂盒提取待检样品DNA；
(2)配置扩增反应体系；
(3)将步骤(2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环；
(4)结果判定：Ct值≤36为阳性反应，Ct值＞36为阴性反应，按下表对结果进行判定：
10.如权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增反应体系包括：PCR反应液10μL，所述步骤(1)制备样品DNA2μL，使用无菌水补足至20μL；同时设置用无菌水代替DNA的空白对照。
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