CN106498049A - 一种用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用，涉及转基因检测技术领域。探针组合包括由根据转基因玉米中常见的外源基因Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS‑P0、EPSPS‑P2、P35S、T35S以及Nos‑3’设计出10种检测探针和根据玉米内源基因Ivr1设计的阳性探针，该探针组合分别与荧光编码微球偶联后，可用于检测出转基因玉米是否含有上述转基因成分，其具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量大的特点，且其对种子站、农科院所和边境口岸对转基因玉米检测具有重要作用。

Description

一种用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及转基因检测技术领域，具体而言，涉及一种用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用。
背景技术
目前，转基因玉米是目前全球最主要的转基因粮食作物之一。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)资料显示，从1996年到2015年的20年期间全球转基因作物累计种植面积达到空前的20亿公顷，相当于中国大陆总面积(9.56亿公顷)或美国总面积(9.37亿公顷)的2倍，其中转基因玉米占了30％。转基因农作物在全球市场的大量出现，在其环境和食品安全问题尚未完全确定的情况下，中国、欧盟等国家和组织要求对其进行标识。因此，快速、准确、灵敏和高通量的转基因产品检测技术是非常主要的。目前，在基因水平上检测转基因农作物的方法已经有很多，主要包括PCR(聚合酶链式反应)技术和基因芯片技术。但由于转基因农作物种类多、数量大，很多作为加工原料引进，经过处理后，转基因成分可能会降解，所以使检测难度变大，且现有的检测试剂盒单次检测能够检测出的转基因成分类别少。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于转基因玉米检测的探针组合，此探针组合可用于快速准确的检测出转基因玉米中的多种转基因成分，其具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
本发明的第二目的在于提供一种用于转基因玉米检测的液相芯片，其由上述探针组合分别与荧光编码微球偶联制成，此液相芯片可用于快速准确的检测出转基因玉米中的多种转基因成分，其具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
本发明的第三目的在于提供一种用于转基因玉米检测的试剂盒，此试剂盒包括上述液相芯片，此试剂盒快速准确的检测出转基因玉米中的多种转基因成分，具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
本发明的第四目的在于提供另一种用于转基因玉米检测的试剂盒，此试剂盒快速准确的检测出转基因玉米中的多种转基因成分，具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
本发明的第五目的在于提供上述用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种用于转基因玉米检测的探针组合，其包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阳性探针和检测探针，阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示，且检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种；或阳性探针的碱基序列为SEQID NO.33所示序列的反向互补序列，检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ IDNO.32所示序列的中的任一种的反向互补序列。
一种用于转基因玉米检测的液相芯片，其由上述的用于转基因玉米检测的探针组合分别与羟基化的荧光编码微球偶联混合制成。
一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其包括上述的用于转基因玉米检测的液相芯片。
一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其包括对照组和检测组，检测组包括第1-10检测组中的至少一个，对照组包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的阳性探针，每个检测组合均包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的检测探针，对照组的正向引物和反向引物其中之一和每个检测组的正向引物和反向引物其中之一的5’端带有生物素标记；
其中，第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的碱基序列分别如SEQ IDNO.1-11所示，第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的碱基序列分别如SEQ IDNO.12-22所示；
当第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的5’端带有生物素标记时，第1-10检测组和对照组的检测探针的碱基序列分别如SEQ ID NO.23-33所示；
当第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的5’端带有生物素标记时，第1-10检测组和对照组的检测探针的碱基序列分别为SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互补序列。
上述所述的用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用。
本发明提供的用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用有益效果是：本发明提供的用于转基因玉米检测的探针组合包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阳性探针和检测探针，阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示，且检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种。或者阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示序列的反向互补序列，检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种的反向互补序列。由于SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示的检测探针的序列针对转基因玉米常见的转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’进行特异性设计，上述5’端标记C12分子臂和氨基修饰的各探针能够与荧光编码微球偶联混合后，得到液相芯片，其与多重PCR扩增产物特异性结合，通过液相芯片的检测方法，可检测出样品中是否含有上述转基因成分。其中，阳性探针针对性检测的玉米内源基因Ivr1，作为阳性对照，以使检测结果更可靠，避免假阳性结果出现。总之，本发明的用于转基因玉米检测的探针组合具有灵敏度高、特异性强、单次可检指标多的特点，其对种子站、农科院所和边境口岸对转基因玉米检测具有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例5的检测结果；
图2为本发明实施例6的检测结果；
图3为本发明实施例7的检测结果；
图4为本发明实施例8的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片、试剂盒及其应用进行具体说明。
液相芯片是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。该技术主要通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应。这使它具有生物芯片的高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等优点，还具有液相反应的高敏感性、高重复性、检测线性范围宽、反应快速等优点，并且该方法操作简便、快捷、样品用量少。
基于此技术，发明人针对转基因玉米常见的转基因成分如Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等的保守序列以及玉米内源基因Ivr1的保守序列设进行计，得到了检测上述基因成分的11种探针。对于该11种探针形成的探针组合具体说明如下。
一种用于转基因玉米检测的探针组合，其包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阳性探针和检测探针，阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示，且检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种；或阳性探针的碱基序列为SEQID NO.33所示序列的反向互补序列，检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ IDNO.32所示序列的中的任一种的反向互补序列。
上述探针的5’端标记C12分子臂和氨基修饰，它们可分别与不同的荧光编码微球偶联、混合后制成液相芯片，进而可实现对Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’转基因成分的液相芯片检测。且在检测过程中，具有上述碱基序列的各探针之间不发生非特异性结合，确保探针能够与其对应的目标序列(对应的基因或对应基因的PCR产物)进行特异性结合，检测结果更加准确可靠，有效地避免假阳性结果出现。且本发明提供的探针组合为采用液相芯片检测技术来实现对玉米转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’的快速、简便、特异性强、灵敏度高等的检测提供了支持。
优选地，探针组合还包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阴性探针，阴性探针的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。具有如SEQ ID NO.34所示阴性探针在检测的过程不与任何PCR扩增的产物进行结合，能够起到良好的阴性对照效果，进一步避免假阳性结果的发生，提高检测结果的可靠性。
一种用于转基因玉米检测的液相芯片，其由上述任一项的用于转基因玉米检测的探针组合分别与羟基化的荧光编码微球偶联混合制成。
优选地，在偶联的过程中，按0.1nmol用量的检测探针对应1×105个羟基化的荧光编码微球进行偶联。可使得偶联效率更高，有利于节约资源和降低成本。
一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其包括上述的用于转基因玉米检测的液相芯片。
本发明的另一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其包括对照组和检测组，检测组包括第1-10检测组中的至少一个，对照组包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的阳性探针，每个检测组合均包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的检测探针，对照组的正向引物和反向引物其中之一和每个检测组的正向引物和反向引物其中之一的5’端带有生物素标记；
其中，第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的碱基序列分别如SEQ IDNO.1-11所示，第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的碱基序列分别如SEQ IDNO.12-22所示。需要说明的是，探针需要与带有生物素标记的引物所扩增出的单链DNA进行特异性结合，进行实现检出目的。
因此，当第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的5’端带有生物素标记时，第1-10检测组和对照组的检测探针的碱基序列分别如SEQ ID NO.23-33所示；
当第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的5’端带有生物素标记时，第1-10检测组和对照组的检测探针的碱基序列分别为SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互补序列。
此外，发明人在上述探针设计的基础上，还针对转基因玉米常见的转基因成分如Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等的保守序列以及玉米内源基因Ivr1进行了引物设计，得到了检测上述可同时扩增上述基因的11重PCR引物。以确保其在进行11重PCR时能够最大程度地避免了非特异性扩增，且通过非对称扩增技术进行非对称PCR，确保扩增出的单链DNA链能够有效地和对应的检测探针进行特异性结合，使得检测结果更加准确可靠，避免假阳性结果出现。引物对和检测探针所其对应的基因检测成分的类别见实施例。
优选地，该试剂盒还包括报告分子，报告分子为链霉亲和素-藻红蛋白。链霉亲和素-藻红蛋白能够和生物素标记的引物所扩增出的单链DNA链结合，在相应激发光的作用下产生荧光信号，实现检出目的。
优选地，试剂盒还包括辅料组合，辅料组合为选自dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液中的一种或多种。
上述的用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用。
进一步地，用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用，其包括：用正向引物和反向引物进行多重非对称PCR，在PCR反应体系中，带有生物素标记的正向引物与未带有生物素标记的反向引物的摩尔比为1.2-1.8:1或带有生物素标记的反向引物与未带有生物素标记的正向引物的摩尔比为1.2-1.8:1。也就是说，在进行多重非对称PCR的过程中，带有生物素标记的引物与未带有生物素标记的引物的摩尔比为1.2-1.8:1，以使扩增出的单链DNA具有生物素标记，便于与报告分子结合。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的用于转基因玉米检测的探针组合，其包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阳性探针和检测探针。阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示，且检测探针的碱基序列分别为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列。
其中，阳性探针所检测的基因成分为玉米转化酶I基因(Irv1)，为内参基因，作为阳性对照。
检测探针的5’端也标记C12分子臂和氨基修饰，用于与荧光编码微球偶联。检测探针共10个，分别是第1-10检测探针，其碱基序列SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列。
其中，碱基序列如SEQ ID NO.23所示的第1检测探针用于检测草丁膦乙酰CoA转移酶基因(Pat)。
碱基序列如SEQ ID NO.24所示的第2检测探针用于检测草丁膦乙酰转移酶基因(Bar)。
碱基序列如SEQ ID NO.25所示的第3检测探针用于检测苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(b)基因(Cry1Ab)。
碱基序列如SEQ ID NO.26所示的第4检测探针用于检测苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(c)基因(Cry1Ac)。
碱基序列如SEQ ID NO.27所示的第5检测探针用于检测苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry105基因(Cry105)。
碱基序列如SEQ ID NO.28所示的第6检测探针用于检测莽草酸羟基乙酰转移酶P0基因(EPSPS-P0)。
碱基序列如SEQ ID NO.29所示的第7检测探针用于检测莽草酸羟基乙酰转移酶P2基因(EPSPS-P2)。
碱基序列如SEQ ID NO.30所示的第8检测探针用于检测花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)。
碱基序列如SEQ ID NO.31所示的第9检测探针用于检测花椰菜花叶病毒35S终止子(T35S)。
碱基序列如SEQ ID NO.32所示的第10检测探针用于检测碱基序列胭脂碱合成酶基因终止子(Nos-3’)。
由于上述探针的5’端标记C12分子臂和氨基修饰，使得它们可分别与不同的荧光编码微球偶联、混合后制成液相芯片，进而为实现对Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’转基因成分的液相芯片检测提供了支持。
且在检测过程中，具有上述碱基序列的各探针之间不发生非特异性结合，确保探针能够与其对应的目标序列(对应的基因或对应基因的PCR产物)进行特异性结合，检测结果更加准确可靠，有效地避免假阳性结果出现。
因此，本发明提供的探针组合为采用液相芯片检测技术来实现对玉米转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’的快速、简便、特异性强、灵敏度高等的检测提供了支持。
总之，上述所述的任意一种探针组合均能够实现对玉米转基因成分的液相芯片检测，且在检测过程中，各探针之间不发生非特异性结合，确保探针能够与其对应的目标序列进行特异性结合，使得检测结果更加准确可靠，有效地避免假阳性结果出现。
实施例2
本发明提供的用于用于转基因玉米检测的探针组合同实施例1，但不同的本发明的探针组合还包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阴性探针，阴性探针的碱基序列如SEQID NO.34所示。本发明提供的用于用于转基因玉米检测的探针组合不仅具有与同实施例1相同的效果。还有其他的效果体现在，具有如SEQ ID NO.34所示阴性探针在检测的过程不与任何PCR扩增的产物进行结合，能够起到良好的阴性对照效果，进一步避免假阳性结果的发生，提高检测结果的可靠性。
实施例3
本实施例提供的用于转基因玉米检测的液相芯片，该液相芯片由实施例1所述的用于转基因玉米检测的探针组合(即阳性探针和第1-10检测探针)分别与荧光编码微球偶联制成。以下对于偶联的步骤作具体说明。但本发明的液相芯片并不限于采用以下所述的偶联方法制成，也可以是由其他的偶联方法制得，只要是采用了实施例1所述的探针组合的任意一种组合与荧光编码微球结合，实现对玉米转基因成分的液相芯片检测即落入本发明的保护范围。本实施例的可通过如下偶联方法制成。
1制备偶联体系：取40μl(微球总数量为1×105个)羟基化修饰的荧光编码微球(微球，美国Luminex公司)，12000rpm离心2min后弃上清，在沉淀中加入5μl的0.1M、pH值4.5的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]溶液，混匀，得到5μl的偶联体系(微球浓度为2×104个/μl，微球总数量为1×105个)。
2将阳性探针稀释至0.1mM，往偶联体系中加入2μl的阳性探针(共0.2nmol的阳性探针)，混匀。
3往偶联体系中加入2.5μl EDC(浓度为10mg/ml，二氯乙烷)，混匀，避光反应30min。
4往偶联体系中再次加入2.5μl EDC(10mg/ml)，混匀，避光反应30min。
5往偶联体系中加入0.2ml 0.02％的Tween-20，离心12000rpm、1min，弃上清。
6往偶联体系中加入0.2ml 0.1％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，离心12000rpm、1min，弃上清。
7加入10μl 1×TE缓冲液(pH 8.0)，混匀微球，得到偶联有阳性探针的荧光编码微球的微球储备液，于4℃避光保存。
8按1-7的方法，将第1-10检测探针分别偶联不同的荧光编码微球，分别得到10种微球储备液。
9将上述得到11种微球储备液混合，用1.5×TMAC溶液(组成的物质终浓度如下：4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、质量体积比0.15％的十二烷基肌氨酸钠、75mM pH 8.0的Tris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA)稀释至每种荧光编码微球的工作浓度为100个/μl，得到微球检测液即液相芯片。
通过采用液相芯片检测技术，本实施例的液相芯片可用于快速准确的检测出转基因玉米中的转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’，其具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
实施例4
本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒，其包括上述实施例3所述的用于转基因玉米检测的液相芯片。通过采用液相芯片检测技术，本实施例的试剂盒快速准确的检测出转基因玉米中的转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’，其具有特异性好，灵敏度高，通量大、结果可靠等特点。
实施例5
本实施例提供了另一种用于转基因玉米检测的试剂盒，该试剂盒与实施例4的试剂盒稍有不同。本实施例的试剂盒还包括与探针检测配套的用于多重非对称PCR扩增的引物。具体如下。
本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒包括对照组和检测组，检测组包括第1-10检测组。对照组包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的阳性探针。每个检测组合均包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的检测探针。第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的5’端带有生物素标记。其中，第1-10检测组用于检测玉米的外源转基因成分，对照组合用于检测玉米内源基因Irv1，第1-10检测组和对照组的引物和探针的碱基序列(5’-3’)如下。
第1检测组合，用于检测Pat(草丁膦乙酰CoA转移酶基因)：
正向引物为：TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT(碱基序列如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物为：Biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC(碱基序列如SEQ ID NO.12所示)；
检测探针(Pat探针)为：
NH2-C12-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT(碱基序列如SEQ ID NO.23所示)。
第2检测组合，用于检测Bar(草丁膦乙酰转移酶基因)：
正向引物为：GGGGATCTACCATGAGCCCA(碱基序列如SEQ ID NO.2所示)；
反向引物为：Biotin-GGCTCGGTACGGAAGTTGAC(碱基序列如SEQ ID NO.13所示)；
检测探针(Bar探针)为：
NH2-C12-ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCAC(碱基序列如SEQ ID NO.24所示)。
第3检测组合，用于检测Cry1Ab(苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(b)基因)：
正向引物为：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC(碱基序列如SEQ ID NO.3所示)；
反向引物为：Biotin-CTCAATTTGCACCAGGAATGC(碱基序列如SEQ ID NO.14所示)；
检测探针(Cry1Ab探针)为：
NH2-C12-GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATG(碱基序列如SEQ ID NO.25所示)。
第4检测组合，用于检测Cry1Ac(苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry1A(c)基因)：
正向引物为：GTTAGACTCAACAGCAGTGGA(碱基序列如SEQ ID NO.4所示)；
反向引物为：Biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA(碱基序列如SEQ ID NO.15所示)；
检测探针(Cry1Ac探针)为：
NH2-C12-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGT(碱基序列如SEQ ID NO.26所示)。
第5检测组合，用于检测Cry105(苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry105基因)：
正向引物为：ACTCGATCAGGTACAATGCCA(碱基序列如SEQ ID NO.5所示)；
反向引物为：Biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC(碱基序列如SEQ ID NO.16所示)；
检测探针(Cry105探针)为：
NH2-C12-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG(碱基序列如SEQ ID NO.27所示)。
第6检测组合，用于检测EPSPS-P0(莽草酸羟基乙酰转移酶P0基因)：
正向引物为：GCGCGATCATACGGAAAAGAT(碱基序列如SEQ ID NO.6所示)；
反向引物为：Biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG(碱基序列如SEQ ID NO.17所示)；
检测探针(EPSPS-P0探针)为：
NH2-C12-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC(碱基序列如SEQ ID NO.28所示)。
第7检测组合，用于检测EPSPS-P2(莽草酸羟基乙酰转移酶P2基因)：
正向引物为：TCGTGACCACACTGAAAAGAT(碱基序列如SEQ ID NO.7所示)；
反向引物为：Biotin-TCAATCACTTGACCGGTGAG(碱基序列如SEQ ID NO.18所示)；
检测探针(EPSPS-P2探针)为：
NH2-C12-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC(碱基序列如SEQ ID NO.29所示)。
第8检测组合，用于检测P35S(花椰菜花叶病毒35S启动子)：
正向引物为：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA(碱基序列如SEQ ID NO.8所示)；
反向引物为：Biotin-GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG(碱基序列如SEQ ID NO.19所示)；
检测探针(P35S探针)为：
NH2-C12-CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCAC(碱基序列如SEQ ID NO.30所示)
第9检测组合，用于检测T35S(花椰菜花叶病毒35S终止子)：
正向引物为：TGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAA(碱基序列如SEQ ID NO.9所示)；
反向引物为：Biotin-CTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA(碱基序列如SEQ ID NO.20所示)；
检测探针(T35S探针)为：
NH2-C12-CTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCT(碱基序列如SEQID NO.31所示)。
第10检测组合，用于检测Nos-3’(碱基序列胭脂碱合成酶基因终止子)：
正向引物为：TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT(碱基序列如SEQ ID NO.10所示)；
反向引物为：Biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT(碱基序列如SEQ ID NO.21所示)；
检测探针(Nos-3’探针)为：
NH2-C12-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC(碱基序列如SEQ ID NO.32所示)。
对照组，用于检测Ivr1(玉米转化酶I基因，为玉米内参基因，可作为阳性对照)：
正向引物为：ACTAGTGCGACCCATATTCCAG(碱基序列如SEQ ID NO.11所示)；
反向引物为：Biotin-AAGCGGTAAGGCCAACAGTT(碱基序列如SEQ ID NO.22所示)；
阳性探针(Ivr1探针)为：
NH2-C12-ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTCCGTCCCTGATGCTGCAG(碱基序列如SEQ ID NO.33所示)。
本实施例以检测转基因玉米品系BT11为例进行说明检测方法。采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述引物和探针，当然合成引物和探针的方法不限于此，也可是由其他的方法合成。采用本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒检测玉米转基因成分的检测方法如下。
1提取待测样品的基因组DNA
按DNA提取试剂盒(Nu Clean Plant Gen DNA Kit，CW2634S，北京康为世纪生物科技有限公司)的操作说明提取转基因玉米品系BT11的基因组DNA，按每30mg初始样本经抽提后用60μl ddH2O溶解基因组DNA，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(100ng/μl)，作为DNA模板。
2多重非对称PCR
用本实施例提供的转基因液相芯片检测试剂盒中的各检测组合中的正向引物和反向引物对待测样品DNA模板进行多重非对称PC扩增。正向引物和反向引物提前稀释至工作浓度20μM。反应体系为：10×PCR反应缓冲液(含mg2+)5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，正向引物(20μM)各0.5μl，反向引物(20μM)各0.6μl，EX-Taq DNA聚合酶(5U/μl、Takara)0.5μl，DNA模板(100ng/μl)1μl，补ddH2O至总体积为50μl。反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。最后得到多重非对称PCR产物。
3微球与探针偶联
3.1制备偶联体系：取40μl(总微球数为1×105个)羟基化修饰的荧光编码微球(微球，美国Luminex公司)，12000rpm离心2min后弃上清，在沉淀中加入5μl的0.1M、pH值4.5的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]溶液，混匀，得到5μl的偶联体系，其中，微球浓度为2×104个/μl。
3.2将对照组的阳性探针稀释至0.1mM，往偶联体系中加入1μl对照组的阳性探针(共0.1nm的阳性探针)，混匀。
3.3往偶联体系中加入2.5μl EDC(浓度为10mg/ml，二氯乙烷)，混匀，避光反应30min。
3.4往偶联体系中再次加入2.5μl EDC(10mg/ml)，混匀，避光反应30min。
3.5往偶联体系中加入0.2ml 0.02％的Tween-20，离心12000rpm、1min，弃上清。
3.6往偶联体系中加入0.2ml 0.1％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，离心12000rpm、1min，弃上清。
3.7加入10μl 1×TE缓冲液(pH 8.0)，混匀微球，得到偶联有阳性探针的荧光编码微球的阳性微球储备液，于4℃避光保存。
3.8按3.1-3.7的方法，将第1-10检测组的检测探针以及阴性探针(NegativeProbe)分别偶联不同的荧光编码微球，分别得到12种微球储备液。其中，阴性探针为：
NH2-C12-GTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG(如SEQ IDNO.34所示)。
3.9将上述得到12中微球储备液混合，用1.5×TMAC溶液((组成的物质终浓度如下：4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、质量体积比0.15％的十二烷基肌氨酸钠、75mM pH 8.0的Tris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA))稀释至每种荧光编码微球的工作浓度为100个/μl，得到微球检测液即液相芯片。
4杂交
4.1杂交反应体系为：33μl微球检测液，7μl pH8.0的l×TE缓冲液，10μl多重非对称PCR产物。杂交程序为：95℃5min，55℃15min，循环1次。
4.2杂交结束后，加入25μl含链霉亲和素R-藻红蛋白的报告溶液，混匀，于55℃下孵育5min。其中，报告溶液为用25μl 1×TMAC溶液(物质组成的终浓度如下：3M的TMAC、质量体积比0.1％的十二烷基肌氨酸钠、50mM pH 8.0的Tris-HCl、4mM pH 8.0的EDTA)稀释0.04μg链霉亲和素R-藻红蛋白得到。
5检测
上机检测，使用Luminex液相芯片检测仪，参数设置为Count100，仪器读出MFI(Median Fluorescence Intensity，平均荧光强度)，数据收集软件对检测的荧光强度比值分析判断。判断标准是：探针荧光信号值与相应阴性对照比值≥3判读为阳性，信号值与相应阴性对照比值≤3为阴性。本实施例的检测结果如图1和表1所示。
由图1(横坐标为偶联相应探针的微球、纵坐标为相应微球的平均荧光强度，图中NC代表阴性对照)和表1可知，本实施例的待测样品转基因玉米品系BT11含有Pat、Cry1Ab、P35S以及Nos-3’等转基因成分，检测结果与预期结果一致。
另外，需要说明的是本实施例中所用的报告分子、微球以及dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR缓冲液均为市购。
实施例6
本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒与实施例5基本相同。不同的是，本实施例的试剂盒还包括阴性探针。
阴性探针为：
NH2-C12-GTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG(其碱基序列如SEQ ID NO.34所示)。
采用本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒检测转基因玉米品系BT176，检测方法与实施例5基本一致。不同的是：在多重非对称PCR中，反应引物与正向引物的用量比为1.8:1，即每50μl的反应体系中，各检测组合中的反向引物(20μM)的加入量为0.9μl、正向引物(20μM)的加入量为0.5μl。检测结果如图2和表1所示。
由图2和表1可知，本实施例的待测样品转基因玉米品系BT176含有Bar、P35S以及T35S等转基因成分。
实施例7
本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒与实施例6基本相同，不同的是，本实施例的试剂盒还包括报告分子以及辅料组合。
报告分子为链霉亲和素-藻红蛋白。
辅料组合为dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液。当然，在其他的实施例中，辅料组合可以是dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液中的一种或任意两种的组合。
采用本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒检测转基因玉米品系MON88017，检测方法与同实施例5基本相同。检测结果如图3和表1所示。
由图3和表1可知，本实施例的待测样品转基因玉米品系MON88017含有EPSPS-P2、P35S、Nos-3'等转基因成分。
实施例8
本实施例提供的用于转基因玉米检测的试剂盒包括对照组和检测组，检测组包括第1-10检测组。对照组包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的阳性探针。每个检测组合均包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的检测探针。与实施例5不同的是，本实施例中，第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的5’端带有生物素标记。
第1-10检测组的正向引物和对照组的正向引物的碱基序列和第1-10检测组的反向引物和对照组的反向引物的碱基序列同实施例5。但本实施例中，第1-10检测组和对照组的检测探针的碱基序列分别为SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互补序列。
采用本实施例的用于转基因玉米检测的试剂盒检测转基因玉米品系MON89034。检测方法与实施例5基本相同，不同的是，在多重非对称PCR时，各检测组合所用的正向引物与反向引物的用量比为1.2:1，即每50μl的反应体系中，各检测组合中的正向引物(20μM)的加入量为0.6μl、反向引物(20μM)的加入量为0.5μl。检测结果如图4和表1所示。
表1.实施例5-8中待测样品的检测结果
由图4和表1可知，本实施例的待测样品转基因玉米品系MON89034含有Cry105、P35S、Nos-3'等转基因成分。
综上所述，本发明实施例的试剂盒通过针对转基因玉米常见的转基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等10种外源基因成分以及玉米内源基因Ivr1设计出可快速检测的多重非对称PCR的引物组合和以及用于液相芯片检测的探针组合，且设计出的11重PCR引物最大程度地避免了非特异性扩增，检测探针能够与PCR扩增产物的单链DNA进行特异性结合，避免假阳性结果，具有灵敏度高、特异性强、可检指标多的特点。
总之，本发明提供的用于转基因玉米检测的探针组合、液相芯片以及试剂盒可以快速准确的判断待检玉米产品中是否含有上述转基因序列，操作简便，特异性好，灵敏度高，检测通量大，对种子站、农科院所和边境口岸对转基因玉米检测具有重要作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于转基因玉米检测的探针组合，其特征在于，其包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阳性探针和检测探针，所述阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示，且所述检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种；或所述阳性探针的碱基序列为SEQ ID NO.33所示序列的反向互补序列，所述检测探针的碱基序列为选自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一种的反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的用于转基因玉米检测的探针组合，其特征在于，所述探针组合还包括5’端标记C12分子臂和氨基修饰的阴性探针，所述阴性探针的碱基序列如SEQ IDNO.34所示。
3.一种用于转基因玉米检测的液相芯片，其特征在于，其由权利要求1或2所述的用于转基因玉米检测的探针组合分别与羟基化的荧光编码微球偶联混合制成。
4.根据权利要求3所述的用于转基因玉米检测的液相芯片，其特征在于，所述探针组合中的每个探针按0.1～0.2nmol的量对应1×105个所述羟基化的荧光编码微球进行偶联。
5.一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3或4所述的用于转基因玉米检测的液相芯片。
6.一种用于转基因玉米检测的试剂盒，其特征在于，其包括对照组和检测组，所述检测组包括第1-10检测组中的至少一个，所述对照组包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的阳性探针，每个所述检测组合均包括正向引物、反向引物以及5’端带有C12分子臂和氨基修饰标记的检测探针，所述对照组的所述正向引物和所述反向引物其中之一和每个所述检测组的所述正向引物和所述反向引物其中之一的5’端带有生物素标记；
其中，所述第1-10检测组的所述正向引物和所述对照组的所述正向引物的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-11所示，所述第1-10检测组的所述反向引物和所述对照组的所述反向引物的碱基序列分别如SEQ ID NO.12-22所示；
当所述第1-10检测组的所述反向引物和所述对照组的所述反向引物的5’端带有所述生物素标记时，所述第1-10检测组和所述对照组的所述检测探针的碱基序列分别如SEQ IDNO.23-33所示；
当所述第1-10检测组的所述正向引物和所述对照组的所述正向引物的5’端带有所述生物素标记时，所述第1-10检测组和所述对照组的所述检测探针的碱基序列分别为SEQ IDNO.23-33所示序列的反向互补序列。
7.根据权利要求6所述的用于转基因玉米检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括报告分子，所述报告分子为链霉亲和素-藻红蛋白。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的用于转基因玉米检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括辅料组合，所述辅料组合为选自dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液中的一种或多种。
9.权利要求6-8中任一项所述的用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的用于转基因玉米检测的试剂盒在玉米转基因成分检测中的应用，其特征在于，其包括：用所述对照组和所述检测组的所述正向引物和所述反向引物进行多重非对称PCR，在PCR反应体系中，带有所述生物素标记的所述正向引物与未带有所述生物素标记的所述反向引物的摩尔比为1.2-1.8:1或带有所述生物素标记的所述反向引物与未带有所述生物素标记的所述正向引物的摩尔比为1.2-1.8:1。
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