CN103635592B - 霉菌的检测方法、pcr用反应液、及霉菌检测用载体 - Google Patents
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Abstract
在确认霉菌是否存在的检查中，能够高精度且特异性地检测广泛种类的霉菌。一种霉菌的检测方法，包括使包含霉菌的DNA中的靶区域的DNA片段扩增，确认扩增产物的有无的工序，作为所述靶区域，使用ITS区域以及β‑微管蛋白基因。另外，在用于进行靶区域的扩增的PCR用反应液中，用于使β‑微管蛋白基因扩增的引物组与用于使ITS区域扩增的引物组的浓度比为1：0.9～1：0.1。
Description
技术领域
本发明涉及霉菌的检测方法，特别涉及用于高精度且特异性地检测广泛种类的霉菌的霉菌检测方法、PCR用反应液、及霉菌检测用载体。
背景技术
近年来，在食品制造现场或临床现场、文化财产保护环境等中，检查是否存在霉菌等微生物来确认安全性，并且防止其繁殖变得很重要。
这样的霉菌检查中，通常，从环境中采集试样，进行前期培养，接着，在对各菌种最佳的培养基中进行约20天的培养后，观察形态的特征，由此，进行鉴定霉菌的形态观察法(培养法)(参照专利文献1)。
但是，该方法中，需要对每个霉菌种类进行分离培养，因此，存在检查工序变烦杂的问题。另外，培养需要长时间，因此，具有例如对于人生活的室内的检查或食物的检查等要求迅速性的检查而言不适合的问题。另外，也存在如没有形成表示形态特征的胞子则无法鉴定，有时浪费劳力的问题。
另外，最近，在霉菌的检查中，也进行使用了基因的鉴定法。例如，将从环境中采集的试样培养后，从培养细胞中提取DNA，通过PCR(聚合酶链反应)法使靶区域扩增，对该扩增产物进行分析，由此，进行试样中的霉菌鉴定。作为对扩增产物进行分析的方法，提出了例如通过电泳来分析扩增产物的尺寸的方法、使用将与扩增产物互补结合的探针固定的DNA芯片来鉴定在试样中存在的霉菌的方法等(参照专利文献2～6)。
专利文献1：日本特开2007-195454号公报
专利文献2：日本特开2008-35773号公报
专利文献3：日本特开2008-278848号公报
专利文献4：日本特开2008-278861号公报
专利文献5：日本特开2010-4879号公报
专利文献6：日本特开2009-284832号公报
发明内容
发明要解决的问题
但是，即使通过这样的使用基因的鉴定法，在霉菌种类内的类似性高的情况下，仅由单一的靶基因的有无和尺寸来特定种类也极困难，存在例如不适于要求种群水平的鉴定准确度的检查的问题。
在此，专利文献2～4中，以各种霉菌的基因中的ITS(IntemalTranscribed Spacer)区域作为扩增对象区域，进行鉴定。在基于这样的ITS区域的霉菌的鉴定中，随着霉菌的种类增加，假阳性反应也增加，存在检查精度降低的问题。
另一方面，在专利文献5、6中记载了以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域来进行鉴定。这些文献中公开了，通过以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域，能够检测特定种类的霉菌。
但是，如仅以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域，则与仅以ITS区域作为扩增对象区域的情况同样，存在有时发生假阳性反应的问题。
本发明人进行了深入的研究，结果发现，通过将ITS区域和β-微管蛋白基因二者作为扩增对象区域使用，能够高精度地检测广泛种类的霉菌，从而完成了本发明。另外，也发现了用于能够使ITS区域与β-微管蛋白基因同时在反应系统中有效扩增的条件。
但是，如上所述，进行形态鉴定的方法中，为了发现形态的特征，需要对每个菌种而言的最佳培养基和长期的培养，另外，鉴定需要熟练，因此，存在不适于迅速检查和检查的简易化的问题。
另外，在基于PCR及序列分析的方法中，为了对各菌种分别培养，需要约14天的比较长的检查期间，另外，由于需要对各菌种分别分析，因此，存在不适于要求多检体处理的情况的问题。
相对于此，根据基于DNA芯片的新型检测方法，理论上，能够一次检测多种霉菌，被期待作为迅速并且简易的检查方法。
另一方面，基于适于生长的湿度，霉菌被分成嗜干性霉菌(喜好干燥状态)、耐干性霉菌(能耐受干燥)、及嗜湿性霉菌(喜好湿润状态)，它们需要通过各自适合的不同的培养基进行培养。另外，在上述的以往通常进行的第一及第二方法中，需要对各菌种分别培养，因此，并不存在，将多种霉菌混合培养、再在此基础上分别检测各个霉菌这样的概念。因此，以往不存在将嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌同时培养而能够特异地检测各个霉菌的技术。
本发明是鉴于上述情况进行的，其目的在于，提供霉菌的检测方法、在该检测方法中使用的PCR用反应液、及霉菌检测用载体，所述霉菌的检测方法中，将试样中的霉菌的基因组DNA中的ITS区域及β-微管蛋白基因扩增，通过确认该扩增产物的有无来进行霉菌的鉴定。
另外，其目的在于，提供一种霉菌的检查方法，其中，不是对多种霉菌进行分离培养，而是在相同的培养基中同时培养多种霉菌，并且将它们混合而一次提取基因组DNA，通过DNA芯片能够特异地检测各霉菌。
用于解决问题的方法
为了实现上述目的，本发明的霉菌的检测方法为如下方法：包括使包含霉菌DNA中的靶区域的DNA片段扩增并确认有无扩增产物的工序，其中，作为靶区域，使用ITS区域以及β-微管蛋白基因。
这样作为扩增的靶区域，如并用ITS区域以及β-微管蛋白基因，则与仅使用它们中的任一种作为靶区域的情况相比较，能够降低假阳性反应。因此，能够更高精度地检测广泛的霉菌。
另外，本发明的霉菌的检测方法中，通过PCR法进行靶区域的扩增时，优选将PCR用反应液中的用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组与用于使ITS区域扩增的引物组的浓度比设为1：0.9～1：0.1。
如果这样设定引物组的浓度比，则通过使用含有这些引物组的PCR用反应液进行PCR反应，能够同时将ITS区域与β-微管蛋白基因二者有效扩增。因此，通过同时对它们进行检测，能够以更高的精度进行霉菌的检查。需要说明的是，如果将用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组与用于使ITS区域扩增的引物组的浓度比设为1：0.5～1：0.25，则能够使这两者的扩增效率最有效，因此更优选。
另外，本发明的PCR用反应液为用于进行靶区域的扩增的PCR用反应液，包含：具备正向引物及反向引物的引物组作为用于使ITS区域扩增的引物组，其中，所述正向引物含有序列号1所示的碱基序列，所述反向引物含有序列号2所示的碱基序列；和具备正向引物及反向引物的引物组作为用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组，其中，所述正向引物含有序列号3所示的碱基序列，所述反向引物含有序列号4所示的碱基序列。
如果这样设定PCR用反应液，则能够使各种霉菌中的ITS区域和β-微管蛋白基因二者扩增。因此，能够基于这两者的扩增产物判定霉菌的有无，从而能够高精度地检测更广泛的霉菌。
另外，也优选使本发明的PCR用反应液还包含含有序列号5所示的碱基序列的引物作为用于使支孢属菌特异性扩增的正向引物。
如果这样设定PCR用反应液，则能够将仅通过使用包含含有序列号1～4所示的碱基序列的引物的PCR用反应液而无法有效扩增的支孢属菌的DNA片段扩增，能够对该菌适当地进行检测。
另外，本发明的霉菌检测用载体针对一种或二种以上霉菌中的每一种固定了具有选自ITS区域的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的碱基序列的探针。
如果这样设定霉菌检测用载体，则通过向该霉菌检测用载体中滴加将ITS区域与β-微管蛋白基因同时扩增而得到的扩增产物，能够检测具有与探针的碱基序列互补结合的DNA的霉菌。在该霉菌检测用载体上，针对每个霉菌种类固定化有具有选自ITS区域的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的碱基序列的探针二者，因此，能够基于这二者来确认霉菌是否存在。另外，在检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的情况下判断存在霉菌，由此，能够降低基于假阳性而判定存在的情况，能够进行更高精度的霉菌检测。
另外，本发明的霉菌的检查方法为如下方法：培养多种霉菌，将该培养后的多种霉菌混合，一次性提取基因组DNA，使用DNA芯片，同时并且特异性地对多种霉菌分别进行检测。
如果将本发明的霉菌的检查方法设定为这样的方法，则即使不按菌种单个地分开培养，而是在混在的状态下培养，也能够特异性地检测培养后的菌种。即，在培养后的多种霉菌混合的状态下，即使一起进行各个霉菌的基因组DNA的提取，也能够通过DNA芯片检测各霉菌。
需要说明的是，作为使用DNA芯片检测提取出的基因组DNA的方法，可以使用通常的方法。
具体而言，例如使用包含用于将检测对象霉菌的特定区域扩增的引物组的PCR反应液，通过PCR法将基因组DNA的特定区域扩增。将预先选自基于该引物组的扩增区域的探针事先固定化到DNA芯片。此时，需要针对每个检测对象霉菌的特定区域预先制作引物组及探针。另外，在该DNA芯片上滴加通过PCR法得到的扩增产物，检测与探针结合的扩增产物，由此，能够分别特异性地检测混合物中包含的各种霉菌。
另外，上述本发明的霉菌的检查方法中，也优选如下方法：将至少选自嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌中的2种以上的霉菌在规定的一个培养基中同时培养，同时并且特异性地检测该培养后的各霉菌。
如果使本发明的霉菌的检查方法为这样的方法，则能够将通常被分别培养的、要求不同的湿度环境的霉菌在规定的一个培养基中同时培养。另外，能够从这些混合物中特异性地检测各个霉菌。因此，可以不用考虑霉菌的性质等而一次性同时进行培养检测，从而能够实现霉菌检查的简易化。
另外，上述本发明的霉菌的检查方法中，使多种霉菌的水分活性值优选低于1.0且0.90以上、并且使糖浓度优选为5～50％、进一步优选10％～40％。作为糖的种类，具体而言，优选使用葡萄糖、蔗糖。
根据这样的水分活性值、糖浓度的固体培养基，也能够适当地培养嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌中的任一种，能够一次性同时培养所有霉菌，进行其检测。
另外，上述本发明的霉菌的检查方法中，也优选如下方法：将多种霉菌在25℃±2℃的温度下培养。
如果为这样的温度范围，则也能够充分地繁殖嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌中的任一种。
另外，上述本发明的霉菌的检查方法中，也优选将培养后的多种霉菌装入收纳有用于将霉菌的细胞壁物理性破碎的微珠的容器中并混合，一次性提取基因组DNA。
如果使本发明的霉菌的检查方法为这样的方法，则能够从同时培养后的多种霉菌中集中提取基因组DNA。
另外，上述本发明的霉菌的检查方法中，也优选多种霉菌为在大气中浮游或附着的霉菌胞子及菌丝。
如果使本发明的霉菌的检查方法为这样的方法，则采集环境中的霉菌进行培养，能够将它们简单地同时检测。
发明效果
通过本发明，能够高精度地检测广泛种类的霉菌。
另外，通过本发明，能够将多种霉菌在相同的培养基中进行同时培养，并且将它们混合而一次提取基因组DNA，通过DNA芯片特异性地检测各霉菌。
附图说明
图1是表示通过含有序列号3和序列号4的引物组进行PCR扩增后的β-微管蛋白基因内的种或者属特异的区域及霉菌共同区域的图。
图2是表示在本发明的霉菌的检测方法中使用的引物的图。
图3是表示在本发明的霉菌的检测方法中使用的探针的图。
图4是表示在从施设环境采集的样品A～H中分别包含的菌种的图。
图5是表示在同时反应系统中用于探测能够检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度的范围的试验1的结果(样品A)的图。
图6是表示在同时反应系统中用于探测能够检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度的范围的试验1的结果(样品B)的图。
图7是表示在同时反应系统中用于探测能够检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度的范围的试验1的结果(样品C)的图。
图8是表示在同时反应系统中用于探测能够检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度的范围的试验1的结果(样品D)的图。
图9是表示关于试验1的样品A的各引物组浓度比及各探针的荧光强度的图。
图10是表示关于试验1的样品B的各引物组浓度比及各探针的荧光强度的图。
图11是表示关于试验1的样品C的各引物组浓度比及各探针的荧光强度的图。
图12是表示关于试验1的样品D的各引物组浓度比及各探针的荧光强度的图。
图13是表示用于确认DNA芯片分析中的荧光强度与基于PCR的扩增产物量的相关关系的试验2的结果的图。
图14是表示在同时反应系统中用于探测能够检测出ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度的范围的试验3的结果的图。
图15是表示用于确认在从施设环境集采的样品A～H中不包含的各种霉菌是否能够通过使用了多重PCR的DNA芯片分析来检测的试验4的结果的图。
图16是表示关于试验4的样品的各引物组浓度比及各探针的荧光强度的图。
图17是表示用于确认支孢属菌是否能够通过使用了多重PCR的DNA芯片分析来检测的试验5的结果的图。
图18是表示用于确认向PCR用反应液中添加支孢属菌特异性正向引物对其他菌种的检测带来的影响的试验6的结果的图。
图19是表示基于各种培养基组成的培养试验的培养评价的图。
图20是表示将嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌在各种培养基中培养时的菌落的直径的图。
图21是表示将嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌在各种温度下培养时的菌落的直径的图。
图22是表示将嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌在各种温度下培养时的菌落的照片的图。
图23是表示检体1-20中的菌种的DNA芯片分析及序列分析结果的图。
图24是表示检体21-40中的菌种的DNA芯片分析及序列分析结果的图。
图25是表示检体45-60中的菌种的DNA芯片分析及序列分析结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明的霉菌的检测方法、PCR用反应液及霉菌检测用载体的一个实施方式详细进行说明。但是，本发明不限于以下的本实施方式及后述的实施例的具体的内容。
[霉菌的检测方法]
本实施方式的霉菌的检测方法，包括使包含霉菌的DNA中的靶区域的DNA片段扩增，确认扩增产物的有无的工序，其特征在于，作为靶区域，使用ITS区域以及β-微管蛋白基因。
霉菌的种类没有特别限定，可以将例如散囊属菌(Eurotium sp.)、帚状曲霉种菌(Aspergillus penicillioides)、局限曲霉复合种菌(Aspergillus SectionRestricti)、西比小尖霉(Wallemia sebi)、唯特里库拉曲霉种菌(Aspergillusvitricola)、青霉属菌(Penicillium sp.)、烟曲霉复合种菌(Aspergillus SectionFumigati)、黄曲霉复合种菌(Aspergillus Section Flavi)、构巢曲霉复合种菌(Aspergillus Section Nidulantes)、尼格里复合种菌(Aspergillus SectionNigri)、黑葡萄穗霉种菌(Stachybotrys chartarum)、腐皮镰孢种菌(Fusariumsolani)、支孢属菌(Cladosporium sp.)等霉菌设定为基于本发明的霉菌的检测方法、PCR用反应液、及霉菌检测用载体的检测对象霉菌。另外，除此之外，还可将尖孢镰刀菌种菌(Fusarium oxysporum)，禾谷镰刀种菌(Fusarium graminiarum)、轮状镰刀霉菌种菌(Fusarium verticillioides)、终极腐霉菌种菌(Pythium ultimum)、胶孢炭疽菌种菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)、大丽轮枝菌种菌(Verticillium dahiae)、黑白轮枝菌种菌(Verticillium albo-atrum)、互隔交链孢霉种菌(Altemaria alternate)、红色毛癣菌种菌(Trichophyton rubrum)、断发毛癣菌种菌(Trichophyton tonsurans)、绿色木霉种菌(Trichoderma viride)等霉菌作为检测对象。
本实施方式的霉菌的检测方法中的靶区域是霉菌的DNA中的扩增对象区域，可以使用特定的隔离物或基因等作为这样的区域。本发明中，作为该靶区域，同时使用ITS(Intemal Transcribed Spacer)区域和β-微管蛋白基因二者。
使包含靶区域的DNA片段扩增的方法没有特别限定，但可以优选使用PCR(聚合酶链反应)法。
PCR法中，使用包含用于使靶区域扩增的引物组的PCR反应液，将霉菌的DNA中的特定区域扩增。作为PCR装置，可以使用通常的热循环仪等，例如可以在如下的反应条件下进行PCR。
(a)95℃10分钟、(b)95℃(DNA改性工序)30秒、(c)56℃(退火工序)30秒、(d)72℃(DNA合成工序)60秒(将(b)～(d)循环40次)、(e)72℃10分钟
作为确认扩增产物的有无的方法，可以优选使用利用电泳的方法或使用DNA芯片进行检测的方法等。
利用电泳的方法，使用例如MultiNA(R)(株式会社岛津制作所制)，通过微毛细管电泳，使PCR的扩增产物泳动，基于条带的位置来确认其大小，由此，可以判定是否得到正确的扩增产物。
利用DNA芯片的方法是将与靶区域特异性杂交的探针预先固定化到DNA芯片，在该DNA芯片上滴加PCR的扩增产物，通过检测扩增产物的标识等，可以判定是否得到正确的扩增产物。标识的检测可以使用荧光扫描装置等通常的标识检测装置来进行，可以通过使用例如东洋钢钣株式会社的BIOSHOT，测定扩增产物的荧光强度来进行。
另外，标识不限于荧光，也可以使用其他。
本实施方式中，作为引物，使用用于使霉菌的DNA中的ITS区域扩增的引物组、和用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组。
ITS区域是转印成RNA后被剪切的部分。因此，与编码区域相比时，保存性低，富于变化，但霉菌种间的类似性高，发生假阳性反应的情况比较多。因此，在DNA芯片上固定多种霉菌的探针而用于霉菌的识别的情况下，作为该探针，仅使用选自ITS区域的探针时，有可能导致检测精度的降低。
另一方面，验证多种霉菌中的β-微管蛋白基因的类似性时，如图1所示，各霉菌种独特的序列比较多地存在，可以认为这些区域最适于特异性高的探针设计。
使用ITS区域和β-微管蛋白基因二者作为靶区域，将广泛种类的霉菌作为对象进行验证，结果可知，通过组合使用这些区域，能够适当降低假阳性反应。
本实施方式的霉菌的检测方法中，作为这样靶区域，通过使用ITS区域和β-微管蛋白基因二者，能够高精度地检测广泛种类的霉菌。
[PCR用反应液]
本实施方式的PCR用反应液，在上述的霉菌的检测方法中用于通过PCR法进行包含靶区域的DNA片段的扩增的情况。作为该PCR用反应液，优选使用例如含有以下的组成的反应液。即，可以适当使用含有核酸合成基质(dNTPmixture(dCTP、dATP、dTTP、dGTP))、引物组、核酸合成酶(NovaTaq聚合酶等)、标识成分(Cy5-dCTP等)、试样的基因组DNA、缓冲液、及作为剩余的容量部分的水的PCR反应液。需要说明的是，作为缓冲液，可以使用例如Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)。
作为本实施方式的PCR用反应液中的引物组，使用含有能够使霉菌的DNA中的ITS区域扩增的正向引物和反向引物的引物组、以及含有能够使霉菌的DNA中的β-微管蛋白基因扩增的正向引物和反向引物的引物组。
对于本实施方式的PCR用反应液中的引物组而言，只要这样是具有ITS区域扩增用引物组和β-微管蛋白基因扩增用引物组的引物组，则没有特别限定，具体而言例如可以使用以下的引物组。即，如图2所示，作为ITS区域扩增用引物组，可以适当使用具备含有序列号1所示碱基序列的正向引物及含有序列号2所示碱基序列的反向引物的引物组。另外，作为β-微管蛋白基因扩增用引物组，可以适当使用具备含有序列号3所示碱基序列的正向引物及含有序列号4所示碱基序列的反向引物的引物组。
另外，优选使β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的浓度比为1：0.9～1：0.1。这是由于，如果这样设定引物组的浓度比，则能够使这些扩增对象区域同时适当地扩增。
在此，霉菌的DNA中，ITS区域存在100个拷贝以上，相对于此，β-微管蛋白基因仅存在1个拷贝。另外，前者的利用PCR法的扩增产物的尺寸为约250bp，相对于此，后者的利用PCR法的扩增产物的尺寸为350～550bp。
因此，使β-微管蛋白基因扩增用引物组的浓度与ITS区域扩增用引物组的浓度在PCR用反应液中相同时，不能充分地得到β-微管蛋白基因的扩增产物，存在检测精度降低的问题。
相对于此，使PCR用反应液中的ITS区域扩增用引物组的浓度过度降低时，本次ITS区域的扩增效率降低。
因此，作为β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的浓度比，需要查找最佳的条件。
因此，本发明人通过验证各种浓度比，发现如果为上述浓度比，则能够使ITS区域及β-微管蛋白基因二者适当地扩增。特别是如果β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的浓度比为1：0.5～1：0.25，则将扩增产物进行荧光标识，基于荧光强度进行霉菌的检测的情况下，均以大强度得到ITS区域与β-微管蛋白基因的荧光，因此更优选。
另外，在本实施方式的PCR用反应液中，优选包含用于使支孢属菌特异性扩增的引物。作为这样的引物，可以使用含有图2中序列号5所示碱基序列的正向引物。
在此，使用上述的ITS区域扩增用引物组及β-微管蛋白基因扩增用引物组的情况下，关于支孢属菌的β-微管蛋白基因，虽然通过PCR得到扩增产物，但没有充分地进行基于从与β-微管蛋白基因互补的序列选择的探针与该扩增产物的杂交，无法适当地检测出支孢属菌。
在此，关于支孢属菌，在PCR用反应液中追加能够使其特异性地扩增的正向引物来进行PCR，得到新型扩增产物。另外，实施例中，如后所述，将该新型扩增产物滴加到本实施方式的霉菌检测用载体中进行检查，结果，能够适当地检测出该菌种。
即，该用于使支孢属菌特异性地扩增的正向引物，是用于扩增β-微管蛋白基因的正向引物，与序列号4所示的反向引物成对，能够使支孢属菌的β-微管蛋白基因扩增。
PCR用反应液中的支孢属菌特异的正向引物的终浓度优选为0.5μM以下，更优选为0.125μM～0.5μM。这是由于，如果这样设定支孢属菌特异的正向引物的终浓度的范围，则能够适当地检测出支孢属菌。
另外，如果使PCR用反应液中的支孢属菌特异的正向引物的终浓度为0.25μM～0.5μM，则能够进一步适当地检测出支孢属菌。特别是如果使该终浓度为0.25μM，则能够使对其他菌种的检测带来的影响几乎最小，因此进一步优选。
上述引物组中的各引物的序列不限于上述碱基序列本身，可以使用在实现同一功能的范围内适当变更的序列。即，可以为在各碱基序列中1个或数个碱基缺失、被置换或加成后的序列。另外，可以为在严格的条件下能够对含有对于各碱基序列互补的碱基序列的核酸片段，进行杂交的序列。
严格的条件是指形成特异的杂种、而没有形成非特异的杂种的条件。可以列举出例如：相对于上述引物组具有高相同性(，相同性为90％以上、优选95％以上)的DNA与包含与上述引物组互补的碱基序列的DNA进行杂交的条件。通常是指在比完全杂种的溶解温度(Tm)低约5℃～约30℃、优选低约10℃～约25℃的温度下引起杂交的情况。关于严格的条件，可以使用J.Sambrook等，molecular Cloning，A Laboratory Mannual，SecondEditioN,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、特别是11.45节“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”中记载的条件等。
[霉菌检测用载体]
本实施方式的霉菌检测用载体，其特征在于，针对一种或二种以上霉菌中的每一种，固定了具有选自ITS区域的碱基序列的的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的碱基序列的探针，可以使用DNA芯片等来构成。
这样，对于每种霉菌的种类具备与ITS区域的扩增产物结合的探针和与β-微管蛋白基因的扩增产物结合的探针二者，在这两种探针中，通过将检测到荧光的霉菌判定为阳性，能够适当地排除基于假阳性反应的判定的错误。
具体而言，例如如图3所示，各个霉菌的种类，可以使用以下的探针。
即，作为用于检测散囊属菌(Eurotium sp.)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号6或7所示的碱基序列的探针中的至少任一种以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号8所示的碱基序列的探针。
另外，作为用于检测帚状曲霉种菌(Aspergillus penicillioides)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号9～11所示的碱基序列的探针中的至少任一种以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号12所示的碱基序列的探针。
另外，作为用于检测唯特里库拉曲霉种菌(Aspergillus vitricola)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号13或14所示的碱基序列的探针中的至少任一种以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号15所示的碱基序列的探针。
另外，作为用于检测局限曲霉复合种菌(Aspergillus Section Restricti)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号16～20所示的碱基序列的探针中的至少任一种以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号21所示的碱基序列的探针。
另外，作为用于检测构巢曲霉复合种菌(，Aspergillus Section Nidulantes)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号22所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号23所示的碱基序列的探针。
另外，作为用于检测烟曲霉复合种菌(Aspergillus Section Fumigati)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号24所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号25所示的碱基序列的探针。
另外，用于检测黄曲霉复合种菌(Aspergillus Section Flavi)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号26所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号27所示的碱基序列的探针。
另外，用于检测青霉属菌(Penicillium sp.)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号28或29所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号30～32所示的碱基序列的探针中的至少任一种。
另外，用于检测黑葡萄穗霉种菌(Stachybotrys chartarum)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号33所示的碱基序列的探针中的至少任一种以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号34所示的碱基序列的探针。
另外，用于检测腐皮镰孢种菌(Fusarium solani)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号35所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号36所示的碱基序列的探针。
另外，用于检测支孢属菌(Cladosporium sp.)的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号37所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号38或39所示的碱基序列的探针中的至少任一种。
另外，作为霉菌共同的探针，可以使用具有选自ITS区域的序列号40所示的碱基序列的探针以及具有选自β-微管蛋白基因的序列号41所示的碱基序列的探针。
另外，可以使本实施方式的霉菌检测用载体成为分别固定了一组或二组以上的用于检测上述各霉菌的各探针组的担载物。
这样，本实施方式的霉菌检测用载体通过将与各霉菌的ITS区域和β-微管蛋白基因的扩增产物分别结合的探针固定，使基于假阳性反应的判定错误降低，能够以高精度检测广泛的霉菌。
本实施方式的霉菌检测用载体，可以在通常的方法中使用，其方法没有特别限定，例如可以如下使用。
首先，将添加了0.3％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液(3×SSC柠檬酸-生理盐水)，混合到通过本实施方式的霉菌的检测方法得到的PCR的扩增产物中，再滴加到本实施方式的霉菌检测用载体中。
将该霉菌检测用载体在45℃下静置1小时后，使用上述缓冲液从霉菌检测用载体上冲洗没有杂交的PCR产物。另外，将其置于标识检测装置上测定荧光强度，由此，能够进行霉菌的检测。
需要说明的是，在本实施方式的霉菌检测用载体上固定的上述各探针，可以与上述的引物组中的各引物的序列的情况同样地使用在实现同一功能的范围内适当变更后的探针。即，能够形成在各碱基序列中1个或数个碱基缺失、被置换或被加成后的探针。另外，对于由相对于各碱基序列互补的碱基序列构成的核酸片段而言，在严格的条件下能够杂交。
另外，作为在本实施方式的霉菌检测用载体上固定的探针，也可以使用上述各探针；在各碱基序列中1个或数个碱基缺失、被置换或被加成后的探针；或者具有对以下序列互补的碱基序列的探针，该序列是对于含有与各碱基序列互补的碱基序列的核酸片段而言在严格的条件下能够杂交的序列。
在此，在本实施方式的霉菌的检测方法中的通过PCR法得到的扩增产物中，也包含具有相对于与上述探针杂交的核酸片段互补的碱基序列的核酸片段。因此，含有相对于图3所示的序列号6～41互补的碱基序列、及与它们同等的碱基序列的探针，能够与具有相对于与上述探针杂交的核酸片段互补的碱基序列的核酸片段杂交。
因此，将相对于图3所示的序列号6～41互补的碱基序列，及含有与它们同等的碱基序列的探针固定在本实施方式的霉菌检测用载体上时，也能够检测作为各自对象的霉菌。所述含有与它们同等的碱基序列的探针也就是在序列号6～41的各碱基序列中1个或数个碱基缺失、被置换或加成后的探针、或者对于含有相对于各碱基序列相互补的碱基序列的核酸片段而言在严格的条件下能够杂交的探针
接着，对本发明的霉菌的检查方法的一个实施方式详细进行说明。需要说明的是，本实施方式的霉菌的检查方法只要是培养多种霉菌，将培养后的多种霉菌混合，一次性提取基因组DNA，使用DNA芯片，同时并且特异性地检出多种霉菌中的各个霉菌即可，不限于以下的实施方式及实施例的具体的内容。
本实施方式的霉菌的检查方法可以包括以下的工序。
(1)霉菌的采集
首先，使用空气取样器，采集食品制造现场或临床现场、文化财产的保护环境等的空气。接着，将采集的空气吹入在空气取样器用形成为条形状的专用培养基等中进行培养。
作为该培养基，在实施例中，如后所述，优选使用对嗜干性、耐干性、及嗜湿性中的任一种霉菌均能够培养的M40Y、MY10G培养基、MY30G培养基等。其中，使用M40Y培养基时，对上述任一种性质的霉菌均能够高效地进行培养，因此特别优选。
另外，作为培养条件，优选在23℃～27℃温度的暗处静置约2日～7日。
需要说明的是，通常M40Y培养基、MY10G培养基、及MY30G培养基被认为是嗜干性霉菌用的培养基，被认为不适于嗜湿性霉菌培养。
接着，一次性采集在培养基上生成的各种霉菌的菌落，而没有单独地分离。另外，将采集的试样放入装有例如φ0.5mm氧化锆微珠的小瓶等中，将每个小瓶分别浸入液氮中，冻结试样后，使用振荡装置等，将霉菌的细胞破碎。需要说明的是，细胞的破坏以能够提取DNA的方式进行即可，也可以通过其他方法进行。
(2)DNA的提取
作为从将霉菌的细胞破坏后的试样中提取基因组DNA的方法，可以使用CTAB法(溴化十六烷基三甲铵，Cetyl trimethyl ammonium bromide)或使用DNA提取装置的方法等通常的方法。
(3)利用PCR法的ITS区域的扩增
接着，在PCR反应液中加入能够将各种霉菌的rDNA的ITS1区域扩增的引物组，通过PCR法，将上述试样中的霉菌的基因组DNA中的特定区域扩增。具体而言，作为正向引物及反向引物，可以使用序列号42、43分别所示的碱基序列的引物。另外，作为PCR装置，也可以使用通常的循环变温加热器等。
作为本实施方式的PCR反应液，优选使用例如由以下的组成构成的反应液。即，可以适当使用含有核酸合成基质(dNTPmixture(dCTP、dATP、dTTP、dGTP)、引物组、核酸合成酶(Nova Taq聚合酶等)、标识成分(Cy5-dCTP等)、试样的基因组DNA、缓冲液、及作为剩余的容量部分的水的PCR反应液。需要说明的是，作为缓冲液，例如可以使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所)。
作为本实施方式的霉菌的检查方法中的PCR反应条件，例如优选如下。
(a)95℃10分钟、(b)95℃(DNA改性工序)30秒、(c)56℃(退火工序)30秒、(d)72℃(DNA合成工序)60秒(将(b)～(d)循环40次)、(e)72℃10分钟
(4)利用DNA芯片的检测
本实施方式的DNA芯片只要是将选自检测对象的霉菌的DNA的探针固定了的芯片即可，在其他方面没有特别限定。可以使用例如点型DNA芯片、合成型DNA芯片等。
具体而言，将与通过本实施方式的霉菌的检查方法的PCR反应液中包含的引物组而扩增的扩增区域相结合的探针预先合成，将其固定到DNA芯片的基板上。例如，作为唯特里库拉曲霉(Aspergillus vitricola)检测用的探针，可以使用含有序列号44所示的碱基序列的探针。另外，作为帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)检测用的探针，可以使用含有序列号45所示的碱基序列的探针。另外，作为散囊属菌(Eurotium sp.)检测用的探针，可以使用含有序列号46所示的碱基序列的探针。
接着，将PCR扩增产物滴加到DNA芯片上，检测上述霉菌检测用探针上杂交的PCR扩增产物的标识。具体而言，例如可以如下进行。
首先，在PCR扩增产物中混合规定的缓冲液，滴加到DNA芯片上。
接着，将DNA芯片在45℃下静置1小时，然后，通过规定的缓冲液从DNA芯片上冲洗没有杂交的PCR产物。
另外，将DNA芯片装在标识检测装置上进行标识的检测，判定检测对象霉菌是否存在。需要说明的是，作为标识检测装置，例如，可以使用荧光扫描装置等通常的装置。需要说明的是，标识及其检测方法不限于荧光，也可以使用其他方法。
如以上所说明，根据本实施方式的霉菌的检查方法，使用对嗜干性、耐干性、及嗜湿性的任一种霉菌均能够培养的培养基，能够同时培养多种霉菌。另外，将培养后的霉菌混合，一次性提取基因组DNA，使用DNA芯片，能够同时并且特异性地检出多种霉菌中的各个霉菌。
因此，无需将采集的霉菌进行分离培养，能够迅速地统一简便地检测多种霉菌。
实施例
以下，对使用本发明的霉菌的检测方法、PCR用反应液、及霉菌检测用载体进行的试验具体地进行说明。
(试验1)
本发明的霉菌的检测方法中，为了考查通过使用多重PCR的DNA芯片分析来检测各种霉菌时能够将ITS区域和β-微管蛋白基因二者同时扩增的、PCR用反应液中的各引物组的浓度范围，进行了试验1。
检测对象霉菌使用从施设环境中采集的野生霉菌。即，使用空气取样器采集施设环境内的空气，将其吹入样品A～D的各培养基中进行培养。培养在25℃的暗处静置7日来进行。
接着，对每个样品分别采集在培养基上生成的各种霉菌的菌落的一部分，分别在25℃的暗处进行7～10日分离培养，将各菌落用于DNA序列分析，确认其菌种。将其结果示于图4。需要说明的是，DNA序列分析委托Takara-bio株式会社通过DNA测序仪进行。以下也同样。
另外，对每个样品统一采集在培养基上生成的各种霉菌的菌落，放入装有φ0.5mm氧化锆微珠的小瓶中，浸入液氮来冻结试样后，使用振荡装置，将霉菌的细胞破碎。
接着，对每个样品通过DNA提取装置提取霉菌的基因组DNA，通过PCR法，将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因同时扩增。
此时，作为ITS区域扩增用引物组，使用图2所示的由序列号1的碱基序列构成的正向引物(F引物)及由序列号2的碱基序列构成的反向引物(R引物)。另外，作为β-微管蛋白基因扩增用引物组，使用图2所示的由序列号3的碱基序列构成的正向引物及由序列号4的碱基序列构成的反向引物。需要说明的是，均使用由Operon Technologies株式会社合成的引物组。
另外，作为PCR用反应液，关于样品A～D分别使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)，制作如下组成的PCR用反应液20μl。
1.Ampdirect(G／Crich)4.0μl
2.Ampdirect(addition-4)4.0μl
3.dNTPmix1.0μl
4.Cy-5dCTP0.2μl
5.ITS1-Fw引物(10μM)1.0μl
6.ITS1-Rv引物(10μM)1.0μl
7.BtF引物(10μM)1.0μl
8.BtR引物(10μM)1.0μl
9.模板DNA(对每个样品A～D分别)1.0μl
10.Nova Taq聚合酶0.2μl
11.水(加水至整体达到20.0μl)
另外，作为ITS区域扩增用引物，制作分别以如下比例配合正向引物及反向引物、且其他方面与上述同样的4种PCR用反应液。
引物(9μM)0.9μl
引物(8μM)0.8μl
引物(5μM)0.5μl
引物(2.5μM)0.25μl
引物(1.25μM)0.125μl
引物(1μM)0.1μl
引物(0.625μM)0.0625μl
如上所述，作为β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的终浓度比，每个样品A～D分别制作以下的5种，分别进行试验。
(i)0.5μM：0.5μM
(ii)0.5μM：0.45μM
(iii)0.5μM：0.40μM
(iv)0.5μM：0.25μM
(v)0.5μM：0.125μM
(vi)0.5μM：0.0625μM
(vii)0.5μM：0.050μM
(viii)0.5μM：0.03125μM
使用上述各PCR用反应液，通过核酸扩增装置(TaKaRa PCR ThermalCycler Dice(R)Gradient Takara-bio株式会公司制)，在如下条件下进行DNA的扩增。
(a)95℃10分钟
(b)95℃30秒
(c)56℃30秒
(d)72℃60秒(将(b)～(d)循环40次)
(e)72℃10分钟
在DNA芯片上，使用基因硅(R)(东洋钢钣株式会公司制)，将图3所示的探针中的以下探针固定后使用。
<选自ITS区域的探针>
(1)散囊属菌序列号6、7
(2)帚状曲霉种菌序列号9～11
(3)唯特里库拉曲霉种菌序列号13
(4)局限曲霉复合种菌序列号16～20
(5)构巢曲霉复合种菌序列号22
(7)黄曲霉复合种菌序列号26
(8)青霉属菌序列号28
(11)支孢属菌序列号37
(12)霉菌共同序列号40
<选自β-微管蛋白基因的探针>
(1)散囊属菌序列号8
(2)帚状曲霉种菌序列号12
(3)唯特里库拉曲霉种菌序列号15
(4)局限曲霉复合种菌序列号21
(5)构巢曲霉复合种菌序列号23
(7)黄曲霉复合种菌序列号27
(8)青霉属菌序列号30
(12)霉菌共同序列号41
接着，在PCR扩增产物中混合缓冲液(3×SSC柠檬酸-生理盐水+0.3％SDS)，在94℃下加热5分钟，滴加到上述DNA芯片上。
将该DNA芯片在45℃下静置1小时，使用上述缓冲液从DNA芯片上冲洗没有杂交的PCR产物。
接着，将DNA芯片装在标识检测装置(GenePix4100A molecularDevices公司制)上，测定各探针中的荧光强度，对每个引物组的浓度比计算出ITS区域用探针中的荧光强度、及β-微管蛋白基因用探针中的荧光强度的平均值。将其结果示于图5～图8。图5示出了关于使用样品A时的引物组的各种浓度比的荧光强度，图6示出了关于使用样品B时的引物组的各种浓度比的荧光强度，图7示出了关于使用样品C时的引物组的各种浓度比的荧光强度，图8示出了关于使用样品D时的引物组的各种浓度比的荧光强度。
另外，图9～图12分别示出了关于使用样品A～D时的引物组的各种浓度比的每个探针的荧光强度。需要说明的是，图5～图8中的“N”分别表示图9～图12中的探针数。图15中也同样。
(试验2)
为了确认DNA芯片分析中的荧光强度与利用PCR的扩增产物量的相关关系，进行了试验2。
具体而言，关于试验1的样品B、C分别使用β-微管蛋白基因用引物组的终浓度与ITS区域用引物组的终浓度之比为如下的5种PCR用反应液，与试验1同样地进行PCR。
(泳道1)0.5μM：0.5μM
(泳道2)0.5μM：0.25μM
(泳道3)0.5μM：0.125μM
(泳道4)0.5μM：0.0625μM
(泳道5)0.5μM：0.03125μM
另外，使用MultiNA(R)(株式会社岛津制作所制)对得到的扩增产物进行分析。将其结果示于图13。
如该图所示，在样品B中，关于β-微管蛋白基因，泳道1的条带浅浅地显示，泳道2条带略浓显示，泳道3～5的条带浓显示。另外，关于ITS区域，泳道1、2的条带浓显示，泳道3条带略浓显示，泳道4、5的条带薄显示。其结果，与图6所示的样品B的DNA芯片分析中的荧光强度对应。
另外，在样品C中，关于β-微管蛋白基因，泳道1、2的条带浅浅地显示，泳道3～5的条带相对于较浓地显示。另外，关于ITS区域，泳道1～3的条带浓显示，泳道4、5的条带浅浅地显示。其结果，与图7所示的样品C的DNA芯片分析中的荧光强度对应。
由上确认了，在DNA芯片分析中的荧光强度与利用PCR的扩增产物量之间具有相关关系。
(试验3)
为了确认能够同时检测ITS区域和β-微管蛋白基因二者的引物组浓度，使用试验1和单独的样品，再次进行同样的试验。
检测对象霉菌与试验1同样地使用将从施设环境中采集的野生霉菌吹入样品E～H的各培养基中并进行培养后的霉菌。将该样品E～H的培养基上生成的各种霉菌的菌落分离培养，将各菌落用于DNA序列分析，确认其菌种。将其结果示于图4。
另外，对每个样品一次性采集在培养基上生成的各种霉菌的菌落，将霉菌的细胞破碎，提取基因组DNA，通过PCR法将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因扩增。
此时，引物与试验1同样地使用：图2所示的由序列号1及序列号2的碱基序列构成的ITS区域扩增用引物组、和由序列号3及序列号4的碱基序列构成的β-微管蛋白基因扩增用引物组。
另外，作为PCR用反应液，对于样品E～H分别使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)，制作如下组成的反应液20μl。
1.Ampdirect(G／Crich)4.0μl
2.Ampdirect(addition-4)4.0μl
3.dNTPmix1.0μl
4.Cy-5dCTP0.2μl
5.ITS1-Fw引物(5μM)0.5μl
6.ITS1-Rv引物(5μM)0.5μl
7.BtF引物(10μM)1.0μl
8.BtR引物(10μM)1.0μl
9.模板DNA(对每个样品E～H分别)1.0μl
10.Nova Taq聚合酶0.2μl
11.水(加水至整体达到20.0ul)
另外，作为PCR用反应液，对于样品E～H分别制作使ITS区域扩增用引物如如下、其他组成与上述相同的反应液20μl。
ITS1-Fw引物(2.5μM)2.5μM
ITS1-Rv引物(2.5μM)2.5μM
这样，作为β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的终浓度比，对每个样品制作0.5μM：0.25μM和0.5μM：0.125μM这2种PCR用反应液，分别进行试验。PCR的反应条件与试验1同样。
另外，在DNA芯片上固定图3所示的探针中的以下的探针后使用。关于其他方面，与试验1同样操作，测定探针中的荧光强度，对每个引物组的浓度比计算出ITS区域用探针中的荧光强度、及β-微管蛋白基因用探针中的荧光强度的平均值。将其结果示于图14。需要说明的是，该图中的“N”分别表示探针数×3次(试验次数)。
<选自ITS区域的探针>
(1)散囊属菌序列号6
(2)帚状曲霉种菌序列号9
(8)青霉属菌序列号29
(11)支孢属菌序列号37
(12)霉菌共同序列号40
<选自β-微管蛋白基因的探针>
(1)散囊属菌序列号8
(2)帚状曲霉种菌序列号12
(4)局限曲霉复合种菌序列号21
(12)霉菌共同序列号41
参照图14中的样品E～H时，与β-微管蛋白基因用引物组的终浓度与ITS区域用引物组的终浓度之比为0.5μM：0.25μM(1：1／2)的情况相比，0.5μM：0.125μM(1：1／4)的情况下ITS区域和β-微管蛋白基因二者的探针的荧光强度均增大。
因此，为了基于这两者的检测结果判定霉菌是否存在，可以认为将β-微管蛋白基因用引物组终浓度与ITS区域用引物组终浓度之比设为0.5μM：0.125μM是最佳的。
(试验4)
检验以从施设环境集采的样品A～H中包含的不是野生霉菌的各种霉菌作为对象的情况下，是否能够通过本发明的将ITS区域及β-微管蛋白基因作为靶区域的霉菌的检测方法来检测。
作为检测对象霉菌，将以下的4种菌株1～4混合使用。
1.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株No.JCM10253
2.腐皮镰孢霉菌(Fusarium solani)菌株No.NBRC5232
3.黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)菌株No.NBRC5369
4.球孢枝孢(Cladsoporium sphaerospermum)菌株No.JCM11787需要说明的是，上述菌株从以下的机关获得。
JCM：独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(Japan Collection of Microorganisms)
NBRC：独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程本部生物遗传资源部门(NITE Biological Resource Center)
将这些菌株接种在培养基上，在25℃的暗处静置7日培养后，一次性采集各菌株的霉菌的菌落，与试验1同样地提取霉菌的基因组DNA，通过PCR法将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因同时扩增。
此时，与试验3同样地制作β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的终浓度比为0.5μM：0.25μM、和0.5μM：0.125μM这2种PCR用反应液。另外，在各PCR用反应液中，对于试样的DNA而言，分别含有菌株1～4各1.0μl合计4.0μl。另外，通过各个PCR用反应液将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因扩增。
另外，在DNA芯片上固定图3所示的探针中的以下的探针后使用。
另外，使利用PCR的扩增产物与探针杂交，测定探针中的荧光强度，对每个引物组的浓度比计算出ITS区域用探针中的荧光强度、及β-微管蛋白基因用探针中的荧光强度的平均值。关于其他方面，与试验1同样地进行。将其结果示于图15。另外，图16中示出了每个引物组的浓度比以及每个探针的荧光强度。
<选自ITS区域的探针>
(6)烟曲霉复合种菌序列号24
(9)黑葡萄穗霉种菌序列号33
(10)腐皮镰孢种菌序列号35
(11)支孢属菌序列号37
(12)霉菌共同序列号40
<选自β-微管蛋白基因的探针>
(6)烟曲霉复合种菌序列号25
(9)黑葡萄穗霉种菌序列号34
(10)腐皮镰孢种菌序列号36
(12)霉菌共同序列号41
参照图15时，关于β-微管蛋白基因用引物组的浓度与ITS区域用引物组的终浓度之比为0.5μM：0.25μM(1：1／2)及0.5μM：0.125μM(1：1／4)的任一种情况，ITS区域用探针和β-微管蛋白基因用探针二者中的荧光强度显示出对检测充分的值。
因此确认了，对于上述4种菌株1～4，能够通过本发明的将ITS区域及β-微管蛋白基因作为靶区域的霉菌的检测方法来测定。
需要说明的是，关于球孢枝孢菌，在β-微管蛋白基因用探针中，无法测定荧光。因此，对能够检测支孢属菌的方法进行研究，进行以下的试验5、6。
(试验5)
试验4中，如上所述，在使用β-微管蛋白基因扩增用引物组(序列号3、4)的情况下，关于球孢枝孢菌，在β-微管蛋白基因用探针中，没有检测到荧光。
另外，试验4中，在DNA芯片上固定能够与β-微管蛋白基因互补结合的探针，在该探针中，没有检测到荧光的理由不明确。
另外，设计支孢属菌专用的新型β-微管蛋白基因扩增用正向引物(序列号5)，使用包括该引物和上述反向引物(序列号4)的引物组，将球孢枝孢菌的β-微管蛋白基因扩增，进行用于确认在β-微管蛋白基因用探针中是否检测到荧光的试验。
作为检测对象霉菌，将与试验4相同的4种菌株1～4混合使用。
另外，作为PCR用反应液，制作β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的终浓度比为0.5μM：0.25μM和0.5μM：0.125μM的反应液，并且对它们分别制作以终浓度达到0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM的方式添加了支孢属菌专用的β-微管蛋白基因扩增用正向引物的8种PCR用反应液。
具体而言，使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)，制作如下组成的反应液20μl，与试验1同样操作，将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因扩增。
1.Ampdirect(G／Crich)4.0μl
2.Ampdirect(addition-4)4.0μl
3.dNTPmix1.0μl
4.Cy-5dCTP0.2μl
5.ITS1-Fw引物(5μM，2.5μM)0.5μl，0.25μl
6.ITS1-Rv引物(5μM，2.5μM)0.5μl，0.25μl
7.BtF引物(10μM)1.0μl
8.BtR引物(10μM)1.0μl
9.ClaS-beta2(0μM，10μM，5μM，2.5μM)0μl，1.0μl，0.5μl，0.25μl
10.模板DNA(菌株1～4各1.0μl)4.0μl
11.NovaTaq聚合酶0.2μl
12.水(加水至整体达到20.0μl)
在DNA芯片上仅固定图3所示的探针中对的球孢枝孢菌特异性的探针(序列号39)后使用。另外，关于其他方面，与试验1同样操作，使利用PCR的扩增产物与探针杂交，测定该探针中的荧光强度。将其结果示于图17。
如图17所示可知，在β-微管蛋白基因用引物组的浓度与ITS区域用引物组的终浓度之比为0.5μM：0.25μM(1：1／2)～0.5μM：0.125μM(1：1／4)的情况下，并且特别是将支孢属菌专用正向引物的终浓度设为0.5μM～0.25μM的情况下，对于支孢属菌得到高荧光强度。
(试验6)
针对试验5中使用的支孢属菌专用正向引物(序列号5)对球孢枝孢菌特异性的探针(序列号39)以外的探针中的荧光强度带来的影响进行验证。
作为检测对象霉菌，将与试验4相同的4种菌株1～4混合使用。
另外，作为PCR用反应液，制作使β-微管蛋白基因扩增用引物组与ITS区域扩增用引物组的终浓度比为0.5μM：0.125μM、并且以终浓度达到0μM、0.5μM、0.25μM的方式添加了支孢属菌专用的β-微管蛋白基因扩增用正向引物的3种PCR用反应液。
具体而言，使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)，制作如下组成的反应液20μl，与试验1同样操作，将各霉菌的ITS区域与β-微管蛋白基因扩增。
1.Ampdirect(G／Crich)4.0μl
2.Ampdirect(addition-4)4.0μl
3.dNTPmix1.0μl
4.Cy-5dCTP0.2μl
5.ITS1-Fw引物(2.5μM)0.25μl
6.ITS1-Rv引物(2.5μM)0.25μl
7.BtF引物(10μM)1.0μl
8.BtR引物(10μM)1.0μl
9.ClaS-beta2(0μM，10μM，5μM)0μl，1.0μl，0.5μl
10.模板DNA(菌株1～4各1.0μl)4.0μl
11.NovaTaq聚合酶0.2μl
12.水(加水至整体达到20.0ul)
另外，在DNA芯片上固定图3所示的探针中的与试验4相同的菌株1～4的探针后使用。关于其他方面，与试验1同样操作，使利用PCR的扩增产物与探针杂交。
另外，测定各探针中的荧光强度，对支孢属菌专用的β-微管蛋白基因扩增用正向引物的每个浓度，计算出ITS区域用探针中的荧光强度、及β-微管蛋白基因用探针中的荧光强度的平均值。将其结果示于图18。
如图18所示，通过将支孢属菌专用β-微管蛋白基因扩增用正向引物加入多重PCR用反应液中，球孢枝孢菌特异性的探针以外的选自β-微管蛋白的探针的荧光强度降低。关于该荧光强度的降低的程度，与支孢属菌专用β-微管蛋白基因扩增用正向引物的浓度为0.5μM的相比，0.25μM的更轻微。因此可知，支孢属菌专用β-微管蛋白基因扩增用正向引物的浓度为0.25μM是适当的。
接着，对基于本发明的霉菌的检查方法的霉菌检测的试验结果，进行具体说明。
(试验7：基于各种培养基组成的水分活性值的培养试验)
在PDA(Potato Dextrose Agar)培养基和MY(Malt+Yeast)培养基中添加糖等，制作由示出了各种水分活性值的培养基组成构成的各种培养基，培养嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌，对各个培养结果进行评价。
1.培养基的制作方法
(1)PDA培养基
在PDA(DIFCO公司制)中以各种比例添加葡萄糖(和光纯药工业株式会社)和／或者蔗糖(和光纯药工业株式会社)，在1L的离子交换水中混悬，在高压釜中熔解后，分注到培养皿中来制作。需要说明的是，在培养皿分注前，为了防止细菌增殖，添加氯霉素(和光纯药工业株式会社)以达到最终浓度50ppm。关于MY培养基也同样。
(2)MY培养基
在以下的MY中以各种比例添加蔗糖(和光纯药工业株式会社)、葡萄糖、琼脂(和光纯药工业株式会社)及甘油中的至少任一种，在100ml的离子交换水中混悬，在高压釜中熔解后，分注到培养皿中来制作。
MY：麦芽(Malt Extract，DIFCO公司制)+酵母(Yeast Extract，DIFCO公司制)
2.培养基的水分活性值的测定
关于用于实际培养的培养基的规定量，使用ROTRONIC水分活性测定装置(GSI Creos公司制)，在专用密闭容器内测定其水分活性值。
3.培养评价
使用通过上述制作方法制作的各种培养基(图19的实施例1-10、参考例1-6)，将嗜干性霉菌(Eurotium herbariorum)、耐干性霉菌(A.niger)、嗜湿性霉菌(Fusarium sp.)在25℃下在暗处培养72小时，测定得到的菌落的直径。将培养后的菌落的直径为10mm以上设为○，将低于10mm设为×。将其结果示于图19。
如该图所示可知，使用实施例1-10的各种培养基的情况下，嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌均充分地繁殖。另一方面可知，使用参考例1-6的各种培养基的情况下，存在没有充分繁殖的菌种。因此可知，为了同时培养多种菌种，优选水分活性值低于1.0且0.90以上、并且糖浓度为5％～50％的范围。
(试验8：基于各种培养基的培养试验)
使用图19所示的参考例1、2、4-6及实施例7的6种培养基，将各种霉菌在25℃、暗处培养168小时，测定得到的菌落的直径。
作为供试菌种，使用以下的14种菌种。将结果示于图20。其中，1-4的供试菌种为嗜干性的霉菌，5-10的供试菌种为耐干性的霉菌，11-14的供试菌种为嗜湿性的霉菌。需要说明的是，这些供试菌种是从环境中单独采集并鉴定而得到的，为了方便提供其编号。
1.帚状曲霉(A.penicillioides，K-7-4)
2.局限曲霉(A.restrictus，I-2-1)
3.蜡叶散囊菌(Eurotium herbariorum，亻2-1)
4.西比小尖霉(Wallemia sebi，KSS-1127)
5.黄曲霉(A.flavus，B-3-3)
6.烟曲霉(A.fumigatus，KSS-1126)
7.黑曲霉(A.niger，A-1-1)
8.杂色曲霉(A.versicolor，亻3-1)
9.光孢青霉(Penicillium glabrum，B-4-3)
10.皱褶青霉(P.rugulosum，E-2-3)
11.球孢枝孢菌(Cladosporium.sphaerospermum，I-4-2)
12.枝状枝孢菌(C.cladosporioides，A-2-1)
13.镰刀菌属菌(Fusarium sp.，B5-3-C)
14.葡萄穗霉属菌(Stachybotrys sp.，KSS-1125)
如图20所示可知，根据实施例7的培养基(M40Y)，能够形成适于生长的湿度不同的多种霉菌的菌落，上述1-14的所有菌种充分地繁殖。
这样可知，如果使用实施例7的培养基，则能够将关于最佳湿度的性质不同的多种霉菌在相同的培养基中同时培养。
(试验9：基于各种温度的培养试验)
使用实施例7中使用的M40Y培养基，在各种温度下进行培养，测定得到的菌落的直径。供试菌种与试验1同样地使用包含嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌的14种，在暗处培养168小时。将其结果示于图21。另外，关于3、8、13的菌种，图22中示出了菌落的照片。
如图21的实施例11-13所示可知，培养温度为23℃～27℃的范围时，嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌均充分地繁殖。另一方面，如参考例7-9所示可知，培养温度为30℃～35℃的范围时，存在不能生长的菌种。因此可知，为了同时培养多种菌种，优选将培养温度设为25℃±2℃的范围。
(试验10：DNA芯片分析试验)
使用实施例7中使用的M40Y培养基，培养各种霉菌，将得到的菌落混合，一次性提取基因组DNA，通过PCR法将ITS1区域扩增，通过DNA芯片检查扩增产物中是否包含检测对象霉菌。另外，为了验证利用DNA芯片的检查结果，进行了DNA序列分析。具体而言，如下进行。
首先，作为实施例7中使用的使用了M40Y培养基的检体，准备No.1至No.60的60个检体。接着，使用空气取样器，从通常环境中采集空气，吹入上述各检体进行培养。培养在25℃的暗处静置7日来进行。
接着，对于每个检体将在培养基上生成的各种霉菌的菌落用于DNA序列分析，因此，单独地采集各菌落的一部分，分别在25℃的暗处进行分离培养7-10日。
另外，对每个检体一次性采集在培养基上生成的各种霉菌的菌落，放入装有φ0.5mm氧化锆微珠的小瓶中，浸入液氮中冻结试样后，使用振荡装置，将霉菌的细胞破碎。
接着，对每个检体通过DNA提取装置提取霉菌的基因组DNA，通过PCR法将各霉菌的ITS区域扩增。
具体而言，作为PCR反应液，使用Ampdirect(R)(株式会社岛津制作所制)，制作如下组成的反应液20μl。
1.Ampdirect addition(G／Crich)4.0μl
2.Ampdirect(addition-4)4.0μl
3.dNTPmixture1.0μl
4.Cy5-dCTP0.2μl
5.ITS1区域扩增用正向引物(10μM，序列号42，由Sigma-Aldrich公司合成)1.0μl
6.ITS1区域扩增用反向引物(10μM，序列号43，由Sigma-Aldrich公司合成)1.0μl
7.试样的基因组DNA1.0μl
8.NovaTaq聚合酶0.2μl
9.水(加水至整体达到20.0μl)
使用该PCR反应液，通过核酸扩增装置(TaKaRa PCR Thermal CyclerDice(R)Gradient Takara-bio株式会公司制)，在如下条件下进行DNA的扩增。
1.95℃10分钟
2.95℃30秒
3.56℃30秒
4.72℃60秒(将2～4循环40次)
5.72℃10分钟
在DNA芯片上使用基因硅(R)(东洋钢钣株式会公司制)而在其上固定含有序列号44、序列号45、序列号46所示的碱基序列的探针后使用。这些分别为唯特里库拉曲霉(Aspergillus vitricola)检测用的探针、帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)检测用的探针、及散囊属菌(Eurotium sp.)检测用的探针。
接着，在PCR扩增产物中混合缓冲液(3×SSC柠檬酸-生理盐水+0.3％SDS)，滴加到上述DNA芯片上。
将该DNA芯片在45℃下静置1小时，使用上述缓冲液从微阵列上冲洗没有杂交的PCR产物。
接着，将DNA芯片装在标识检测装置(基因硅专用扫描BIOSHOT东洋钢钣株式会公司制)中，测定各探针的荧光强度。将其结果示于图23-25。
另外，进行每个检体中包含的菌种的DNA序列分析，因此，如上所述从将每个菌落分离培养而得到的菌种中提取基因组DNA，通过PCR法得到扩增产物。
此时，引物组使用含有序列号42及43所示的碱基序列的引物组，并且核酸合成酶中使用TAKARA ExTaq聚合酶。另外，核酸扩增装置使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R)Gradient(Takara-bio株式会公司制)，此外与上述同样地操作，进行PCR反应。
将通过该PCR反应得到的扩增产物、和含有序列号47及48所示的碱基序列的引物组作为序列用引物，委托Takara-bio株式会社，通过DNA测序仪进行ITS1区域的序列分析。其结果，如图23-25所示，由各检体最大确认4个菌种。
在图23-25的“DNA芯片分析(探针荧光强度)”中，将被认为是阳性的部分用粗框包围。这些在“通过ITS序列分析确认的检体中包含的菌种”中分别表示相同的菌种。
需要说明的是，基于通过ITS序列分析可知包含耐干性霉菌(Penicillium sp.)、及嗜湿性霉菌(Cladosporium sp.)的检体No.3，使用将Penicillium sp检测用探针及Cladosporium sp检测用探针固定的DNA芯片，与上述同样操作，通过标识检测装置测定荧光强度，结果确认检测出这些菌种(Penicillium sp.，Cladosporium sp.)。
因此可知，通过本发明的霉菌的检查方法，将多种霉菌在相同的培养基中同时培养的情况下，能够将各霉菌特异性地检测。
本发明不限于以上的实施方式和实施例，在本发明的范围内，当然可以实施各种变更。
例如，关于上述试验的PCR用反应液中的ITS区域扩增用引物组及β-微管蛋白基因扩增用引物组以外的成分，可以适当变更。另外，只要为使用这些扩增产物进行对象霉菌的检测的方法，可以不是使用如上所述的DNA芯片进行荧光检测的方法，而是通过基于电泳的检测、电流检测方式等其他检测方式的DNA芯片来检测扩增产物的方法等。
另外，上述实施例中，作为培养基使用M40Y等，但不限于这些，可以进行使用水分活性值低于1.0且0.90以上、并且糖浓度为5％～50％的固体培养基以外的固体培养基等适当变更。
产业上的可利用性
本发明在环境检查、食品检查、免疫学的环境检查、临床试验、家畜卫生等中特异性并且多重地检测多种霉菌的情况下能够适当地利用。另外，可以适用于食品制造现场、临床现场、文化财产的保护环境等中的霉菌的检查。
Claims (5)
1.一种非疾病的诊断和治疗用途的霉菌的检测方法，包括使霉菌的DNA中的包含靶区域的DNA片段扩增，确认有无扩增产物的工序，其特征在于，
使用ITS区域以及β-微管蛋白基因两者作为所述靶区域，
在用于进行所述靶区域的扩增的PCR用反应液中，使用用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组和用于使ITS区域扩增的引物组，
使用由仅含有序列号1所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号2所示碱基序列的反向引物构成的引物组，来作为用于使ITS区域扩增的引物组，并且使用由仅含有序列号3所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号4所示碱基序列的反向引物构成的引物组，来作为用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组,
以所述PCR用反应液中用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组与用于使ITS区域扩增的引物组的浓度比为1：0.5～1：0.25，针对一种或两种以上霉菌中的每一种，使所述靶区域两者同时扩增。
2.根据权利要求1所述的霉菌的检测方法，其特征在于，在用于进行所述靶区域的扩增的所述PCR用反应液中，作为用于扩增支孢属菌的β-微管蛋白基因的引物组，还使用由仅含有序列号5所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号4所示碱基序列的反向引物构成的引物组。
3.根据权利要求1或2所述的霉菌的检测方法，其特征在于，所述霉菌为散囊属菌(Eurotium sp.)、帚状曲霉种菌(Aspergillus penicillioides)、唯特里库拉曲霉种菌(Aspergillus vitricola)、局限曲霉复合种菌(AspergillusSection Restricti)、构巢曲霉复合种菌(Aspergillus Section Nidulantes)、烟曲霉复合种菌(Aspergillus Section Fumigati)、黄曲霉复合种菌(AspergillusSection Flavi)、青霉属菌(Penicillium sp.)、黑葡萄穗霉种菌(Stachybotryschartarum)、腐皮镰孢种菌(Fusarium solani)、支孢属菌(Cladosporium sp.)中的至少任一种。
4.一种PCR用反应液，其是用于针对一种或两种以上霉菌中的每一种使DNA中的ITS区域和β-微管蛋白基因的靶区域两者同时扩增的PCR用反应液，其特征在于，包含：
作为用于使ITS区域扩增的引物组的、由仅含有序列号1所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号2所示碱基序列的反向引物构成的引物组；和
作为用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组的、由仅含有序列号3所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号4所示碱基序列的反向引物构成的引物组，
所述用于使β-微管蛋白基因扩增的引物组与所述用于使ITS区域扩增的引物组的浓度比为1：0.5～1：0.25。
5.根据权利要求4所述的PCR用反应液，其特征在于，作为用于扩增支孢属菌的β-微管蛋白基因的引物组，还使用由仅含有序列号5所示碱基序列的正向引物及仅含有序列号4所示碱基序列的反向引物构成的引物组。
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