KR20180008785A - 미생물의 검사 방법, 미생물의 검사 키트, 미생물 검사용 마이크로어레이, 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트 - Google Patents

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Abstract

플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 적절하게 검출하는 것을 가능하게 한다. 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경 중에서 시료를 채취하고, 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR에 의한 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물의 검사 방법으로서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 이러한 균의 유무를 판정한다.

Description

미생물의 검사 방법, 미생물의 검사 키트, 미생물 검사용 마이크로어레이, 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트
본 발명은 생물의 종류 등을 유전자 서열에 따라 특정하는 유전자 검사 기술에 관한 것이며, 특히 토양 전염성 병해에 관련된 식물 병원균을 검출하기 위한 미생물의 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식물 병해의 병원균인 곰팡이를 검출하기 위한 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트에 관한 것이다.
최근 식품 검사나 환경 검사 등에서 식품이나 환경에 존재하는 곰팡이나 식중독균 등의 미생물의 종류를 특정하기 위해 PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 법 등의 핵산 증폭법을 이용하여 표적으로 하는 유전자에서의 DNA를 증폭하고 증폭 산물을 검출하여 미생물의 종류를 판정하는 것이 행해지고 있다.
한편, 식물 조직 또는 토양이나 물에 존재하는 토양 전염성 병해에 관한 식물 병원균에는 식품 검사나 환경 검사 등에 있어서의 검출 대상균과는 계(界)가 다른 것이 존재하고, 이들 검출 대상균의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여도 토양 전염성 병해균의 DNA를 증폭시키는 것은 어려웠다.
또한, 최근 식품 제조 현장이나 임상 현장, 농업 현장, 문화재 보호 환경 등에서 곰팡이 등의 미생물이 존재하는지 여부를 검사하여 안전성, 건전성을 확인함과 동시에 그 번식을 방지하는 것이 중요해지고 있다.
이러한 곰팡이 검사에서는 일반적으로 환경 중에서 시료를 채취하여 전배양하고, 이어서 균종 마다에 가장 적합한 배지에서 20 일 정도 배양한 후에, 형태적 특징을 관찰함으로써 곰팡이를 식별하는 형태 관찰법 (배양법)이 이루어지고 있다 (특허 문헌 3 참조).
그러나, 이 방법으로는 곰팡이 종마다 분리 배양하는 것이 필요하기 때문에, 검사 공정이 복잡하게 된다는 문제가 있었다. 또한 배양에 장기간이 소요되므로, 예를 들면 인간이 생활하는 실내의 검사나 먹는 물건의 검사, 농업 현장에서의 식물 병해 진단 등 신속성이 요구되는 검사에는 부적절하다는 문제가 있었다. 또한 형태적 특징을 나타내는 포자가 형성되지 않으면 식별하지 못하고, 노력이 낭비되어 버리는 경우가 있다는 문제도 있었다.
또한 최근에는 곰팡이 검사에서 유전자를 이용한 식별법도 이루어지고 있다. 예를 들면, 환경 중에서 채취한 곰팡이를 배양한 후 배양된 곰팡이에서 DNA를 추출하여 PCR 법 등에 의해서 표적 영역을 증폭하고, 증폭 산물을 해석함으로써 환경중의 곰팡이를 식별하는 일이 이루어지고 있다. 증폭 산물을 해석하는 방법으로서는 전기 영동에 의해 증폭 산물의 크기를 분석하는 방법과 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 프로브를 고정화한 DNA 칩을 이용하는 방법 등이 제안되어 있다 (특허 문헌 4, 5 참조).
[특허 문헌 1] 일본특허공개공보 특개평10-234399호 공보 [특허 문헌 2] 일본특허공보 특허 제5522820호 공보 [특허 문헌 3] 일본특허공개공보 특개2007-195454호 공보 [특허 문헌 4] 일본특허공보 특허 제5670623호 공보 [특허 문헌 5] 일본특허공보 특허 제5196848호 공보 [특허 문헌 6] 일본특허공보 특허 제5522820호 공보 [특허 문헌 7] 일본특허공보 특허 제5077984호 공보 [특허 문헌 8] 일본특허공개공보 특개평10-234381호 공보
여기서, 본 발명자들은 토양 전염성 식물 병원균 중에서도 특히 배추 등에 뿌리 혹병을 발병시키는 플라스모디오포라 (Plasmodiophora) 속 균과, 오이과 야채 등에 묘마름병 등을 발병시키는 피시움 (Pythium)속 균과 감자 등에 전염병을 발병시키는 피토프토라 속 (Phytophthora) 균을 검출 대상균으로 선택하였다.
그리고, 본 발명자들은 예의 연구하여, 이들 검출 대상균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 표적 영역으로서 적합하게 증폭할 수 있는 프라이머 세트와, rDNA 유전자 (리보솜 RNA 유전자) ITS 영역을 대상 영역으로서 적합하게 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 개발함과 동시에, 각각의 증폭 산물을 특정한 프로브 (DNA 칩 기판상의 1 가닥 사슬 올리고 DNA)를 갖춘 마이크로어레이를 개발하고, 이들 병원균을 특이적으로 검출하는 데 성공하였다.
여기서, 특허 문헌 1에는 피시움 속 균을 간편, 신속하고 고감도로 검출 또는 동정하기 위한 올리고 뉴클레오티드가 개시되어 있다. 또한, 특허 문헌 2에는 피토프토라 속 균을 검출할 수 있는 딸기의 중요한 질병의 병원균 검출 방법 및 검출용 프라이머가 개시되어 있다.
그러나 이러한 기술로는 플라스모디오포라 속 균을 검출할 수는 없었다. 또한 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 보다 적절하게 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
또한 곰팡이의 검사에서 유전자를 이용한 식별법으로 DNA 칩을 사용하는 경우에는 먼저 검출대상인 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역에 특이적으로 결합하는 프로브를 제작하여 DNA 칩에 고정화한다. 그리고 환경 또는 제품이나 식물의 검체 중에서 채취한 곰팡이를 배양하고, 곰팡이의 DNA를 추출하여 PCR 법 등에 의해서 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 증폭한다. 또한 그 증폭 산물을 DNA 칩에 떨어뜨려(적하하여) 증폭 산물을 프로브에 하이브리다이즈 (혼성화, hybridize)시키고 증폭 산물에 포함된 표지의 형광 강도 등을 측정하여 곰팡이를 검출한다.
그런데 환경중의 검출대상인 곰팡이는 다양한 종류가 있기 때문에 1 개의 DNA 칩으로 복수의 곰팡이를 동시에 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 이를 위해서는, DNA 칩상에 복수의 곰팡이에서 선택된 프로브를 고정화할 필요가 있다.
한편, 프로브에 하이브리다이즈시키는 표적 영역의 증폭 산물은 소정의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 법 등에 의해 얻을 수 있지만, 곰팡이의 종류에 따라서는 단일 표적 영역만으로는 위양성 반응이 생기기 쉬운 것이 있기 때문에 복수의 프라이머 세트에 의해서 복수의 표적 영역을 동시에 증폭시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 또한 배양된 곰팡이의 표적 영역을 개별적으로 증폭시키는 것이 아니라 복수 종류의 곰팡이를 동시에 증폭하여 이들 복수 종류의 곰팡이에서 선택된 프로브를 고정화한 DNA 칩에 의한 곰팡이의 검출을 하면, 검사의 신속성은 향상된다.
그러나 복수의 표적 영역을 동시에 증폭시키는 멀티 플렉스를 할 경우에는 프로브에도 보다 높은 정밀도로 기능하는 것이 요구된다. 또한 동시에 증폭시키는 검출 대상의 곰팡이의 수가 증가하면 프로브에 요구되는 정밀도는 더욱 높아진다.
본 발명자들은 식물 병원균인 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani) 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 4 종류를 검출 대상의 곰팡이로 하고, 이들을 검출가능한 곰팡이 검출용 담체를 제작하기 위해 예의 연구를 하였다.
이들 복수 종류의 곰팡이의 각각의 DNA에서의 특정한 표적 영역 중 각각의 곰팡이에만 특이적으로 결합하는 염기 서열을 가지며, 또한 다른 종류의 곰팡이에는 결합하지 않는 염기 서열을 선택하여 프로브를 제작하면 이론상 각 프로브에 의해서 이들 복수 종류의 곰팡이를 각각 특이적으로 검출하는 것이 가능하다.
그러나 실제로는 이렇게 얻어진 프로브라도 유효하게 기능하는 것은 아니다. 따라서 각 프로브를 제작하기 위해서는 실험에 의해서 프로브의 효과를 확인하면서 시행 착오를 반복함으로써 유효하게 기능하는 프로브를 검출할 필요가 있었다.
여기서 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위한 프라이머가 특허 문헌 6에 기재되어 있으며, 푸사리움 솔라니를 검출하기 위한 프로브가 특허 문헌 7에 기재되어 있으며, 리족토니아 솔라니를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브가 특허 문헌 8에 기재되어 있다.
그러나 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니의 4 종류의 곰팡이를 각각 높은 정밀도로 특이적으로 동시에 검출할 수 있는 프로브를 고정화한 곰팡이 검출용 담체는 알려져 있지 않다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 적절하게 검출이 가능한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 식물 병원균인 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니의 4 종류의 곰팡이를 빠르고 정밀도 높고 특이적으로 동시에 검출할 수 있는 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 미생물 검사 방법은 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타 환경 중에서 시료를 채취하여 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물의 검사 방법으로서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 플라스모디오포라 속 균의 유무를 판정하는 방법이다.
또한, 본 발명의 미생물의 검사 키트는 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경에서 시료를 채취하여 상기 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하기 위해서 이용하는 미생물 검사 키트로서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 구성으로 되어 있다.
또한, 본 발명의 미생물 검사용 마이크로어레이는 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경 중에서 시료를 채취하고, 상기 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물 검사용 마이크로어레이로서, 플라스모디오포라 균의 DNA와, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5의 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 얻은 제1의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 12에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제1의 프로브를 고정화한 구성으로 되어 있다.
또한, 본 발명의 곰팡이 검출용 담체는 (a), (b) 또는 (c)에 기재된 염기 서열을 갖는 프로브 군에서 선택된 둘 이상의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 하는 곰팡이 검출용 담체로 되어 있다.
(a) 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브.
(b) 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린전트 (stringent) 조건 하에서 하이브리다 이즈할 수 있는 프로브.
(c) (a) 또는 (b)의 프로브에 대해서 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브.
또한, 본 발명의 곰팡이 검출용 담체는 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum)을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 101로 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 102로 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 구성된 제1의 프로브 군, 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제2의 프로브 군, 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제3의 프로브 군, 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 106로 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 구성된 제4의 프로브 군의 각각 군에서 각각 선택된 프로브를 고정화한 구성으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 곰팡이의 검출 방법은 검출 대상 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 PCR로 증폭시켜서 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함하는 곰팡이의 검출 방법으로서, PCR용 반응액에 서열 번호 107로 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와, 시료를 함유시키고, 상기 시료에 콜렉토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani) 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 적어도 하나의 DNA가 함유되어 있는 경우, 상기 PCR용 반응액을 사용하여 상기 시료에 함유된 DNA에서의 표적 영역을 증폭시켜고, 얻은 증폭 산물을 상기 곰팡이 검출용 담체에 적하하여 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브와 결합시키는 방법으로 되어 있다.
또한, 본 발명의 곰팡이 검출용 키트는 검출 대상인 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트와, 증폭 산물의 유무를 확인하기 위한 프로브가 고정된 담체를 포함한 곰팡이 검출용 키트이고, 상기 프라이머 세트가 서열 번호 107에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하고, 상기 담체가 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum)을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 102에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 구성된 제1의 프로브 군, 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제2의 프로브 군, 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제3의 프로브 군, 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 106에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브로 이루어진 제4의 프로브 군의 각 군에서 각각 선택된 프로브를 고정화한 구성으로 되어 있다.
또한, 본 명세서 및 특허 청구 범위에 있어서 "프로브 군"은 프로브의 집합을 의미하며 복수의 프로브로 이루어지는 경우만을 의미하는 것은 아니고, 하나의 프로브로 이루어진 것을 포함하여 프로브 군이라고 칭하고 있다.
본 발명에 의하면, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 적절하게 검출할 수 있게 된다.
또한, 본 발명에 의하면, 식물 병원균인 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니를 빠르고 정확도 높게 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 된다.
[도 1] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물의 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에서 사용되는 프라이머의 염기 서열을 나타내는 도면이다.
[도 2] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에서 사용되는 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프로브의 염기 서열을 나타내는 도면이다.
[도 3] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 검출한 결과 (시험 1)를 나타내는 도면이다.
[도 4] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 검출한 결과 (시험 2)를 나타내는 도면이다.
[도 5] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 검출한 결과 (시험 3)를 나타내는 도면이다.
[도 6] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 동시에 검출한 결과 (시험 4)를 나타내는 도면이다.
[도 7] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 동시에 검출한 결과 (시험 5)를 나타내는 도면이다.
[도 8] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에서 사용되는 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 프로브의 염기 서열을 나타내는 도면이다.
[도 9] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 검출한 결과 (시험 6)를 나타내는 도면이다.
[도 10] 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물의 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이를 이용하여 플라스모디오포라 속 균과 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균을 동시에 검출한 결과 (시험 7)를 나타내는 도면이다.
[도 11] 본 발명의 실시 형태에 관한 곰팡이 검출용 담체에 고정화 되는 프로브의 염기 서열을 나타내는 도면이다.
[도 12] 본 발명의 실시 형태에 관한 곰팡이 검출용 담체에 의해 검출되는 대상의 곰팡이의 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머의 염기 서열을 나타내는 도면이다.
[도 13] 본 발명의 실시 형태에 관한 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 프로브에 대해서 검출된 형광 강도 (S / N 비 값)를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 관한 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 대해서 상세하게 설명한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경중에서 시료를 채취하여 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물의 검사 방법으로서, 플라스모디오포라 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균의 유무를 판정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 플라스모디오포라 속 균의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제1의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 12에 표시하는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어지는 제1의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제1의 증폭 산물을 접촉시켜서 제1의 프로브와 상보적으로 결합한 제1의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
플라스모디오포라 속 균은 토양 전염성 식물 병원균이며, 배추, 양배추 류 등의 유채화과 야채 등에 기생하여 뿌리 혹병을 일으킨다. 살아있는 식물 세포에만 기생하여 병을 일으키는 절대 기생균이다.
본 명세서에서 염기 서열은 모두 5 '말단으로부터 3'말단 방향으로 파악하는 것으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 이러한 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 적절하게 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
또한 상기 제1의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로서 제1의 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 유무를 동시에 결정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피시움 속 균의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제2의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 13 또는 14에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제2의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제2의 증폭 산물을 접촉시키고, 제2의 프로브와 상보적으로 결합한 제2의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
피시움 속 균은 다범성(多犯性) 토양 전염성 식물 병원균이며, 오이과 야채와 가지과 채소 등을 비롯한 많은 야채류에 대해서 모종 잎마름병과 부패병 등을 일으킨다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피토프토라 속 균의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제3의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 15 또는 16에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제3의 증폭 산물을 접촉시키고, 제3의 프로브와 상보적으로 결합된 제3의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
피토프토라 속 균은 토양 중이나 식물 체내에서 서식하는 식물 병원균이며, 19 세기 중반 유럽에서 감자 기근을 일으킨 피토프토라 인페스탄스가 유명하다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 이러한 피시움 균과 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 적절하게 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
또한 상기 제2의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 균을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피토프토라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA의 β-튜블린 유전자를 적절하게 증폭시켜서, 제1의 프로브, 제2의 프로브 및 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 이러한 미생물을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되었다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 기타 미생물의 적어도 어느 하나의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해서 얻어진 제4의 증폭산물에 상보적으로 결합하는 서열번로 17에 나타내는 염기서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제4의 프로브를 고정화한 마이크로에 레이에 제4의 증폭산물을 접촉시켜서 제4의 프로브와 상보적으로 결합한 제4의 증폭산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물의 검사 방법에 의하면, 상기 제4의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 예를 들면 아스퍼질러스 버시컬러 (Aspergillus versicolor) 등 기타 미생물을 검출할 수 있다.
또한, 기타 미생물은 아스퍼질러스 버시컬러에 한정되지 않고, 상기 제4의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 진균 공통용으로 사용하여도 된다.
그리고 또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2의 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균의 유무를 판정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 플라스모디오포라 속 균의 DNA와 제2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제5의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 18에 표시하는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제5의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제5의 증폭 산물을 접촉시키고, 제5의 프로브와 상보적으로 결합한 제5의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시키는 것이 가능하게 되어 있다.
또한 상기 제5의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제3의 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 피시움 속 균의 유무를 판정할을 특징으로 한다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피시움 속 균의 DNA와 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 얻은 제6의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제6의 증폭 산물을 접촉시키고, 제6의 프로브와 상보적으로 결합된 제6의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
또한 상기 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 제2의 프라이머 세트와 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 플라스모디오포라 속 균 및 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시키고, 제5의 프로브와 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균 및 피시움 속 균을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제4의 프라이머 세트와, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 유무를 판정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법은 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA와 제4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제7의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 20 또는 21에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제7의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 제7의 증폭 산물을 접촉시켜서, 제7의 프로브와 상보적으로 결합된 제7의 증폭 산물의 표지를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법에 의하면, 상기 제4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 피시움 균과 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
또한 상기 제7의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 균과 피토프토라 속 균을 검출할 수 있게 되어 있다.
여기서, 본 실시 형태의 미생물의 검사 방법에 있어서, 프라이머 세트로서 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 제1의 프라이머 세트를 이용하지 않고, rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용하는 경우, 제3의 프라이머 세트 (서열 번호 7, 8, 10)와, 제4의 프라이머 세트 (서열 번호 8, 11)를 조합하여 사용하며, 또한 제6의 프로브 (서열 번호 19 + 상보 서열)와, 제7의 프로브 (서열 번호 20, 21 + 상보 서열)를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써, 피시움 균과 피토프토라 속 균의 검출에 대해서 다음과 같이 판정할 수 있다.
우선, 제6의 프로브와 제7의 프로브 모두에 대해서 증폭 산물의 표지가 검출된 경우, 피시움 속 균이 존재하고, 피토프토라 속 균의 존재 여부는 불분명함을 알 수 있다. 또한 제6의 프로브에 대하여 증폭 산물의 표지가 검출되지 않고, 제7의 프로브에 대하여 증폭 산물의 표지가 감지된 경우, 피시움 균이 존재하지 않고, 피토프토라 속 균이 존재하는 것을 알 수 있다. 또한 제6의 프로브 및 제7의 프로브 모두에 대해서 증폭 산물의 표지가 검출되지 않는 경우, 피시움 균과 피토프토라 속 균 어느 것도 없다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법에서 상기와 같이 프라이머 세트로서 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 제1의 프라이머 세트를 사용하는 경우, 제1의 프로브 (서열 번호 12+ 상보 서열), 제2의 프로브 (서열 번호 13, 14 + 상보 서열), 및 제3의 프로브 (서열 번호 15, 16)를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되어 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사 키트는 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경중에서 시료를 채취하여 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하기 위해 이용하는 미생물의 검사 키트로서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 키트에 의하면, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 적절하게 증폭시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트는 플라스모디오포라 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시함으로써 플라스모디오포라 속의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 상기 각 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자와, 플라스모디오포라 속의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 적합하게 동시에 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트는 피시움 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 피시움 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 상기 각 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA의 β-튜블린 유전자와, 플라스모디오포라 속, 및 피시움 속 균의 DNA의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 적합하게 동시에 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트는 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 피시움 속 균과 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사 키트에 의하면, 상기 각 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA의 β-튜블린 유전자와, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 적합하게 동시에 증폭시킬 수 있게 되어 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법 및 미생물 검사 키트를 사용함으로서, 시료에서 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 다음과 같이 할 수 있다.
먼저, 미생물의 콜로니를 채취하여 액체 질소 등으로 콜로니를 동결하고, 콜로니에 포함된 미생물의 세포를 파쇄한다. 다음으로, 얻어진 미생물의 세포의 파쇄물에서 게놈 DNA (genomic DNA)를 추출한다. 게놈 DNA의 추출은 CTAB 법 (Cetyl trimethyl ammonium bromide)에 의한 방법과 DNA 추출 장치를 이용하는 방법 등 일반적인 방법을 통해서 할 수 있다. 또한, 토양에서 직접 곰팡이의 DNA를 추출할 수도 있다. 이 경우도 DNA의 추출은 직접 용균법 (Direct Lysis Method)에 의한 방법이나 토양 DNA 추출 키트를 이용하는 방법 등 일반적인 방법을 통해서 할 수 있다.
다음으로 추출한 게놈 DNA에서의 표적 영역을 증폭시킨다. 즉 게놈 DNA의 표적 영역을 포함한 DNA 단편을 증폭시킨다. 이 표적 영역의 증폭 방법으로서, PCR 법을 적절하게 사용할 수 있다. PCR 장치로서는 일반적인 온도순환장치 (thermal cycler) 등을 사용할 수 있다.
PCR용 반응액으로서는, 예를 들면 다음의 조성으로 이루어진 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉 핵산 합성 기질 (dNTPmixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), 프라이머 세트, 핵산 합성 효소 (EX Taq HotStart DNA polymerase 등), 형광 표지 시약 (Cy5-dCTP 등), 시료의 DNA, 완충액 및 나머지 성분으로서 물을 포함한 PCR 반응액을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 완충액으로서는 예를 들면 Ampdirect (R) (주식회사 시마즈 제작소 제)를 사용할 수 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법 및 미생물의 검사 키트를 이용함에 있어서, 예를 들면 다음과 같은 반응 조건으로 PCR을 실시함으로써 각 미생물의 표적 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
(a) 95 ℃ 10 분, (b) 95 ℃ (DNA 변성 공정) 30 초, (c) 56 ℃ (어닐링 공정) 30 초 (d) 72 ℃ (DNA 합성 공정) 60 초 ((b) ~ (d)를 40 사이클), (e) 72 ℃ 10 분
또한, 본 실시 형태 및 실시 예에서, 프라이머 및 프로브는 각각의 염기 서열 자체에 한정되는 것은 아니고, 각각의 염기 서열에서 1 또는 여러 개의 염기가 결손, 치환 또는 부가된 것을 사용할 수 있다. 또한 각각의 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 단편으로 이루어진 것을 사용할 수도 있다.
또한, 스트린전트한 조건이란 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 각각의 염기 서열로 이루어진 DNA에 대해서 높은 상동성 (상동성이 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상)을 갖는 DNA가 각각의 염기 서열로 이루어진 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어진 DNA와, 하이브리다이즈하는 조건을 들 수 있다. 통상 완전 하이브리드의 용해 온도 (Tm)보다 약 5 ℃ ~ 30 ℃, 바람직하게는 약 10 ℃ 내지 약 25 ℃ 낮은 온도에서 하이브리다이제이션이 일어나는 경우를 말한다. 스트린전트한 조건에 대해서는 J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 특히 11. 45 절 "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"에 기재되어 있는 조건 등을 사용할 수 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물의 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에서 사용하는 프라이머 및 프로브는 모두 16 ~ 40 mer (염기) 정도의 길이이며, DNA 합성 장치에 의해서 합성할 수 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경에서 시료를 채취하여 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물 검사용 마이크로어레이로서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA와, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해서 얻어진 제1의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 12에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제1의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제1의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 사용함으로써 플라스모디오포라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 피시움 균의 DNA와 첫째 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제2의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 13 또는 14에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제2의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제2의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 제1의 프로브와 제2의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균 및 피시움 속 균을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 피토프토라 속 균의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제3의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 15 또는 16에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 제3의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피토프토라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 제1의 프로브, 제2의 프로브 및 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 사용함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 기타 미생물의 적어도 어느 하나의 DNA와 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 한 제4의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제4의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제4프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 예를 들면 아스퍼질러스 버시컬러 등의 기타의 미생물을 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 플라스모디오포라 속 균의 DNA와, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제5의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 18에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제5의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제5프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 피시움 속 균의 DNA와 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 구성된 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 얻은 제6의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제6의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 속 균을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 제5의 프로브와 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 플라스모디오포라 속 균 및 피시움 속 균을 각각 특이적으로 동시에 검출할 수 있게 되어 있다.
또한, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA와, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR로 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11로 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제7의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 20 또는 21에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제7의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 한다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 상기 제7의 프로브를 고정화한 마이크로어레이를 이용함으로써 피시움 균과 피토프토라 속 균을 검출할 수 있게 되어 있다.
본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이는 검출 대상 미생물을 검출하기 위한 상기 프로브 중 적어도 하나를 고정화한 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 스포트 형 DNA 마이크로어레이, 합성형 DNA 마이크로어레이 등을 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이로서 부착 형식의 DNA 칩을 제작하는 경우는 DNA 스포터에 의해서 프로브를 유리 기판 상에 고정화하여 각 프로브에 대응하는 스포트를 형성함으로써 제작할 수 있다. 또한 합성 형 DNA 칩을 제작하는 경우는 광 리소그래피 기술에 의해서 유리 기판상에서 상기 서열을 갖춘 단일 가닥 사슬 올리고 DNA를 합성함으로써 제작할 수 있다. 또한 기판은 유리제에 한정되지 않고, 플라스틱 기판이나 실리콘 웨이퍼 등을 사용할 수도 있다. 또한 기판의 형상은 평판 형상의 것에 한정되지 않고 다양한 입체 형상의 것으로 할 수도 있고, 그 표면에 화학 반응이 가능하도록 관능기를 도입한 것 등을 이용할 수도 있다.
다음으로 증폭 산물을 본 실시 형태의 미생물 검사용 마이크로어레이에 적하하고, 이 미생물 검사용 마이크로어레이에 고정화된 프로브에 하이브리다이즈한 증폭 산물의 표지를 검출하여 증폭 산물의 유무를 확인한다. 이에 의해서 검사 대상 미생물을 특정할 수 있다.
표지의 검출은 형광 스캐닝장치 등 일반적인 표지 검출 장치를 이용하여 할 수 있으며, 예를 들면 동양 강판 주식회사의 BIOSHOT (R)를 이용하여 증폭 산물의 형광 강도를 측정함으로써 수행 수 있다. 측정 결과는 S / N 비 값 (Signal to Noise ratio) 값으로 얻는 것이 바람직하다. S / N 비 값은 (메디안 형광 강도 값 - 백그라운드 값) ÷ 백그라운드 값으로 산출된다. 또한 표지로서 형광에 한정되지 않고, 기타의 것을 이용할 수도 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하면, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균을 적절하게 검출이 가능하게 된다.
이하, 본 발명의 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트의 일 실시 형태에 대해서 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하의 본 실시 형태 및 후술하는 실시 예의 구체적인 내용에 한정되는 것은 아니다.
[곰팡이 검출용 담체]
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 도 11에 도시한 특정 곰팡이를 검출하기 위한 프로브 (서열 번호 101 ~ 106) 중 적어도 어느 하나를 기판 상에 고정화한 것이면 특히 한정되지 않는다. 이 곰팡이 검출용 담체는, 예를 들면 스포트형 또는 합성형 DNA 칩이나 DNA 마이크로어레이 등으로서 제조할 수 있다.
(검출 대상 곰팡이)
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 의해서 검출되는 대상인 곰팡이는 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani) 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 4 종류이다.
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체를 이용하여 토양 등에 이들 곰팡이가 존재하는지 여부를 확인함으로써, 식물의 육성에 있어서 이러한 병원균에 의한 식물의 질병을 예방하는 것이 가능해진다. 또한 토양 중에 이러한 곰팡이가 존재하지 않는 것을 확인함으로써, 예를 들면 과도한 농약 살포를 방지하는 것 등도 가능해진다.
(프로브)
본 실시 형태의 대상 곰팡이를 검출하기 위한 프로브는 서열 번호 101 ~ 106에 의해 각각 특정되는 염기 서열로 이루어진 핵산 단편이다. 또한, 본 명세서에서, 서열 번호 22 ~ 100 은 결번으로 되어 있다.
이 중 서열 번호 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 프로브이다. 또한 서열 번호 102에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이, 이 균을 검출하기 위한, β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브이다.
또한 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이 푸사리움 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 프로브이다. 또한 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이 이 균을 검출하기 위한, β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브이다.
또한 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이 알터나리아 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 프로브이다. 또한 서열 번호 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 것이 리족토니아 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 프로브이다.
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에서는 상기와 같이 프로브로서 곰팡이의 게놈 DNA의 ITS 영역과 β 튜블린 유전자에서 선택된 것을 사용하고 있다.
ITS 영역은 RNA에 전사 후에 스플라이싱되는 부분이다. 따라서 코딩 영역에 비하면 보존성이 낮고 많은 변화가 있지만, 곰팡이의 종류 사이의 유사성이 높고, 위 양성 반응이 생기는 경우가 비교적 많다. 따라서 DNA 칩에 수많은 종류의 곰팡이의 프로브를 고정화하여 곰팡이의 식별에 사용하는 경우에는, 곰팡이의 종류에 따라서는 ITS 영역에서 선택된 프로브만을 사용하면 검출 정밀도의 저하를 초래하는 경우가 있다. 한편, β-튜블린 유전자에는 곰팡이의 종류마다 독특한 서열이 비교적 많이 존재하고 있다. 따라서, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체로는 곰팡이의 종류에 따라서는 ITS 영역과 β-튜블린 유전자를 모두 표적 영역으로 이용함으로써, 위양성 반응을 감소시키는 것을 가능하게 하고 있다.
구체적으로는, 푸사리움 솔라니에 대해서는 ITS 영역 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브를 모두 사용하여 이들 모두에서 양성 반응이 얻어진 경우에만 해당 곰팡이가 검출되었다고 판정하는 것이 바람직하다. 그 곰팡이에 대해서는 이렇게 하면 위양성 반응에 따른 과오 판단의 위험을 줄일 수 있게 되어 있다.
한편, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼에 대해서는 적어도 ITS 영역 또는 β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브 중 하나에서 양성 반응이 얻어진 경우에 해당 곰팡이가 존재하고 있다고 판정할 수 있다.
또한 알터나리아 솔라니와 리족토니아 솔라니에 대해서는 ITS 영역에서만 선택된 프로브에서 양성 반응이 얻어진 경우에 해당 곰팡이가 존재하고 있다고 판정할 수 있다. 이러한 곰팡이의 ITS 영역에서 선택된 프로브는 특이성이 높고, 위 양성 반응이 비교적 발생하기 어렵기 때문에 이러한 곰팡이에 대해서는 ITS 영역에서만 선택된 프로브를 이용하여 검출할 수 있다.
따라서, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 푸사리움 솔라니에 대해서는 ITS 영역 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브를 함께 고정화하고, 두 프로브가 양성을 나타낸 경우, 검출 대상의 곰팡이가 존재한다고 판정하는 것이 바람직하다. 또한 콜렉토트리쿰 아쿠타툼에 대해서는 ITS 영역 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 프로브를 함께 고정화하고, 하나의 프로브가 양성을 나타낸 경우에, 검출 대상의 곰팡이가 존재한다고 판정하는 것이 바람직하다. 알터나리아 솔라니와 리족토니아 솔라니에 대해서는 ITS 영역에서만 선택된 프로브를 고정화하고, 해당 프로브가 양성을 나타낸 경우, 검출 대상의 곰팡이가 존재한다고 판정할 수 있다.
(프로브의 합성)
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화되는 상기 프로브는 모두 30 ~ 55 염기 정도의 길이이며, 일반적인 DNA 합성 장치에 의해서 합성할 수 있다. 후술하는 실시 예에서 곰팡이 검출용 담체에 고정화한 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브는 모두 DNA 합성 장치에 의해서 합성한 것을 사용하였다. 또한, 후술하는 실시 예에서 PCR에 이용한 서열 번호 107 ~ 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머도 19 ~ 26 염기 정도의 길이이며, DNA 합성 장치에 의해서 합성한 것을 사용하였다.
또한, 본 실시 형태에서의 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브는 해당 서열 자체에 한정되지 않고, 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에서 하나 또는 여러 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 프로브를 사용할 수 있다. 또한 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 프로브를 사용할 수도 있다. 또한 이러한 프로브와 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 대해서 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브를 사용할 수도 있다.
또한, 도 12에 나타낸 서열 번호 107 ~ 110의 염기 서열로 이루어진 각 프라이머 (서열 번호 107 및 108의 프라이머 세트, 및 서열 번호 109 및 110의 프라이머 세트에서의 각 프라이머)에 대해서도 마찬가지로 해당 서열 자체에 한정되지 않고, 서열 번호 107 ~ 110에 나타내는 염기 서열에서 하나 또는 여러 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 프라이머로서, 서열 번호 107 ~ 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 이용한 경우와 동일한 영역을 증폭할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 또한 서열 번호 107 ~ 110에 나타내는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 단편으로 이루어진 프라이머로서, 서열 번호 107 ~ 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 이용한 경우와 동일한 영역을 증폭할 수 있는 것을 사용할 수도 있다.
(곰팡이 검출용 담체의 제작)
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브를 사용하여 기존의 일반적인 방법으로 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체로서 부착형 DNA 칩을 제작하는 경우는 DNA 스포터에 의해서 프로브를 유리 기판 상에 고정화하고, 각 프로브에 대응하는 스포트를 형성함으로써 제작할 수 있다. 또한 합성형 DNA 칩을 제작하는 경우는 광 리소그래피 기술에 의해서 유리 기판상에서 상기 서열을 갖춘 단일 사슬 올리고 DNA를 합성함으로써 만들 수 있다. 또한 기판은 유리에 한정되지 않고, 플라스틱 기판이나 실리콘 웨이퍼 등을 사용할 수도 있다. 또한 기판의 형상은 평판 형상의 것에 한정되지 않고, 다양한 입체 형상의 것으로 할 수도 있으며, 그 표면에 화학 반응이 가능하도록 관능기를 도입한 것 등을 이용할 수도 있다.
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브의 전부 또는 일부를 고정화한 것으로 할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 균종마다 각각을 검출하기 위한 프로브를 적어도 하나 고정화한 것으로 할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에서 하나 또는 여러 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 프로브의 전부 또는 일부를 고정화한 것으로 하는 것도, 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 프로브의 전부 또는 일부를 고정화한 것으로 할 수도 있고, 이러한 프로브 또는 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 대해서 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브의 전부 또는 일부를 고정화한 것으로 할 수도 있다.
[곰팡이의 검출 방법]
본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법은 검출 대상 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 증폭시켜서 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법으로서, PCR용 반응액에 서열 번호 107에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 시료를 함유시키고, 시료에 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니 중 적어도 어느 하나의 DNA가 함유되어 하는 경우 PCR용 반응액을 사용하여 시료에 함유된 DNA에서의 표적 영역을 증폭시키고, 얻어진 증폭 산물을 곰팡이 검출용 담체에 적하하여 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브와 결합시키는 방법이면 되고, 구체적인 실시 형태 및 실시 예의 구성에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 (1) 곰팡이의 채취와 DNA의 추출 (2) 표적 영역의 증폭 및 (3) 증폭 산물의 확인을 포함하는 것으로 할 수 있다.
(1) 곰팡이의 채취와 DNA의 추출
곰팡이의 채취와 DNA의 추출에는 여러가지 방법이 있고 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 식물을 기르는 토양을 채취하여 적당량의 물에 현탁하고, 임의의 배율로 단계 희석하여 각각의 단계 희석액을 배지에 도포하여 배양한 후 배양된 곰팡이에서 DNA를 추출하는 방법으로 할 수 있다.
또한 토양을 채취하고 채취한 토양에서 직접 식물 병원 곰팡이를 함유한 토양 미생물 (세균이나 선충 등의 미생물)의 DNA를 추출하여도 된다. 그 방법으로는 직접 용균법 (Direct Lysis Method)과 시판의 토양 DNA 추출 키트를 이용하는 등 일반적인 방법을 통해서 할 수 있다.
또한 식물 검체의 이병 (罹病) 조직 등에서 병원 곰팡이를 채취하여 분리 배양한 후 DNA를 추출할 수도 있다. 예를 들면, 이병 조직 조각을 가위 등을 이용하여 채취하고 채취한 식물 조직의 조각을 차아 염소산이나 에탄올로 표면 살균 후 전용 배지 등에 치상하여 식물 조직 중에 포함되는 곰팡이의 배양을 한다.
또한 에어 샘플러로 공중 부유 곰팡이 포자를 한천 배지에 채취하여 배양한 후 DNA를 추출할 수도 있다.
상기에서 곰팡이의 배양에 사용되는 배지로는 PDA (감자-포도당 한천 배지, potato dextrose agar)와 같은 일반적인 것을 사용하여도 되고, 또한 포집 대상 곰팡이가 미리 정해져 있는 경우는 항생물질 등을 더한 이른바 선택 배지라는 것을 사용해도 된다. 또한, 배양 조건은 20 ℃ ~ 25 ℃에서 어두운 곳에 65 시간 이상 방치하는 것이 바람직하다.
곰팡이의 배양을 할 경우, 다음으로, 배양된 곰팡이의 콜로니를 콜로니마다 개별적으로 또는 둘 이상의 콜로니를 일괄적으로 채취하여 액체 질소 등으로 콜로니를 동결하여 콜로니에 포함된 곰팡이의 세포를 파쇄한다.
그리고 이렇게 해서 얻어진 곰팡이의 세포 파쇄물에서 게놈 DNA를 추출한다. 게놈 DNA의 추출은 CTAB 법 (Cetyl trimethyl ammonium bromide)에 의한 방법이나 DNA 추출 장치를 이용하는 방법 등 일반적인 방법에 의해서 할 수 있다.
(2) 표적영역의 증폭
다음으로 추출한 게놈 DNA에서의 표적 영역을 증폭시킨다. 즉 게놈 DNA에서의 표적 영역을 포함한 DNA 단편을 증폭시킨다. 이 표적 영역의 증폭 방법은 특별히 한정되지 않지만, PCR 법을 바람직하게 사용할 수 있다. PCR 법으로는 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 표적 영역을 증폭시킨다. PCR 장치로서는 일반적인 온도순환장치 등을 사용할 수 있다.
본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법에서는 예를 들면 다음과 같은 반응 조건으로 PCR을 실시함으로써 각종 곰팡이의 표적 영역을 적절하게 증폭시킬 수 있다.
(a) 95 ℃ 10 분, (b) 95 ℃ (DNA 변성 공정) 30 초, (c) 56 ℃ (어닐링 공정) 30 초 (d) 72 ℃ (DNA 합성 공정) 60 초 ((b) ~ (d)를 40 사이클), (e) 72 ℃ 10 분
PCR용 반응액으로서는, 예를 들면 다음의 조성으로 이루어진 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉 핵산 합성 기질 (dNTPmixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), 프라이머 세트, 핵산 합성 효소 (Nova Taq HotStart DNA polymerase 등), 형광 표지 시약 (Cy5-dCTP 등), 시료의 게놈 DNA, 완충액 및 나머지 성분으로서 물을 포함한 PCR 반응액을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 완충액으로서는, 예를 들면 Ampdirect (R) (주식회사 시마즈 제작소 제)를 사용할 수 있다.
본 실시 형태에서는 곰팡이의 게놈 DNA의 ITS 영역과 β 튜블린 유전자를 표적 영역으로 DNA 단편의 증폭이 이루어진다.
이 때, ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트로서는 도 12에 나타내는 서열 번호 107 및 108의 염기 서열로 이루어진 것 (서열 번호 107 : 정방향 프라이머, 서열 번호 108 : 역방향 프라이머)를 이용하는 것이 바람직하다.
또한 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트로서는, 같은 도면에 도시된 서열 번호 109 및 110의 염기 서열로 이루어진 것 (서열 번호 109 : 정방향 프라이머, 서열 번호 110 : 역방향 프라이머)를 이용하는 것이 바람직하다.
(3) 증폭 산물의 확인
다음으로, 증폭 산물을 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 적하하여 이 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 프로브에 하이브리다이즈한 증폭 산물의 표지를 검출함으로써 증폭 산물의 유무를 확인한다. 따라서 검사 대상에 존재하는 곰팡이를 특정할 수 있다.
표지의 검출은 형광 스캐닝장치 등 일반적인 표지 검출 장치를 이용하여 할 수 있고, 예를 들면 동양 강판 주식회사의 BIOSHOT (R)을 사용하여 증폭 산물의 형광 강도를 측정함으로써 수행할 수 있다. 측정 결과는 S / N 비 값 (Signal to Noise ratio) 값으로서 얻는 것이 바람직하다. 본 명세서에 기재된 S / N 비 값은 (메디안 형광 강도 값 - 백그라운드 값) ÷ 백그라운드 값으로 산출된다. 또한 표지로서 형광에 한정되지 않고 기타의 것을 사용할 수도 있다.
[곰팡이 검출용 키트]
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 키트는 검출 대상 곰팡이 DNA의 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트와, 증폭 산물의 유무를 확인하기 위한 프로브가 고정된 곰팡이 검출용 담체가 포함된다.
구체적으로는 프라이머 세트로서는, 서열 번호 107에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트가 포함된다.
또한 곰팡이 검출용 담체로서는 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 102에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제1의 프로브 군, 푸사리움 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제2의 프로브 군, 알터나리아 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제3의 프로브 군, 및 리족토니아 솔라니를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 구성된 제4의 프로브 군의 각 군에서 각각 선택된 프로브를 고정화한 것을 바람직하게 사용할 수 있다.
또한. 제1의 프로브군, 제1의 프로브 군, 제1의 프로브군 및 제1의 프로브 군에서의 모든 프로브를 고정화한 것으로 하는 것도 바람직하다.
이와 같은 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 키트는 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 증폭 산물을 해당 곰팡이 검출용 담체에 적하하여 증폭 산물을 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브에 결합시킴으로써 곰팡이를 검출하기 위해 사용된다.
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트에 의하면, 상기 4 종류의 곰팡이를 특이적으로 식별할 수 있는 프로브를 이용함으로써 이러한 곰팡이를 적절하게 검출할 수 있다. 따라서 토양 환경 검사 등에서 식물 병해의 병원균인 이들 곰팡이를 빠르고 정확도 높게 특이적으로 동시에 검출하는 것이 가능하게 되어 있다.
[실시 예]
(시험 1)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의해서, β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 각각 단독으로 검출할 수 있을 지를 검증하기 위한 시험을 실시하였다.
구체적으로는, β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여, 플라스모디오포라 브라시카에 (Plasmodiophora brassicae), 피시움 아파니더마툼 (Pythium aphanidermatum), 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 울티뭄, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 개별적으로 PCR로 증폭 했다.
그리고 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 15 및 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
절대 기생균인 플라스모디오포라 브라시카에는 교토 부립 대학 식물 병리학 연구실에서 받은 것을 사용하였다. 피시움 속 균과 피토프토라 속 균은 NBRC (독립 행정법인 제품 평가 기술 기반기구 생명 공학 센터 NITE Biological Resource Center)에서 입수하였다. 후술하는 시험도 포함하여 해당 센터에서 입수한 균주는 다음과 같다.
피시움 아파니더마툼 (Pythium aphanidermatum) NBRC7030
피시움 울티뭄 (Pythium ultimum) NBRC 100125
피시움 진지베리스 (Pythium zingiberis) NBRC30818
피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) NBRC9174
PCR 반응액으로서는 Ampdirect (R) (주식회사 시마즈 제작소 제)를 이용하여, 이하의 조성의 것을 사용하였다. 각 프라이머는 오페론 테크놀로지 주식 회사에 의해 합성한 것을 사용하였다.
· Ampdirect (G / Crich) 4.0μl
· Ampdirect (addition-4) 4.0μl
· dNTP Mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 2.5mM) 1.0μl
· Cy-5 dCTP 0.2μl
· EX Taq Hot Start DNA polymerase (5U / μl) 0.2μl
· 정방향 프라이머 (10 μM) 1.0μl
· 역방향 프라이머 (10 μM) 1.0μl
· 시료의 DNA (100pg / μl) 1.0μl
· 물 (전체가 20.0μl가 될 때까지 가수)
PCR법에 의한 유전자의 증폭은 핵산 증폭 장치 (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient 다카라 바이오 주식회사 제품)에 의해 실시 예에서 설명한 것과 동일한 다음의 조건에서 실시하였다.
(a) 95 ℃ 10 분
(b) 95 ℃ 30 초
(c) 56 ℃ 30 초
(d) 72 ℃ 60 초 ((b) ~ (d)를 40 사이클)
(e) 72 ℃ 10 분
다음으로 PCR 증폭 산물에 완충액 (3 × SSC 구연산 - 생리 식염수 + 0. 3 % SDS)를 혼합하여 94 ℃에서 5 분간 가온하여 상기 마이크로어레이에 적하하였다. 이 마이크로어레이를 45 ℃에서 1 시간 정치하고, 상기 완충액을 이용하여 하이브리다이즈하지 않은 PCR 산물을 마이크로어레이에서 씻어냈다.
그리고 표지 검출 장치 (BIOSHOT (R), 동양 강판 주식회사)를 이용하여 상기 마이크로어레이에 고정화된 각 프로브의 형광 강도 (프로브에 결합된 증폭 산물의 형광 강도)를 측정하여 각 프로브의 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에서 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한, 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 아파니더마툼과 피토프토라 인페스탄스의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 13 과 17, 서열 번호 15 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타나 있다.
또한 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
마찬가지로, 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물이 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 울티뭄과 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β- 튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 13과 17, 서열 번호 15 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
(시험 2)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하여 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 각각 단독으로 검출할 수 있을지를 검증하기 위한 추가 시험을 실시하였다.
구체적으로는 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 아파니더마툼, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
그리고 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
PCR 반응액 및 PCR 법으로 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 실시했다.
그리고, 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여, S / N 비 값을 얻었다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4에서 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 아파니더마툼과 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β- 튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 14와 17, 서열 번호 16 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
마찬가지로 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물이 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5의 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 진지베리스와, 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 14과 17, 서열 번호 16과 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
(시험 3)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하여 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 각각 단독으로 검출할 수 있는지를 검증하기 위한 추가 시험을 실시하였다.
구체적으로는 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 각각 개별적으로 PCR에 의해서 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 4 종류의 미생물의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 각각 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
그리고 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
PCR 반응액 및 PCR 법에 의한 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 실시하였다.
그리고 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 진지베리스와 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 14와 17, 서열 번호 16과 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
마찬가지로 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물이 서열 번호 12 및 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5의 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 진지베리스와 피토프토라 인페스탄스 DNA의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 14과 17, 서열 번호 16과 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다있다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
(시험 4)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의해, β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 세균 등을 동시에 검출할 수 있을 지를 검증하기 위한 시험을 실시하였다.
구체적으로는 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 아파니더마툼, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 하나의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 울티뭄, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 하나의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
그리고 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 15 및 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
PCR 반응액, 및 PCR 법에 의한 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 하였다. 그러나 PCR 반응액은 시료의 DNA로서 세균마다 1.0μl 합계 4.0μl를 포함한 것을 사용하였다.
그리고 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 가서 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에서 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 아파니더마툼 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 13 15에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출되었음이 나타났다.
또한 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것으로 나타났다.
마찬가지로, 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 울티뭄 및 피토프토라 인페스탄스 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 13 15에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것이 나타났다.
또한 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것으로 나타났다.
(시험 5)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하여 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 동시에 검출할 수 있을 지를 검증하기 위한 시험을 더 실시하였다.
구체적으로는 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 아파니더마툼, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 한 개의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스, 피토프토라 인페스탄스 및 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA의 β-튜블린 유전자를 하나의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 4 종류의 DNA에서의 β - 튜블린 유전자를 하나의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
또한 β-튜블린 유전자를 표적으로 하는 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 4 종류의 미생물의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 하나의 PCR 반응액을 이용하여 PCR에 의해 동시에 증폭하였다.
그리고 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
PCR 반응액 및 PCR 법에 의한 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 실시하였다. 그러나 PCR 반응액은 시료의 DNA로서 세균마다 1.0μl, 총 4.0μl를 포함한 것을 사용하였다.
그리고 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 가서 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에서 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 아파니더마툼 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 14, 16에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출되었음이 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것으로 나타났다.
마찬가지로 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의해 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 14, 16에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 14 16에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것이 나타났다.
또한 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 4에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있는 것으로 나타났다.
마찬가지로 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 진지베리스 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 12, 14 16에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것이 나타났다.
또한, 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 5에 나타낸 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 아스퍼질러스 버시컬러의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물은 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 가능성이 있음이 나타났다.
(시험 6)
본 실시 형태의 미생물의 검사 방법, 미생물의 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하여 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 각각 단독으로 검출할 수 있을지를 검증하기 위한 시험을 실시하였다.
구체적으로는 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 6에서의 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에, 피시움 울티뭄, 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 개별적으로 PCR로 증폭했다.
또한, rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 3 종류의 미생물의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
또한 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 3 종류의 미생물의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
또한 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 이들 3 종류의 미생물의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 각각 개별적으로 PCR로 증폭하였다.
그리고 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 21에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출하였다.
PCR 반응액 및 PCR 법에 의한 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 실시하였다.
그리고 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9에서 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR로에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 18에 나타낸 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하고, 얻은 증폭 산물은 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 8에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하고, 얻어진 증폭 산물도 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 피시움 울티뭄과 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물이 서열 번호 20 및 21에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
(시험 7)
본 실시 형태의 미생물 검사 방법, 미생물 검사 키트 및 미생물 검사용 마이크로어레이에 의하여 rDNA 유전자 ITS 영역을 대상으로 하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균 등을 동시에 검출할 수 있을지를 검증하기 위한 시험을 실시하였다.
구체적으로는 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에 및 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 하나의 PCR 반응액을 사용하여 PCR에 의해서 동시에 증폭하였다.
또한, rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 8에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에 및 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 하나의 PCR 반응액을 사용하여 PCR에 의해서 동시에 증폭하였다.
또한 rDNA 유전자 ITS 영역을 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에 및 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 하나의 PCR 반응액을 사용하여 PCR에 의해서 동시에 증폭하였다.
그리고 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 21에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브가 각각 고정화된 마이크로어레이에 상기의 PCR에 의한 증폭 산물을 적하하여 증폭 산물의 형광 표지를 검출했다.
PCR 반응액 및 PCR 법에 의한 유전자의 증폭은 시험 1과 동일한 조성 및 동일한 조건으로 실시하였다. 그러나 PCR 반응액은 시료의 DNA로서 세균마다 1.0μl, 총 2.0μl를 포함한 것을 사용하였다.
그리고 시험 1과 동일하게 PCR 증폭 산물과 프로브의 하이브리다이즈를 하여 표지 검출 장치에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 S / N 비 값을 취득 하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10에서 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에 및 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 각각 서열 번호 18, 19에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
또한 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 8에 나타낸 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의하여 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 18에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타나는 동시에, 피시움 울티뭄의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 20, 21에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것이 나타났다.
또한 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와, 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 플라스모디오포라 브라시카에의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 18에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타나는 동시에, 피토프토라 인페스탄스의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의해서 증폭하여 얻은 증폭 산물은 서열 번호 20, 21에 나타낸 염기 서열로 이루어진 프로브에 결합하여 표지가 검출된 것으로 나타났다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 관한 곰팡이 검출용 담체, 곰팡이의 검출 방법 및 곰팡이 검출용 키트의 효과를 확인하기 위해 실시한 시험에 대해서 구체적으로 설명한다.
[시험 8]
곰팡이 검출용 담체로는 진 실리콘 (R) (동양 강판 주식회사)를 이용하여 도 11에 표시된 서열 번호 101 ~ 106의 프로브를 고정화한 것을 사용하였다. 각 프로브에서는 오페론 테크놀로지 주식 회사에 의해 합성한 것을 사용하였다. 또한 각 프로브와 기판에의 고정화는 마이크로어레이에 의해서 실시하였다.
검출 대상의 곰팡이로는 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반기구 바이오 테크놀로지 본부 생물 유전자원 부문 (NITE Biological Resource Center)에서 입수한 균주를 사용하였다. 구체적으로는 다음의 4 종류의 균주를 사용하였다.
(1) 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum) NBRC32850
(2) 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) NBRC7707
(3) 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani) NBRC7516
(4) 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) NBRC30984
이러한 곰팡이 균주마다 배양하였다. 배양은 PDA 배지를 이용하여 25 ℃의 어두운 곳에서 7 일간 방치하여 실시하였다.
또한 배양된 곰팡이의 콜로니를 채취하여 φ0.5mm 지르코니아 비즈를 넣은 유리 병 (바이얼 병)에 개별적으로 넣고, 액체 질소에 담가서 시료를 동결한 후, 진탕 장치를 이용하여 곰팡이의 세포를 분쇄하였다.
이어서, DNA 추출 장치에 의해서 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하여 PCR 법에 의해서 각 곰팡이의 ITS 영역 및 β-튜블린 유전자 ((3), (4)에 대해서는 실제로 증폭되는 것은 ITS 영역만)를 균주마다 증폭하였다.
이 때, ITS 영역 증폭용 프라이머 세트로서, 도 12에 나타낸 서열 번호 107의 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열 번호 108의 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 사용하였다. 또한 β-튜블린 유전자 증폭용 프라이머 세트로서, 도시된 서열 번호 109의 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열 번호 110의 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 사용하였다.
또한, 이상의 프라이머는 오페론 테크놀로지 주식 회사에 의해서 합성한 것을 사용하였다.
PCR용 반응액으로는 Ampdirect (R) (주식회사 시마즈 제작소 제)를 사용하여 균주마다 다음 조성의 것을 20μl 제작하였다.
1. Ampdirect (G / Crich) 4.0μl
2. Ampdirect (addition-4) 4.0μl
3. dNTPmix 1.0μl
4. Cy-5dCTP 0.2μl
5. ITS1-Fw primer (서열 번호 107) (2.5μM) 1.0μl
6. ITS1-Rv primer (서열 번호 108) (2.5μM) 1.0μl
7. BtF primer (서열 번호 109) (10μM) 1.0μl
8. BtR primer (서열 번호 110) (10μM) 1.0μl
9. Template DNA 1.0μl (100 pg / μl)
10. NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
11. 물 (전체가 20.0μl 이 될 때까지 가수)
상기 PCR용 반응액을 사용하여 핵산 증폭 장치 (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient 다카라 바이오 주식회사 제품)은 다음의 조건에서 DNA를 증폭하였다.
(a) 95 ℃ 10 분
(b) 95 ℃ 30 초
(c) 56 ℃ 30 초
(d) 72 ℃ 60 초 ((b) ~ (d)를 40 사이클)
(e) 72 ℃ 10 분
다음으로 PCR 증폭 산물에 완충액 (3 × SSC 구연산 - 생리 식염수 + 0. 3 % SDS)을 혼합하여 94 ℃에서 5 분간 가온하여 상기 곰팡이 검출용 담체 (DNA 칩)에 적하하였다. 이 곰팡이 검출용 담체를 45 ℃에서 1 시간 정치하고, 상기 완충액을 이용하여 하이브리다이즈하지 않은 PCR 산물을 DNA 칩에서 씻어냈다.
그리고 표지 검출 장치 (BIOSHOT (R) 동양 강판 주식회사)를 이용하여 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 각 프로브의 형광 강도 (프로브에 결합된 증폭 산물의 형광 강도)를 측정하여 각 프로브에서의 S / N 비 값을 취득하였다.
이상과 같이, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니의 DNA에서의 표적 영역을 개별적으로 증폭하고, 얻은 증폭 산물을 각 프로브에 하이브리다이즈시킨 결과, 서열 번호 101 ~ 106의 프로브의 S / N 비 값은 도 13과 같다.
즉, 시료인 곰팡이 (검출 대상의 곰팡이 종)가 콜렉토트리쿰 아쿠타툼의 경우, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위한 서열 번호 101 및 102의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상으로 되어 있고, 양성으로 판단할 수 있다. 또한 기타 곰팡이를 검출하기 위한 서열 번호 103 ~ 106의 프로브에서는 S / N 비 값이 모두 3 미만으로 되어 있어 음성으로 판단할 수 있다. 따라서 이러한 프로브는 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위해 유효하게 기능하고 있는 것을 알 수 있다.
또한 시료의 곰팡이가 푸사리움 솔라니의 경우, 푸사리움 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 103 및 104의 프로브에서는 S / N 비 값이 모두 3 이상이며 양성으로 판단할 수 있다. 또한 기타 곰팡이를 검출하기 위한 서열 번호 101, 102, 105, 106 프로브에서는 S / N 비 값이 모두 3 미만으로 되어 있어 음성으로 판단할 수 있다. 따라서 이러한 프로브는 푸사리움 솔라니를 검출하기 위해 유효하게 기능하고 있는 것을 알 수 있다.
또한 시료인 곰팡이가 알터나리아 솔라니의 경우, 알터나리아 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 105의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상이 되어 있어 양성으로 판단할 수 있다. 또한 기타 곰팡이를 검출하기 위한 서열 번호 101 ~ 104, 106의 프로브에서는 S / N 비 값이 모두 3 미만으로 되어 있어 음성으로 판단할 수 있다. 따라서 이러한 프로브는 알터나리아 솔라니를 검출하기 위해 유효하게 기능하고 있는 것을 알 수 있다.
또한 시료인 곰팡이가 리족토니아 솔라니의 경우, 리족토니아 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 106의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상이 되어 양성으로 판단할 수 있다. 또한 기타 곰팡이를 검출하기 위한 서열 번호 101 ~ 105의 프로브에서는 S / N 비 값이 모두 3 미만으로 되어 음성으로 판단할 수 있다. 따라서 이러한 프로브는 리족토니아 솔라니를 검출하기 위해 유효하게 기능하고 있는 것을 알 수 있다.
[시험 9]
검출 대상인 복수의 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 동시에 증폭시키는 멀티 플렉스 PCR을 수행한 경우, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 프로브가 유효하게 기능하는지를 확인하기 위한 시험을 하였다.
곰팡이 검출용 담체는 시험 8과 같은 것을 사용하였다. 또한, 검출 대상의 곰팡이도 시험 8과 같은 4 종류의 균주를 사용하였다.
본 시험에서는 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니를 PDA 배지를 이용하여 25 ℃의 어두운 곳에서 7 일간 정치시켜 각각 배양하였다.
그리고 배양된 각 곰팡이로부터 콜로니를 채취하여 혼합하고, 이 4 균종으로 구성된 시료를 φ0.5mm 지르코니아 비즈를 넣은 유리병에 넣고, 액체 질소에 담가 시료를 동결한 후, 진탕 장치를 사용하여 곰팡이의 세포를 파쇄하였다.
이어서, DNA 추출 장치에 의해서 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하여 PCR 법에 의해서 각 곰팡이의 ITS 영역 및 β-튜블린 유전자 (알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니에 대해서는 ITS 영역만)를 동시에 증폭하였다. PCR 법에 사용한 프라이머 세트는 시험 8에서의 것과 동일하다.
PCR용 반응액으로는 Ampdirect (R) (주식회사 시마즈 제작소 제)를 사용하여 다음 조성의 것을 20μl 제작하였다.
1. Ampdirect (G / Crich) 4.0μl
2. Ampdirect (addition-4) 4.0μl
3. dNTPmix 1.0μl
4. Cy-5dCTP 0.2μl
5. ITS1-Fw primer (2.5μM) 1.0μl
6. ITS1-Rv primer (2.5 μ M) 1.0 μl
7. BtF primer (10 μM) 1.0 μl
8. BtR primer (10 μM) 1.0 μl
9. Template DNA (1.0 μl / 균주) (100pg / μl) 1.0 μl × 4
10. NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2 μl
11. 물 (전체가 20.0μl이 될때까지 가수)
상기 각 PCR용 반응액을 사용하여 핵산 증폭 장치 (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient 다카라 바이오 주식회사 제품)에 의해서 통해 시험 8과 동일한 조건으로 DNA를 증폭하였다.
다음으로 PCR 증폭 산물에 완충액 (3 × SSC 구연산 - 생리 식염수 + 0. 3 % SDS)을 혼합하여 94 ℃에서 5 분간 가온하여 곰팡이 검출용 담체 (DNA 칩)에 적하하였다. 이 곰팡이 검출용 담체를 45 ℃에서 1 시간 정치하고, 상기 완충액을 이용하여 하이브리다이즈하지 않았던 PCR 산물을 DNA 칩에서 씻어냈다.
그리고 표지 검출 장치 (GenePix4100A Molecular Devices 사제)를 이용하여 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 각 프로브의 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.
이상과 같이, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니의 DNA에서의 표적 영역을 하나의 PCR 반응액에 의해서 동시에 증폭하고, 얻은 증폭 산물을 각 프로브에 하이브리다이즈시킨 결과, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼을 검출하기 위한 서열 번호 101의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상이며, 동 서열 번호 102로 표시되는 염기 서열의 프로브는 S / N 비 값이 3 미만이다. 이러한 결과에서 콜렉토트리쿰 아쿠타툼에 대해서 양성으로 판단할 수 있다.
또한 푸사리움 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 103, 104의 프로브는 S / N 비 값이 모두 3 이상이며, 푸사리움 솔라니에 대해서 양성으로 판단할 수 있다.
또한 알터나리아 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 105의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상이 되고, 알터나리아 솔라니에 대해서 양성으로 판단할 수 있다.
또한 리족토니아 솔라니를 검출하기 위한 서열 번호 106의 프로브에서는 S / N 비 값이 3 이상이 되고, 리족토니아 솔라니에 대해서 양성으로 판단할 수 있다.
따라서, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 프로브는 검출 대상의 복수의 곰팡이의 DNA의 표적 영역을 동시에 증폭시키는 멀티 플렉스 PCR을 실시한 경우에도 유효하게 기능하는 것이 확인되었다.
[시험 10]
본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 프로브가 검출 대상 이외의 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역의 증폭 산물과 하이브리다이즈하지 않고 위 양성 반응을 일으키지 않는 것을 확인하기 위한 시험을 실시하였다.
곰팡이 검출용 담체는 시험 8과 같은 것을 사용하였다.
검출 대상 이외의 곰팡이로서는 독립 행정법인 이화학 연구소 바이오 자원 센터 미생물 재료 개발실 (Japan Collection of Microorganisms) 및 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반기구 바이오 테크놀로지 본부 생물 유전자원 부문 (NITE Biological Resource Center)에서 입수한 균주를 사용하였다. 구체적으로는 다음과 같은 6 종류의 곰팡이 균주를 사용하였다.
(1) 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) JCM10252
(2) 캐토미움 글로보섬 (Chaetomium globosum) NBRC6347
(3) 커불라리아 루나타 (Curvularia lunata) NBR100165
(4) 유로티움 레펜스 (Eurotium repens) JCM1580
(5) 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum) JCM9863
(6) 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) NBRC7482
이들 곰팡이를 균주마다 PDA 배지를 이용하여 25 ℃의 어두운 곳에서 7 일간 정치시켜 배양하였다.
또한 배양된 곰팡이의 콜로니를 채취하여 φ0.5mm 지르코니아 비즈를 넣은 유리병에 개별적으로 넣고, 액체 질소에 담가서 시료를 동결한 후, 진탕 장치를 이용하여 곰팡이의 세포를 파쇄하였다.
이어서, DNA 추출 장치에 의해서 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하고, PCR 법에 따라 시험 8과 동일하게 하여 각 곰팡이의 ITS 영역 및/또는 β-튜블린 유전자의 증폭 반응을 균주마다 실시하였다.
다음으로 PCR 증폭 산물에 완충액 (3 × SSC 구연산 - 생리 식염수 + 0. 3 % SDS)을 혼합하고, 94 ℃에서 5 분간 가온하여 상기 곰팡이 검출용 담체 (DNA 칩)에 적하하였다. 이 곰팡이 검출용 담체를 45 ℃에서 1 시간 정치하고, 상기 완충액을 이용하여 하이브리다이즈하지 않은 PCR 산물을 DNA 칩에서 씻어냈다.
그리고 표지 검출 장치 (BIOSHOT (R) 동양 강판 주식회사)를 이용하여 곰팡이 검출용 담체에 고정화된 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 각 프로브에서의 S / N 비 값을 취득하였다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.
이상과 같이,
아스퍼질러스 플라버스, 캐토미움 글로보섬, 커불라리아 루나타, 유로티움 레펜스, 페니실리움 디지타툼, 포마 데스트럭티바의 DNA에서의 표적 영역의 증폭 반응을 실시하고, 얻은 증폭 산물을 각 프로브에 하이브리다이즈시킨 결과, 서열 번호 101 ~ 106의 프로브에서의 S / N 비 값은 모두 3 미만으로 되어 음성으로 판단할 수 있다. 따라서, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에서의 각 프로브는 검출 대상 이외의 이러한 곰팡이에 대해서 위양성 반응을 일으키지 않고, 유효하게 기능하고 있는 것을 알 수 있다.
본 발명은 이상의 실시 형태나 실시 예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다.
예를 들면, 상기 각 프라이머 세트를 PCR 반응액에서 단독으로 사용하여도 되고, 복수의 프라이머 세트를 모두 조합하여 하나의 PCR 반응액에서 동시에 사용해도 된다. 또한 미생물 검사용 마이크로어레이에서 상기 각 프로브는 모두의 조합에서 각각 단독으로 또는 복수로 사용하는 등 적절히 변경할 수 있다.
또한 예를 들면, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에서 각 프로브를 1 스포트 씩, 또는 복수 스포트씩 고정화할 수 있다. 또한, 본 실시 형태의 검출 대상 곰팡이 이외의 곰팡이를 검출하기 위한 기타의 프로브를 본 실시 형태에 있어서 프로브와 함께 고정화할 수도 있다.
본 발명은 식물 조직이나 토양 검사, 역학적 환경 검사, 환경 검사, 임상 시험, 및 가축 위생 등에서 적합하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물 병원균인 콜렉토트리쿰 아쿠타툼, 푸사리움 솔라니, 알터나리아 솔라니 및 리족토니아 솔라니를 특이적이고 다중으로 검출하는 경우에 적합하게 사용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TOYO SEIKAN GROUP HOLDINGS, LTD. <120> METHOD, KIT AND MICROARRAY FOR TESTING MICROORGANISM, CARRIER FOR DETECTING FUNGI, METHOD FOR DETECTING FUNGI, AND KIT FOR DETECTING FUNGI <130> TSK-1582-PCT <160> 31 <170> <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 1 aacaactggg ccaaggg 17 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 2 gctggtaaca actgggccaa ggg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 3 gccggcaaca actgggccaa ggg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 4 gtacccatac cggaaccggt acc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 5 gtacccatgc cggaaccagt acc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 6 atcctagccg aaacacaact aaag 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 7 gtgagtcatc gaaattttga acgc 24 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 8 gcgaactgcg atacgta 17 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 9 ttcgcactac gtatcgcagt tcgc 24 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 10 agacacttca catctg 16 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 11 accatgcgag acacttcaca tctg 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Plasmodiophora sp. <400> 12 gactcagtcc tcgacaccgt cc 22 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Pythium sp. <400> 13 cgacatccaa gaccgagtcg atcaattcag cgccttc 37 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Pythium sp. <400> 14 tgatctggaa gccctggaga cagtcacagc cctc 34 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Phytophthora sp. <400> 15 gactcggtgc ttgacgtcgt tc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Phytophthora sp. <400> 16 gaacgacgtc aagcaccgag tc 22 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Plasmodiophora sp. Pythium sp.Phytophthora sp. <400> 17 gagggctgtg actgtctcca gggcttccag atca 34 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Plasmodiophora sp. <400> 18 tatccattgc taagagttgt aacatgtatg tatgtatgga 40 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Pythium sp. <400> 19 acattccatc cctgactaca cagaaaaaag aaagg 35 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Pythium sp. Phytophthora sp. <400> 20 atattgcact ttcgggttat gcctggaagt atg 33 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Pythium sp. Phytophthora sp. <400> 21 cctggaagta tgtctgtatc agtgtccgta 30 <210> 101 <211> 46 <212> DNA <213> Colletotrichum acutatum <400> 101 gaagcctctc gcgggcctcc cctcccggcg ccggccccca ccacgg 46 <210> 102 <211> 50 <212> DNA <213> Colletotrichum acutatum <400> 102 ggtcagtatg agatcgtgtc aaatgtcgaa atcgccgcgt cgctggcggt 50 <210> 103 <211> 33 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 103 taatgttttt ctgagtaaac aagcaaataa att 33 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 104 attgcccgaa gcctatacca aatctagctg acatctgtag 40 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Alternaria solani <400> 105 ggccaccccg ggaggtgcca gcccgccttc 30 <210> 106 <211> 55 <212> DNA <213> Rhizoctonia solani <400> 106 ttggggaatt tatttgttat tttttgtaat aaaatgataa taagtcattg aaccc 55 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 107 ttggtcattt agaggaagta aaagtc 26 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 108 ctgcgttctt catcgatgc 19 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 109 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 110 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 110 accctcagtg tagtgaccct tggc 24

Claims (27)

  1. 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경 중에서 시료를 채취하고, 상기 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물 검사 방법이며,
    플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균의 유무를 판정하는
    것을 특징으로 하는 미생물 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA와 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제1의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 12에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어지는 제1의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제1의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제1의 프로브와 상보적으로 결합된 상기 제1의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하고, 상기 제1의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 유무를 동시에 판정하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  4. 제3항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA와 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제2의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 13 또는 14에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제2의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제2의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제2의 프로브와 상보적으로 결합한 상기 제2의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물 검사 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 피토프토라 속 균의 DNA와 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제3의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 15 또는 16에 나타내는 염기 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제3의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제3의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제3의 프로브와 상보적으로 결합한 상기 제3의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 기타 미생물의 적어도 어느 하나의 DNA와 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제4의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제4의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제4의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제4의 프로브와 상보적으로 결합된 상기 제4의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 시료에서의 플라스모디오포라 속 균의 유무를 판정하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  8. 제7항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA와 상기 제2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제5의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 18에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어지는 제5의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제5의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제5의 프로브와 상보적으로 결합된 상기 제5의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제3의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 피시움 속 균의 유무를 판정하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  10. 제9항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA와 상기 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제6의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제6의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제6의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제6의 프로브와 상보적으로 결합된 상기 제6의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제4의 프라이머 세트와, 상기 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료의 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 유무를 판정하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  12. 제11항에 있어서, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA와 상기 제4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제7의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 20 또는 21에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제7의 프로브를 고정화한 마이크로어레이에 상기 제7의 증폭 산물을 접촉시키고,
    상기 제7의 프로브와 상보적으로 결합된 상기 제7의 증폭 산물의 표지를 검출하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  13. 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경중에서 시료를 채취하고, 상기 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 미생물의 유무를 판정하기 위해 이용하는 미생물의 검사 키트이며,
    플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균 및 피토프토라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 키트.
  14. 제13항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 추가로 포함하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 키트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 추가로 포함하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 키트.
  16. 제13항 내지 제15항 어느 한 항에 있어서, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 추가로 포함하는
    것을 특징으로 하는 미생물의 검사 키트.
  17. 식물 조직 또는 토양, 물, 또는 기타의 환경 중에서 시료를 채취하고, 시료에 포함된 미생물 군에서 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭 산물에 따라 상기 시료에서의 미생물의 유무를 판정하는 미생물 검사용 마이크로어레이이며,
    플라스모디오포라 속 균의 DNA와, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 β-튜블린 유전자를 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 1 ~ 3에 나타나는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 4, 5에 나타나는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제1의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 12로 표시하는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제1의 프로브를 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  18. 제17항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA와, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제2의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 13 또는 14에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제2의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 피토프토라 속 균의 DNA와, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제3의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 15 또는 16에 나타내는 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 제3의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균, 피시움 속 균, 피토프토라 속 균 및 기타 미생물의 적어도 어느 하나의 DNA와, 상기 제1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제4의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 17에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제4의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스모디오포라 속 균의 DNA와, 플라스모디오포라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제5의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 18에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제5의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 피시움 속 균의 DNA와, 피시움 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 7 또는 8에 나타낸 염기 서열 중 적어도 어느 하나로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해서 얻은 제6의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 19에 나타내는 염기 서열 및 이 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제6의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA와, 피시움 속 균 또는 피토프토라 속 균의 DNA에서의 rDNA 유전자 ITS 영역을 PCR에 의한 증폭의 표적으로 하는 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와, 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 얻어진 제7의 증폭 산물에 상보적으로 결합하는 서열 번호 20 또는 21에 나타내는 염기 서열 및 이들의 상보 서열의 적어도 어느 하나로 이루어진 제7의 프로브를 추가로 고정화한
    것을 특징으로 하는 미생물 검사용 마이크로어레이.
  24. 이하의 (a), (b) 또는 (c)에 기재된 염기 서열을 갖는 프로브 군에서 선택된 둘 이상의 프로브를 고정화한 것을 특징으로 하는 곰팡이 검출용 담체:
    (a) 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브,
    (b) 서열 번호 101 ~ 106에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 프로브,
    (c) (a) 또는 (b) 의 프로브에 대해서 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브.
  25. 제24항에 있어서, 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum)을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 102에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제1의 프로브 군,
    푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제2의 프로브 군,
    알터나리아 솔라니 (Alternaria solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제3의 프로브 군, 및
    리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제4의 프로브 군의 각 군에서 각각 선택된 프로브를 고정화한 것을 특징으로 하는 곰팡이 검출용 담체.
  26. 검출 대상의 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 PCR에 의해서 증폭시키고, 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법이며,
    PCR용 반응액에 서열 번호 107에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 구성된 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와, 시료를 포함시켜,
    상기 시료에 콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 알터나리아 솔라니 (Alternaria solani) 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 적어도 어느 하나의 DNA가 함유되어 있는 경우
    상기 PCR용 반응액을 사용하여 시료에 함유 되는 DNA에서의 표적 영역을 증폭시키고,
    얻어진 증폭 산물을 제24항 또는 제25항에 기재된 곰팡이 검출용 담체에 적하하여 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브와 결합시키는
    것을 특징으로 하는 곰팡이의 검출 방법.
  27. 검출 대상의 곰팡이 DNA에서의 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트와, 증폭 산물의 유무를 확인하기 위한 프로브가 고정된 담체를 포함하는 곰팡이 검출용 키트이며,
    상기 프라이머 세트가
    서열 번호 107에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 108에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 ITS 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 서열 번호 109에 나타내는 염기 서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열 번호 110에 나타내는 염기 서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 β-튜블린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하고,
    상기 담체가
    콜렉토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum)을 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 102에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제1의 프로브 군,
    푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 103에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브, 및 β-튜블린 유전자에서 선택된 서열 번호 104에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제2의 프로브 군,
    알터나리아 솔라니 (Alternaria solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 105에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 이루어진 제3의 프로브 군, 및
    리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 검출하기 위한, ITS 영역에서 선택된 서열 번호 106에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브로 구성된 제4의 프로브 군의 각 군에서 각각 선택된 프로브를 고정화한
    것을 특징으로 하는 곰팡이 검출용 키트.
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