JP5272154B2 - 新規微生物、並びにそれを用いた植物病害防除剤及び防除方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する新規な微生物に関し、また、該微生物を用いた植物病害防除剤及び植物病害防除方法に関する。
近年、消費者の「食の安心・安全」志向が高まる中、化学合成農薬の使用量の削減が求められており、化学合成農薬の代替として、有用微生物を用いた防除である生物防除の適用が検討されている。また、化学合成農薬では防除が困難な植物病害に対しても、生物防除の適用が検討されている。このような生物防除技術において、有効微生物として乳酸菌を用いることが知られている。乳酸菌は、一般に、人の健康に対して有用とされているので、乳酸菌を用いて農作物の病害を防除することができれば、農薬登録での安全性審査上の問題を生じることなく、消費者の安全性に対する懸念も払拭され、更に農作物の機能性や商品性を向上させることになることから、理想的な病害防除となる。
このような乳酸菌を用いた植物病害防除技術として、本出願人は先に、下記特許文献１において、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）に属する菌株や、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌株を用いることを提案している。
国際公開第２００６／０２５１６７号
本発明者は、上記植物病害防除技術の改良を図るべく鋭意検討していく中で、先に提案した微生物よりも防除効果の高い新規な微生物を単離することに成功した。更に、この微生物の特徴を分析した結果、ラクトバチルス属に属する新種の菌株であるという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、ラクトバチルス属に属する新種の微生物を提供することを目的とする。本発明は、また、該微生物を用いてなる病害防除効果に優れる植物病害防除剤及び防除方法を提供することを目的とする。
本発明は、ラクトバチルス・キョウトエンシス（Lactobacillus kyotoensis）に属するＦＥＲＭ Ｐ−２１５００菌株に関するものである。本発明は、また、該菌株を含有する植物病害防除剤に関するものである。本発明は、また、該菌株で植物及び／又は土壌を処理することを特徴とする植物病害防除方法に関するものである。
本発明に係るラクトバチルス属の新種であるラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株によれば、植物病害に対する防除能を有することから、安全性を確保しながら、農作物の植物病害を防除することができ、安定した農作物生産が可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に係る新規微生物は、植物病害に対する防除能を有するラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株である。
植物病害に対する防除能とは、植物が病原微生物に感染するのを防いだり、増殖や発病を抑制したりする能力である。かかる病害防除能としては、抗生作用、競合作用および抵抗性誘導作用のいずれの作用によるものでもよく、またこれらのいずれか２以上の作用の組み合わせによるものでもよい。ここで、抗生作用とは、抗生物質を生産することによって病原微生物を抑制する作用である。また、競合作用とは、病原微生物よりも生育が盛んで先に空間を占有しあるいは栄養分を先取することにより、病原微生物を抑制する作用である。さらに、抵抗性誘導作用とは、植物に作用して生産させる物質によって植物の抵抗性が高まり、病原微生物の感染や増殖を抑制する作用である。
本発明に係る微生物の一例として、本発明者が単離した菌株（ＳＯＫ０４ＳＷ株）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５００として寄託されている。この菌株は、発酵食品であるイカの塩辛を分離源として、２００６年１１月に単離されたものである。下記実施例で詳述するように、該菌株は、ラクトバチルス・ナンテンシス（Lactobacillus nantensis）、ラクトバチルス・クラストラム（Lactobacillus crustorum）、ラクトバチルス・ファーシミニス（Lactobacillus farciminis）及びラクトバチルス・ミンデンシス（Lactobacillus mindensis）の近縁種であるが、これらとは別種であって、ラクトバチルス属の新種であることが確認された。
このＳＯＫ０４ＳＷ株と上記近縁種との生理学的性質における特徴的な違いは、ＳＯＫ０４ＳＷ株が、メレチトースを発酵し、サリシンを発酵せず、かつ、４５℃で生育性を示す点にある。また、ＳＯＫ０４ＳＷ株が、サッカロースを発酵する点は、ラクトバチルス・クラストラム及びミンデンシスに対する特徴的な違いであり、マンニトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド及びソルビトールを発酵しない点は、ラクトバチルス・ナンテンシスとの特徴的な違いである。
本発明に係る植物病害防除剤は、上記の新規なラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株を含有するものである。植物病害防除剤の形態は通常の農薬がとりうる形態、例えば粒剤、粉剤、水和剤、パック剤、顆粒水和剤、マイクロカプセル剤、乳剤など特に限定されず、任意の剤型に調製でき、目的に応じて使用することが可能である。例として、上記菌株を製剤学的に許容される担体に吸着させて、水和剤、粉剤または粒剤として提供することができる。その場合、担体としては、珪藻土、クレー、タルク、パーライト、もみ殻、骨粉などを用いることができる。なお、該植物病害防除剤に含まれる上記菌株は、必ずしも生きていなくてもよく、死菌体であってもよい。
該植物病害防除剤には、上記のラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株に加えて、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌株（ＳＯＫ０４ＢＹ株）を更に含有してもよい。ＳＯＫ０４ＢＹ株は、下記実施例で詳述するように、植物病害防除能を有する微生物として、上記ＳＯＫ０４ＳＷ株と同時に単離されたものであり、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５０１として寄託されている。これらＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を併用することにより、防除効果を更に高めることができる場合がある。併用する場合、両者の比率は特に限定されないが、菌密度の比で、ＳＯＫ０４ＳＷ株／ＳＯＫ０４ＢＹ株＝１／１０〜１０／１であることが好ましく、より好ましくは１／１０〜１／１である。なお、上記のラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株とともに併用する菌株として、ＳＯＫ０４ＢＹ株以外の菌株を用いてもよい。
本発明に係る植物病害防除方法は、上記のラクトバチルス・キョウトエンシスに属する菌株、又はこれとＳＯＫ０４ＢＹ株とを組み合わせて、植物や土壌に処理するというものであり、その処理方法は特に限定されない。例えば、次の方法が挙げられる。なお、処理方法において、これらの菌株は必ずしも生きていなくてもよく、死菌体も用いることができる。
（１）上記菌株が分散した液体（例えば、菌株の培養液）を植物に処理する方法。これには、菌株の分散液を種子に噴霧したり、該分散液に種子を浸漬するなどして、種子に対して処理することが含まれる。また、該分散液に定植前の苗の根部を浸漬すること、該分散液を葉や茎などに噴霧処理することなども含まれる。
（２）上記菌株の分散液を土壌に処理する方法。これには、該分散液を播種用培土や育苗用培土、圃場などに噴霧したり、灌注することが含まれ、その場合、植物の定植前や種子の播種前の土壌に処理してもよく、定植後や播種後の土壌に処理してもよい。
（３）上記菌株をそれ自体粉末化し、又は担体に付着させて調製した粉末又は粒状の防除剤を、植物に処理する方法。これには、かかる粉末又は粒状の防除剤を種子表面に付着させたり、又は種子と混合して播種するなどして、種子に対して処理することが含まれる。
（４）上記粉末状又は粒状の防除剤を土壌に処理する方法。これには、該粉末又は粒状の防除剤を、上記した各種培土や圃場の土に混ぜ込んだり、あるいは圃場の土の上にふりかけたりすることが含まれる。
本発明で防除の対象とする植物病害としては、土壌病害を始めとする各種植物病害が挙げられ、例えば、ホウレンソウなどのアカザ科作物、イネ、トウモロコシなどのイネ科作物、サトイモ、カラー、ポトスなどのサトイモ科作物、ネギ、タマネギ、チューリップ、ユリなどのユリ科作物、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ストック、ハボタン、ミズナなどのアブラナ科作物、イチゴ、ウメ、モモ、リンゴなどのバラ科作物、ダイズ、アズキなどのマメ科作物、ニンジン、パセリなどのセリ科作物、トウガラシ、ナス、トマト、ジャガイモ、ペチュニアなどのナス科作物、キュウリ、スイカ、カボチャなどのウリ科作物、ゴボウ、レタス、キク、コスモス、ヒマワリなどのキク科作物、グラジオラスなどのアヤメ科作物、スターチスなどのイソマツ科作物、セントポーリアなどのイワタバコ科作物、キンギョソウ、トレニアなどのゴマノハグサ科作物、カーネーション、カスミソウなどのナデシコ科作物、アサガオなどのヒルガオ科作物、スイセンなどのヒガンバナ科作物、カトレア、シンビジウムなどのラン科作物、カキなどのカキノキ科作物、イチジクなどのクワ科作物、ブドウなどのブドウ科作物、クリなどのブナ科作物、温州ミカン、レモンなどのミカン科作物、キウイフルーツなどのマタタビ科作物などに生じる萎凋病、立枯病、株腐病、半身萎凋病、黒斑病、根こぶ病、疫病、白さび病、べと病、さび病、紫紋羽病、白絹病、うどんこ病、炭そ病、灰色かび病、いもち病、軟腐病、青枯病、黒腐病、かいよう病、斑点細菌病、根頭がん腫病、そうか病などが挙げられ、これらのいずかに対して病害防除能を持てばよい。
また、病原微生物としては、フザリウム属（Fusarium）、ピシウム属（Phytium）、リゾクトニア属（Rhizoctonia）、バーティシリウム属（Verticillium）、アルタナリア属（Alternaria）、プラズモディオフォラ属（plasmodiophora）、フィトフィトラ属（Phytophthora）、アルブゴ属（Albugo）、ペロノスポーラ属（Peronospora）、プクシニア属（Puccinia）、ヘリコバシディウム属（Hericobasidium）、スクレロティウム属（Sclerotium）、スフェロテカ属（Sphaerotheca）、コレトトリカム属（Colletotrichum）、ボトリチス（Botrytis）、ピリクラリア属（Pyricularia）などの糸状菌や、エルヴィニア属（Erwinia）、ラルストニア属（Ralstonia）、キサントモナス属（Xanthomonas）、クラビバクター属（Clavibacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）などの細菌、ストレプトミセス属（Streptomyces）などの放線菌が挙げられる。
これらの中でも、エルヴィニア属等の細菌やピシウム属等の糸状菌を病原微生物とする植物病害に効果的であり、例えば、ハクサイやミズナ等のアブラナ科作物の軟腐病や立枯病に対する病害防除に効果的に用いられる。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
（実施例１：新規微生物の単離）
ハクサイ軟腐病を防除する乳酸菌の探索を目的として、発酵乳や発酵食品などから乳酸菌を分離した。乳酸菌の分離方法は次の通りである。すなわち、サンプル（例えば、イカの塩辛）を１０倍量の滅菌水とともに磨砕し、その磨砕液を滅菌水で適宜希釈した。その希釈液をシャーレに入れ、約５０℃に冷ましたＭＲＳ寒天培地（DifoTMLactobacilli MRS Broth ５５ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、寒天１２ｇ／Ｌ）と混釈したのち固化し、３０℃で２，３日間培養した。培養後、周りにクリアゾーンを形成しているコロニーを乳酸菌として分離した。
ハクサイ軟腐病を防除する乳酸菌の探索を目的として、発酵乳や発酵食品などから乳酸菌を分離した。乳酸菌の分離方法は次の通りである。すなわち、サンプル（例えば、イカの塩辛）を１０倍量の滅菌水とともに磨砕し、その磨砕液を滅菌水で適宜希釈した。その希釈液をシャーレに入れ、約５０℃に冷ましたＭＲＳ寒天培地（DifoTMLactobacilli MRS Broth ５５ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、寒天１２ｇ／Ｌ）と混釈したのち固化し、３０℃で２，３日間培養した。培養後、周りにクリアゾーンを形成しているコロニーを乳酸菌として分離した。
各種分離源から得られた乳酸菌を供試して、キャベツ葉ディスクを用いた一次選抜を実施した。一次選抜では、各乳酸菌をＭＲＳ液体培地（DifoTMLactobacilli MRS Broth）８ｍｌで３０℃、２日間静置培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０８ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍｌに懸濁し、そこに軟腐病菌（エルヴィニア・カルトボーラ（Erwinia carotovora）ＭＡＦＦ３０２８１８株）が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた。直径１ｃｍのキャベツ葉ディスク８枚を上述の混合懸濁液に２４℃、１時間浸漬処理した後、ディスク表面の水分をふき取り、９ｃｍ滅菌シャーレに並べ、２８℃、２４時間静置した。なお、対照区では、滅菌水に軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた液にディスクを浸漬処理した。
各ディスクの病徴面積が０％、１〜４９％、５０〜９９％、１００％をそれぞれ発病指数０、１、２、３と評価し、次式により発病度及び防除価を算出し、防除価４０以上を示す菌株を、植物病害防除能を有する乳酸菌として選抜した。
発病度＝Σ（指数×ディスク数）／（３×全ディスク数）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
次に、ポット試験による二次選抜を実施した。二次選抜では、一次選抜された乳酸菌をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３０℃、２日間静置培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、１０８〜９ｃｆｕ／ｍｌに懸濁し、そこに軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた。得られた混合懸濁液に裁縫針１０本を束にした接種用針の先端を浸け、播種３週間後のハクサイ葉（品種：無双）の中ろく部に穿刺接種した。接種は１株当たり３箇所、各区５株とした。対照区には、滅菌水に軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた液を用いた。
接種２、３日後に発病を調査した。発病調査は、接種部位ごとに、健全又は褐変のみを０、病徴１ｃｍ未満を１、病徴１ｃｍ以上を２と評価し、これを発病指数として、次式により発病度と防除価を算出した。
発病度＝Σ（指数×接種部位数）／（２×全接種部位数）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
二次選抜は２回実施し、２回の防除価がともに９０以上と、最も高かった乳酸菌として、イカの塩辛を分離源とするＳＯＫ０４株が選抜された。このＳＯＫ０４株について更に精査したところ、ＳＯＫ０４株には２種の乳酸菌が混在していることが判明したので、画線培養により両者を単離し、一方をＳＯＫ０４ＳＷ株、他方をＳＯＫ０４ＢＹ株とした。なお、後述するように、ＳＯＫ０４ＳＷ株及びＳＯＫ０４ＢＹ株ともに病害防除能を有し、ＳＯＫ０４ＳＷ株の方がより高い防除能を有していた。
（実施例２：ＳＯＫ０４ＳＷ株の分析）
ＳＯＫ０４ＳＷ株の細菌学的性質を分析したところ、次の通りであった。
ＳＯＫ０４ＳＷ株の細菌学的性質を分析したところ、次の通りであった。
１．形態的、培養的及び生理学的性質
ＭＲＳ寒天培地（Oxoid製、Hampshire、英国）を用い、培養温度３０℃、培養時間２４時間、嫌気条件で培養した菌株を供試菌体とした。
ＭＲＳ寒天培地（Oxoid製、Hampshire、英国）を用い、培養温度３０℃、培養時間２４時間、嫌気条件で培養した菌株を供試菌体とした。
光学顕微鏡（BX50F4、オリンパス製）による形態観察を実施するとともに、ＢＡＲＲＯＷらの方法（BARROW,(G.I.)他: Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press）に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）の試験を実施した。グラム染色には、フェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬製）を用いた。また、ＡＰＩ５０ＣＨＬ（bioMerieux製、Lyon、フランス）のキットを用いて発酵性試験を実施した。結果を下記表１に示す。
２．１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析
ＤＮＡ抽出はInstaGene Matrix（BIO RAD製、CA、米国）により、ＰＣＲはPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ製）により、サイクルシークエンスはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems製、CA、米国）により、それぞれ実施した。使用プライマー（中川恭好他：遺伝子解析法 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定、88-117pp.日本学会事務センター、2001）は、9F, 339F, 785F, 1099F, 536R, 802R, 1242R, 1541Rである。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System（Applied Biosystems製、CA、米国）により行い、解析ソフトウェアはAuto Assembler（Applied Biosystems製、CA、米国）及びアポロン（テクノスルガ製）を用いて、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（テクノスルガ製）及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対する相同性検索を実施した。
ＤＮＡ抽出はInstaGene Matrix（BIO RAD製、CA、米国）により、ＰＣＲはPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ製）により、サイクルシークエンスはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems製、CA、米国）により、それぞれ実施した。使用プライマー（中川恭好他：遺伝子解析法 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定、88-117pp.日本学会事務センター、2001）は、9F, 339F, 785F, 1099F, 536R, 802R, 1242R, 1541Rである。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System（Applied Biosystems製、CA、米国）により行い、解析ソフトウェアはAuto Assembler（Applied Biosystems製、CA、米国）及びアポロン（テクノスルガ製）を用いて、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（テクノスルガ製）及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対する相同性検索を実施した。
ＢＬＡＳＴ（ALTSCHUL,(S.F.)他: Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.Nucleic Acid Res.1997.25,3389-3402）を用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、ＳＯＫ０４ＳＷ株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はラクトバチルス属由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対して高い相同性を示し、ラクトバチルス・ナンテンシス（L. nantensis）ＬＰ３３株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し相同率９９．３％、ラクトバチルス・ファーシミニス（L. farciminis）ＪＣＭ１０９７株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し相同率９８．３％の相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においても、ＳＯＫ０４ＳＷ株はラクトバチルス属由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではラクトバチルス・ナンテンシス（L. nantensis）ＬＰ３３株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し相同率９９．３％の相同性を示した。
３．分子系統解析
上記で得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列約１５００ｂｐを用い、推定される近縁菌群の基準株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを取得して分子系統解析を実施した。詳細には、データベースとしてアポロンＤＢ−ＢＡ３．０（テクノスルガ製）及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を用い、またソフトウェアとしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（THOMPSON (J.D.)他: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting positions-specific gap and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 1994, 22:4673-4680）及びＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１（KUMAR,(S.)他: MEGA3: Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment. Briefings in Bioinformatics, 2004,5,150-163）を用いた。
上記で得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列約１５００ｂｐを用い、推定される近縁菌群の基準株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを取得して分子系統解析を実施した。詳細には、データベースとしてアポロンＤＢ−ＢＡ３．０（テクノスルガ製）及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を用い、またソフトウェアとしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（THOMPSON (J.D.)他: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting positions-specific gap and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 1994, 22:4673-4680）及びＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１（KUMAR,(S.)他: MEGA3: Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment. Briefings in Bioinformatics, 2004,5,150-163）を用いた。
分子系統樹の作成は近隣結合法（SAITOU, (N.) and NEI, (M.): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 1987, 4, 406-425）により行い、ブートストラップ値（FELSENSTEIN (J.): Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 1985, 39: 783-791）は１０００回発生させた。
分子系統樹推定に用いた１６Ｓ ｒＤＮＡの由来菌株は以下の通りである。
・Lactobacillus alimentarius DSM 20249T (M58804)
・Lactobacillus casei JCM 1134T (D16551)
・Lactobacillus crustorum LMG 23699T (AM285450)
・Lactobacillus farciminis JCM 1097T (Tecsrg13)
・Lactobacillus kimchii JCM 10707T (Tecsrg20)
・Lactobacillus mindensis TMW 1.80T (AJ313530)
・Lactobacillus nantensis LP33T (AY690834)
・Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T (AJ417500)
・Lactobacillus versmoldensis KU-3T (AJ496791)
株名の末尾のＴはその種の基準株を示す。括弧内はアクセッション番号であり、同番号にTecsrg標記のある株は（株）テクノスルガ・ラボのシークエンス株であることを示す。
・Lactobacillus alimentarius DSM 20249T (M58804)
・Lactobacillus casei JCM 1134T (D16551)
・Lactobacillus crustorum LMG 23699T (AM285450)
・Lactobacillus farciminis JCM 1097T (Tecsrg13)
・Lactobacillus kimchii JCM 10707T (Tecsrg20)
・Lactobacillus mindensis TMW 1.80T (AJ313530)
・Lactobacillus nantensis LP33T (AY690834)
・Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T (AJ417500)
・Lactobacillus versmoldensis KU-3T (AJ496791)
株名の末尾のＴはその種の基準株を示す。括弧内はアクセッション番号であり、同番号にTecsrg標記のある株は（株）テクノスルガ・ラボのシークエンス株であることを示す。
得られた分子系統樹を図１に示す。枝の分岐付近の数字がブートストラップ値であり、左下の線はスケールバーを示す。
４．ＤＮＡ塩基組成
ＭＲＳブロス（Oxoid製、Hampshire、英国）を用い、培養温度３０℃、培養時間２４時間、嫌気条件で培養した培養菌株から河本らの方法（河本好章、江崎孝行「細菌の系統分類と同定方法」第１８回日本細菌学会技術講習会テキスト、日本細菌学雑誌、2000, 55, 545-584）によりＤＮＡを抽出・精製した。
ＭＲＳブロス（Oxoid製、Hampshire、英国）を用い、培養温度３０℃、培養時間２４時間、嫌気条件で培養した培養菌株から河本らの方法（河本好章、江崎孝行「細菌の系統分類と同定方法」第１８回日本細菌学会技術講習会テキスト、日本細菌学雑誌、2000, 55, 545-584）によりＤＮＡを抽出・精製した。
精製したＤＮＡについて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＧＣ含量を測定した。ＨＰＬＣを用いた測定法は、Katayamaらの方法（Katayama他: Estimation of DNA base composition by high performance liquid chromatography of its nuclease P1 hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 3169-3172）に基づき、ＨＰＬＣ（LC-10、島津製作所製）を使用した。なお、ヌクレアーゼ及び標準ヌクレオチド混合物は、DNA-GC Kit（ヤマサ醤油製、生化学工業販売）を使用した。
その結果、ＳＯＫ０４ＳＷ株のＧＣ含量は３４．６％であった。
５．ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験
上記４と同条件で培養した培養菌株から上記河本らの方法によりＤＮＡを抽出し、得られた粗抽出ＤＮＡを浜本の方法（浜本牧子「細胞外多糖を生成する担子菌系酵母のＤＮＡ抽出・精製法」、Microbiol. Cult. Coll. 1994, 10, 116-118）によりセシウムクロライドを用いた超遠心分離によって精製した。
上記４と同条件で培養した培養菌株から上記河本らの方法によりＤＮＡを抽出し、得られた粗抽出ＤＮＡを浜本の方法（浜本牧子「細胞外多糖を生成する担子菌系酵母のＤＮＡ抽出・精製法」、Microbiol. Cult. Coll. 1994, 10, 116-118）によりセシウムクロライドを用いた超遠心分離によって精製した。
精製したＤＮＡを用いて、河本らの方法に準拠したマイクロプレート法を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を実施した。蛍光強度の測定には蛍光プレートリーダー（ジェニオス、ＴＥＣＡＮ（和光純薬製））を使用した。
ＳＯＫ０４ＳＷ株とハイブリダイズさせる近縁種の菌株としては、各種の基準株として、Lactobacillus nantensis DSM 16982、Lactobacillus farciminis JCM 1097、Lactobacillus mindensis JCM 12532、及び、Lactobacillus crustorum LMG 23699を用いた。
結果を下記表２に示す。ハイブリッド形成試験は各組み合わせについて３回ずつ行い、その平均値を表２に示した。
６．乳酸分析
上記４と同条件で培養した培養液を遠心分離して上清を回収し、これより有機酸を抽出した。抽出した有機酸からＨＰＬＣを用いて乳酸を測定した。標準試料としては、Ｌ−乳酸（和光純薬工業製）とＤ−乳酸（武蔵化学研究所製）を用いた。また、ＨＰＬＣ分析の条件は、カラム：SUMICHIRAL OA-5000 4.6φ×150mm、移動相：２ｍＭ硫酸銅２％イソプロパノール、検出：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：０．８ｍｍ／分、温度：４０℃、注入量：５μＬとした。
上記４と同条件で培養した培養液を遠心分離して上清を回収し、これより有機酸を抽出した。抽出した有機酸からＨＰＬＣを用いて乳酸を測定した。標準試料としては、Ｌ−乳酸（和光純薬工業製）とＤ−乳酸（武蔵化学研究所製）を用いた。また、ＨＰＬＣ分析の条件は、カラム：SUMICHIRAL OA-5000 4.6φ×150mm、移動相：２ｍＭ硫酸銅２％イソプロパノール、検出：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：０．８ｍｍ／分、温度：４０℃、注入量：５μＬとした。
その結果、標準試料とのピーク保持時間からＳＯＫ０４ＳＷ株が生成する有機酸は乳酸であった。そして、２回の測定によるピーク面積比から光学異性体の含有比率を算出したところ、Ｌ−乳酸が９４％、Ｄ−乳酸が６％であった。よって、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、乳酸を生成し、その組成比はＬ体が９４％、Ｄ体が６％である。
７．考察及び結論
上記２の１６Ｓ ｒＤＮＡによる相同性検索の結果より、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ラクトバチルス属に含まれ、既知種ではラクトバチルス・ナンテンシス（L. nantensis）に最も近い近縁であると考えられる。
上記２の１６Ｓ ｒＤＮＡによる相同性検索の結果より、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ラクトバチルス属に含まれ、既知種ではラクトバチルス・ナンテンシス（L. nantensis）に最も近い近縁であると考えられる。
また、上記３の分子系統解析結果（図１）より、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ラクトバチルス・ナンテンシス（L. nantensis）、ラクトバチルス・クラストラム（L. crustorum）、ラクトバチルス・ファーシミニス（L. farciminis）及びラクトバチルス・ミンデンシス（L. mindensis）と近縁であると考えられ、しかも、これら４種のいずれかと同種になる可能性は低いと考えられる。また、ＳＯＫ０４ＳＷ株とこれら４種が形成するクラスターは、ラクトバチルス・アリメンタリウス（L. alimentarius）、ラクトバチルス・キムチ（L. kimchii）及びラクトバチルス・パラリメンタリウス（L. paralimentarius）の３種が形成するクラスターとの分岐におけるブーストラップ値が１００％を示すことから、その構成種は変化しないと考えられる。
一方、上記１の形態的、培養的及び生理学的性質の結果より、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、運動性を示さないグラム陽性桿菌で、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応が共に陰性を示しており、ラクトバチルス属等の乳酸菌の一般性状と一致していた。
次に、ＳＯＫ０４ＳＷ株の生理・生化学的特徴を挙げる。ＳＯＫ０４ＳＷ株は１０℃で生育せず、４５℃で生育性を示し、さらに８％ＮａＣｌに耐性を示した。特に、４５℃で生育性を示す点は、ラクトバチルス・ナンテンシス、ラクトバチルス・ファーシミニス及びラクトバチルス・ミンデンシスとの特徴的な違いである。発酵性試験の結果より、ＳＯＫ０４ＳＷ株はラクトバチルス・ナンテンシスとはマンニトール、ソルビトール、アルブチン、メリビオース、ラフィノース及びα−メチル−Ｄ−マンノシドを発酵しない点で異なっていた。また、ラクトバチルス・クラストラムとはサッカロースを発酵する点において、ラクトバチルス・ミンデンシスとはガラクトース、ラクトース、サッカロース及びトレハロースを発酵する点において異なっていた。更に、メレチトースを発酵し、サリシンを発酵しない点において、上記の近縁４種いずれとも異なっていた。下記表３にＳＯＫ０４ＳＷ株と上記４種の近縁種との形態的・生理学的性質の対比表を示す。
表３中の各近縁種の形態的・生理学的データの出典は以下の通りである。
・ラクトバチルス・ナンテンシス：Rosica Valcheva他: Lactobacillus nantensis sp. nov., isolated from French wheat sourdough. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2006,56,587-591.
・ラクトバチルス・クラストラム：Ilse Scheirlinck他: Lactobacillus crustorum sp. nov., isolated from two traditional Belgian wheat sourdoughs. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2007,57,1461-1467.
・ラクトバチルス・ファーシミニス：G. REUTER: Lactobacillus alimentarius sp. nov., nom. rev. and Lactobacillus farciminis sp. nov., nom. rev. System.Appl.Microbiol.,1983,4,277-279.
・ラクトバチルス・ミンデンシス：Matthias A. Ehrmann他: Molecular analysis of sourdough reveals Lactobacillus mindensis sp. nov. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2003,53,7-13.
・ラクトバチルス・ナンテンシス：Rosica Valcheva他: Lactobacillus nantensis sp. nov., isolated from French wheat sourdough. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2006,56,587-591.
・ラクトバチルス・クラストラム：Ilse Scheirlinck他: Lactobacillus crustorum sp. nov., isolated from two traditional Belgian wheat sourdoughs. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2007,57,1461-1467.
・ラクトバチルス・ファーシミニス：G. REUTER: Lactobacillus alimentarius sp. nov., nom. rev. and Lactobacillus farciminis sp. nov., nom. rev. System.Appl.Microbiol.,1983,4,277-279.
・ラクトバチルス・ミンデンシス：Matthias A. Ehrmann他: Molecular analysis of sourdough reveals Lactobacillus mindensis sp. nov. Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2003,53,7-13.
以上のことから、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ラクトバチルス・ナンテンシス、ラクトバチルス・クラストラム、ラクトバチルス・ファーシミニス及びラクトバチルス・ミンデンシスを近縁種とするラクトバチルス属の新種であることが示唆される。
そこで、ＳＯＫ０４ＳＷ株と上記４種の近縁種との間で、上記５のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を実施したところ、ＳＯＫ０４ＳＷ株と上記４種の近縁種の各基準株に対するＤＮＡ−ＤＮＡ相同値の平均がいずれも７０％未満の値を示した（表２参照）。細菌の種はＤＮＡ−ＤＮＡ相同値が７０％以上の菌株同士を同種とすると定義されている（Wayne L. G.他, Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int.J.Syst.Bacteriol.,1987,37,463-464）。そのため、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、上記４種の近縁種とは互いに別種であり、ラクトバチルス属の新種であることが示された。
以上より、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ラクトバチルス属の新種に分類されると結論づけられたので、この新規菌株をラクトバチルス・キョウトエンシス（Lactobacillus kyotoensis）と命名した。
８．微生物の寄託
ＳＯＫ０４ＳＷ株は、京都府の一機関である京都府農業資源研究センター（所長：並木 隆和、あて名：郵便番号６１９−０２４４ 日本国京都府相楽郡精華町大字北稲八間小字大路７４番地）の名称で、次の通り寄託されている。
・寄託機関の名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、
・寄託機関のあて名：郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６、
・寄託日：２００８年２月５日（受託日）
・寄託の際の識別のための表示：Lactobacillus sp. SOK04SW
・受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１５００。
ＳＯＫ０４ＳＷ株は、京都府の一機関である京都府農業資源研究センター（所長：並木 隆和、あて名：郵便番号６１９−０２４４ 日本国京都府相楽郡精華町大字北稲八間小字大路７４番地）の名称で、次の通り寄託されている。
・寄託機関の名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、
・寄託機関のあて名：郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６、
・寄託日：２００８年２月５日（受託日）
・寄託の際の識別のための表示：Lactobacillus sp. SOK04SW
・受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１５００。
（実施例３：ＳＯＫ０４ＢＹ株の分析）
実施例２の上記１及び２と同様の方法により、ＳＯＫ０４ＢＹ株の細菌学的性質を分析した。
実施例２の上記１及び２と同様の方法により、ＳＯＫ０４ＢＹ株の細菌学的性質を分析した。
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果より、ＳＯＫ０４ＢＹ株は、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）またはラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に帰属する菌株であると推定された。
形態的、培養的及び生理学的性質については下記表４の通りであり、この結果から、ＳＯＫ０４ＢＹ株は、運動性を示さないグラム陽性桿菌で、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応が共に陰性を示しており、ラクトバチルス属等の乳酸菌の一般性状と一致していた。また、ＳＯＫ０４ＢＹ株は、Ｌ−アラビノース、リボース及びガラクトースなどを発酵し、グリセロールやフラクトースなどは発酵せず、更に１０℃で生育性を示した。これらの性状は、上記２種の内、ラクトバチルス・プランタラムの性状と一致し、グリセロールとＤ−キシロースを発酵しない点でラクトバチルス・ペントサスとは異なっていた。
以上より、ＳＯＫ０４ＢＹ株は、ラクトバチルス・プランタラムに帰属する菌株であると同定し、ＳＯＫ０４ＳＷ株と同様に、京都府農業資源研究センターの名称で、次の通り寄託した。
・寄託機関の名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、
・寄託機関のあて名：郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６、
・寄託日：２００８年２月５日（受託日）
・受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１５０１。
・寄託機関のあて名：郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６、
・寄託日：２００８年２月５日（受託日）
・受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１５０１。
（実施例４：乳酸菌製剤（植物病害防除剤）の調製）
植物病害防除能を有する乳酸菌として、上記ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を用いて、乳酸菌製剤を調製した。調製は、菌株１０重量％、ラウリル硫酸ナトリウム０．５重量％、リグニンスルホン酸ナトリウム４．５重量％、ホワイトカーボン２．５重量％、クレー８２．５重量％を均一に混合粉砕することにより水和剤とした。
植物病害防除能を有する乳酸菌として、上記ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を用いて、乳酸菌製剤を調製した。調製は、菌株１０重量％、ラウリル硫酸ナトリウム０．５重量％、リグニンスルホン酸ナトリウム４．５重量％、ホワイトカーボン２．５重量％、クレー８２．５重量％を均一に混合粉砕することにより水和剤とした。
乳酸菌製剤は、ＳＯＫ０４ＳＷ株を用いたＳＯＫ０４ＳＷ製剤と、ＳＯＫ０４ＢＹ株を用いたＳＯＫ０４ＢＹ製剤と、これら両菌株を含むＳＷ・ＢＹ混合製剤とを調製した。また、比較のため、上記特許文献１に開示されたＳＨＨ１５株（ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株）についても同様に、乳酸菌製剤（ＳＨＨ１５製剤）を調製した。
各乳酸菌製剤の菌密度はいずれも１×１０１０ｃｆｕ／ｇとした。ＳＷ・ＢＹ混合製剤では、両菌株の配合比をＳＯＫ０４ＳＷ株／ＳＯＫ０４ＢＹ株＝１／６とし、両菌株の合計で１×１０１０ｃｆｕ／ｇとした。
（実施例５：圃場での病害防除効果試験（試験１））
軟腐病菌に汚染された圃場にハクサイ苗（品種：無双）を定植して、慣行栽培を行った。その後、結球開始期頃から下記表５に示す乳酸菌製剤の１０００倍液（製剤１ｇを１Ｌの水に希釈した液）を３〜５回散布し、収穫期に発病調査を実施した。なお、乳酸菌製剤を散布しない対照区も設けた。
軟腐病菌に汚染された圃場にハクサイ苗（品種：無双）を定植して、慣行栽培を行った。その後、結球開始期頃から下記表５に示す乳酸菌製剤の１０００倍液（製剤１ｇを１Ｌの水に希釈した液）を３〜５回散布し、収穫期に発病調査を実施した。なお、乳酸菌製剤を散布しない対照区も設けた。
発病調査は、発病しなかったものを０、外葉の一部のみが発病したものを１、結球葉の一部に発病したものを２、結球葉の大部分が発病したものを３と評価し、これを発病指数として、次式により発病度と防除価を算出した。
発病度＝Σ（指数×株数）／（３×全株数）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／対照区の発病度）×１００
その結果、表５に示すように、ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株は共にハクサイ軟腐病に対する防除効果を有し、特に、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、ＳＯＫ０４ＢＹ株に対して、より優れた防除効果を有していた。
（実施例６：圃場での病害防除効果試験（試験２））
実施例５とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。但し、本実施例では、下記表６に示す乳酸菌製剤の５００倍液と１０００倍液をそれぞれ用いた。また、比較のために、市販の微生物農薬（非病原性エルヴィニア細菌剤）であるバイオキーパー（セントラル硝子株式会社製）も用いた。
実施例５とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。但し、本実施例では、下記表６に示す乳酸菌製剤の５００倍液と１０００倍液をそれぞれ用いた。また、比較のために、市販の微生物農薬（非病原性エルヴィニア細菌剤）であるバイオキーパー（セントラル硝子株式会社製）も用いた。
その結果、表６に示すように、ＳＯＫ０４ＳＷ株は、他のいずれの菌株に対しても病害防除効果が高かった。
（実施例７：圃場での病害防除効果試験（試験３））
実施例５及び６とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。また、比較のために、上記市販のバイオキーパーも用いた。
実施例５及び６とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。また、比較のために、上記市販のバイオキーパーも用いた。
その結果、表７に示すように、ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を併用したＳＷ・ＢＹ混合製剤は、単独使用のＳＯＫ０４ＳＷ株よりも優れた病害防除効果を有していた。
（実施例８：圃場での病害防除効果試験（試験４））
実施例５〜７とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。その結果、表８に示すように、ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を併用したＳＷ・ＢＹ混合製剤は、単独使用のＳＯＫ０４ＳＷ株よりも優れた病害防除効果を有していた。
実施例５〜７とは異なる軟腐病汚染圃場において、実施例５と同様にして病害防除効果試験を行った。その結果、表８に示すように、ＳＯＫ０４ＳＷ株とＳＯＫ０４ＢＹ株を併用したＳＷ・ＢＹ混合製剤は、単独使用のＳＯＫ０４ＳＷ株よりも優れた病害防除効果を有していた。
（実施例９：ミズナ立枯病に対する防除効果試験）
ミズナ種子（品種：城南千筋）２７０ｍｇをＳＯＫ０４ＳＷ株の懸濁液（１０７ｃｆｕ／ｍｌ、８００ｍｌ）に２０℃、２４時間浸種処理した後、市販の培土を詰めた硬質ポット（直径１５ｃｍ）に１４粒ずつ播種した（８反復／区）。イタリアンライグラス培地（種子粉末１ｇ、蒸留水５ｍｌ）で２０℃、一週間培養した立枯病菌（ピシウム属、Pythium aphanidermatun OPU693株）を滅菌培土５０ｇと一緒に磨砕し、それを滅菌培土で３００倍に希釈して汚染土を作製し、該汚染土で上記の播種したミズナ種子を覆土した。温室内で栽培し、播種７日後及び１４日後に、それぞれ不発芽株と立枯株を発病株として調査し、併せて発病株とした。なお、対照区では、滅菌水にミズナ種子を２０℃、２４時間浸種処理し、その他は同様に行った。
ミズナ種子（品種：城南千筋）２７０ｍｇをＳＯＫ０４ＳＷ株の懸濁液（１０７ｃｆｕ／ｍｌ、８００ｍｌ）に２０℃、２４時間浸種処理した後、市販の培土を詰めた硬質ポット（直径１５ｃｍ）に１４粒ずつ播種した（８反復／区）。イタリアンライグラス培地（種子粉末１ｇ、蒸留水５ｍｌ）で２０℃、一週間培養した立枯病菌（ピシウム属、Pythium aphanidermatun OPU693株）を滅菌培土５０ｇと一緒に磨砕し、それを滅菌培土で３００倍に希釈して汚染土を作製し、該汚染土で上記の播種したミズナ種子を覆土した。温室内で栽培し、播種７日後及び１４日後に、それぞれ不発芽株と立枯株を発病株として調査し、併せて発病株とした。なお、対照区では、滅菌水にミズナ種子を２０℃、２４時間浸種処理し、その他は同様に行った。
播種した全数に対する発病株数の比率を発病株率とし、次式により防除価を算出した。
防除価＝（１−処理区の発病株率／対照区の発病株率）×１００
防除価＝（１−処理区の発病株率／対照区の発病株率）×１００
結果は表９に示す通りであり、ポット試験において、少発生条件でのＳＯＫ０４ＳＷ株のミズナ立枯病に対する防除効果が認められた。ミズナに対する登録農薬は極めて少ないため、本菌の防除効果は有用である。
本発明に係る新規微生物は、植物病害防除を始めとする各種用途に用いることができる。また、本発明に係る植物病害防除剤および防除方法は、人の健康にも有益とされる乳酸菌を用いて植物病害を防除することができることから、安全で安定した農作物生産に寄与することができる。
Claims (5)
- ラクトバチルス・キョウトエンシス（Lactobacillus kyotoensis）ＦＥＲＭ Ｐ−２１５００菌株。
- 植物病害に対する防除能を有する請求項１記載の菌株。
- 請求項１又は２に記載の菌株を含有する植物病害防除剤。
- ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＦＥＲＭ Ｐ−２１５０１菌株を更に含有する請求項３記載の植物病害防除剤。
- 請求項１又は２に記載の菌株で植物及び／又は土壌を処理することを特徴とする植物病害防除方法。
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