JP4427516B2 - ハウスダストアレルギーの原因となるダニ・カビ類の検出・識別システム - Google Patents
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Description
(1) 検査対象から採取したダニ類及びカビ類由来のゲノムDNA又はmRNAを鋳型とし、ダニ遺伝子特異的プライマーセット及びカビ遺伝子特異的プライマーセットを用いて増幅された検出対象DNA領域に対してハイブリダイズ可能である、ダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(2) 上記ダニ類としてDermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)又はTyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)であり、上記カビ類としてAlternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum又はEurotium herboriorum由来の検出対象DNA領域に対してハイブリダイズ可能であることを特徴とする(1)記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(3) 上記ダニ遺伝子特異的プライマーセットは以下の(a)、(b)又は(c)であることを特徴とする(1)記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(a)配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号56に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号57塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号56に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(4) 上記カビ遺伝子特異的プライマーセットは以下の(a)、(b)又は(c)であることを特徴とする(1)記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(a)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号58に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号59塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号58に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(5) 配列番号1、5、9、13、17及び21からなる群より選ばれる1の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする(1)記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(6) 配列番号24、28、32、36、40、44及び48〜53からなる群より選ばれる1の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする(1)記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
(7) (1)〜(6)いずれか一項に記載の核酸プローブと、前記核酸プローブを固定化した支持担体とを備える、ダニ類及びカビ類の検出及び識別用アレイ。
本実施例では、Dermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)、Tyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)の3種のダニを識別できるPCR条件について検討した。
DP-ITS1R:5'- TTT gTA TCA ATg TTT ATg g -3'(配列番号11)
DP-ITS2F:5'- TAT CAA ATT ATg ACC AAA C -3'(配列番号14)
DP-ITS2R:5'- TAC ATT gAT TTg TCA ACC -3'(配列番号15)
上記プライマーを用いて表1及び2に示す条件でPCRを行った。
DF-ITS1R:5'- TTg TTT CAA TgA TAC Tgg C -3'(配列番号3)
TP-ITS2F:5'- ATA TgC CAA ACA CCA TgC -3'(配列番号22)
TP-ITS2R:5'- gAA AgT TAA CAA CAA CTg C -3'(配列番号23)
上記プライマーを用いて表3及び4に示す条件でPCRを行った。
本実施例では、検出及び標識対象のダニ類からのゲノムDNAを抽出する方法について検討した。本実施例では、供試ダニとしてアレルゲンの原因ダニとして知られるコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)を用いた。虫体の破砕には、ホモジナイゼーションペッスル(フナコシ株式会社)もしくは乳鉢・乳棒を用いた。Proteinase KはMERCK社の製品を用い、酵素反応は定法に従い0.5% SDSの存在下37℃で1時間行った。全ての手法において最終的にCTAB処理を行い、イソプロパノールにてDNAを沈殿させた。遠心分離を行い、上清を除去した後、10μLの滅菌水に溶解した。そのうち4μLを用いてrDNA ITS領域のPCRにより増幅を行った。
Arthro-ITSF:5'- TAg Agg AAg TAA Aag TCG-3'(配列番号60)
Inaect-ITSR:5'- CCT TAg Atg gAg TTT ACC-3'(配列番号61)
本実施例では、ダニ遺伝子特異的プライマー又はカビ遺伝子特異的プライマーを使用した、いわゆる1-tube PCRについて検討した。
Acari ITS1:5'- CAA ggT TTC CgT Agg TgA AC -3' (Tm: 55.4 ℃)(配列番号56)
Acari ITS2 R:5'- gCT TgA TCT gAg gTC gA -3' (Tm: 52.2 ℃)(配列番号57)
ITS1-F:5'- CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3' (Tm: 53.0 ℃)(配列番号58)
FO514:5'- TAT GCT TAA GTT CAG CGG GTA GTC C -3' (Tm: 60.5 ℃)(配列番号59)
これらプライマーセットにより増幅される領域はITS1~5.8S~ITS2である。
1:Alternaria alternata+Dermatophagoides farinae
2:Cladsporium sphaerospermum+Dermatophagoide pteronyssinus
3:Eurotium herbariorum +Tyrophagus putrescentiae
Claims (2)
- 検査対象から採取したカビ類のゲノムDNA又はmRNAを鋳型とし、当該カビ類の検出及び識別を可能とする検出対象DNA領域を増幅することができ、以下の(a)、(b)又は(c)に記載のカビ遺伝子特異的プライマーセット。
(a)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号58に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号59塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号58に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット - 上記カビ類として、少なくともAlternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum及びEurotium herboriorumにおける上記検出対象DNA領域を増幅することができる請求項1記載のカビ遺伝子特異的プライマーセット。
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