CN107841571A - 一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对18S rDNA基因、ITS基因、内标基因(int)保守区设计引物和荧光标记探针。18S rDNA、ITS基因探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端均标记荧光淬灭基团TAMRA，int基因5’端均标记荧光报告基团JOE，3’端均标记荧光淬灭基团BHQ1。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道对18S rDNA基因、ITS基因进行扩增，选用JOE通道对int基因进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对痰液和肺泡灌洗液样本中的侵袭性真菌和烟曲霉进行快速、准确检测。

Description

一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
曲霉菌属于条件致病菌，繁殖能力很强，最适生长温度为25～30℃，形成丝状菌落。导致人类疾病的主要霉菌是烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉等，人类曲霉菌病95％以上由烟曲霉引起。随着广谱抗生素、糖皮质激素、细胞毒药物及免疫抑制剂应用的增多，侵袭性肺曲霉病作为一种临床少见病，其发病率也在逐年增多。
人类通过吸入空气中的曲霉孢子致病，肺部是曲霉感染的最常见部位，其他组织包括肺实质，胸膜，气管和支气管，鼻窦等也是曲霉菌的重要侵袭部位。也有报道病菌能够侵袭脑、肝、肾、皮肤等组织，更为严重的是国内外均有报道曲霉菌侵入中枢神经系统的病例，虽较少见，但防治很困难。曲霉菌感染危险人群包括：中性粒细胞减少者；免疫抑制剂治疗者；艾滋病患者；存在移植物抗宿主病患者；有慢性基础疾病者；创伤、大手术、长期住ICU和急救的患者；长时间使用机械通气、体内留置导管、全胃肠外营养者和长期使用广谱抗菌药物糖皮质激素的患者等，其中中性粒细胞减少或缺乏是最重要的危险因素。近年来非中性粒细胞缺乏人群如慢性阻塞性肺疾病、肺结核、糖尿病、严重肝病患者中发生曲霉菌病的报道越来越多，还有许多合并型感染如：2型糖尿病合并侵袭性肺曲霉、淋巴结肿大曲霉菌感染、乙肝肝硬化并侵袭性肺曲霉。其临床表现无特异性，病情重，病死率高，治疗方案不统一，极易误诊、漏诊。现有技术中，无有效的烟曲霉特异性基因ITS检测方法。
发明内容
本发明提供一种检测烟曲霉特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中无有效的烟曲霉特异性基因ITS检测方法的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测烟曲霉特异性基因的引物和探针，检测侵袭性真菌特异性基因18S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。
一种检测烟曲霉特异性基因的方法，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对侵袭性真菌18S核糖体DNA、烟曲霉特异性基因ITS、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
取内标加入到核酸抽提液中，加入比例为1∶50，后面实验步骤均使用加入内标的核酸抽提液。
取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
将18S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将ITS基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号，所述内标为含有内标int基因片段的工程菌；
对于18S rDNA基因和ITS基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的JOE通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
一种检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、18SrDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、ITS基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，检测18S rDNA基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测18S rDNA基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测ITS基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测ITS基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测int基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测int基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。
本发明的有益效果：采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对18S rDNA基因、ITS基因、int基因保守区设计引物和荧光标记探针。18S rDNA、ITS基因探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端均标记荧光淬灭基团TAMRA，内标基因5’端均标记荧光报告基团JOE，3’端均标记荧光淬灭基团BHQ1。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道对18S rDNA基因、ITS基因进行扩增，选用JOE通道对int基因进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对痰液和咽拭子样本中的侵袭性真菌和ITS进行快速、准确检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例四的侵袭性真菌感染样本的荧光定量PCR曲线图；
图2为本发明实施例四的烟曲霉感染样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种检测烟曲霉特异性基因的引物和探针，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
其中，18S rDNA基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-18S rDNA-F：5’-TTTCCCCGTGTTGAGTCAAAT-3’
下游引物P-18S rDNA-R：5’-CGCAAGGCTGAAACTTAAAGGA-3’
针对18S rDNA基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-18SrDNA：5’-FAM-AAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGT-TAMRA-3’
针对ITS基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-ITS-F：5’-ACGGGCCCGAAAGGCA-3’
下游引物P-ITS-R：5’-AAGTTGGGTGTCGGCTGG-3’
针对ITS基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-ITS：5’-FAM-TCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCA-TAMRA-3’
int基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-int-F：5’-GCGATACCACGAGCTAAATC-3’
下游引物P-int-R：5’-GCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’
针对int基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-int：5’-FAM-ACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC-TAMRA-3’
18S rDNA、ITS基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA；int基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
实施例二
本发明实施例中又提供了一种检测烟曲霉特异性基因的方法，包括：
步骤101、样本核酸制备，以获得核酸模板；
步骤102、分别针对侵袭性真菌18S核糖体DNA、烟曲霉特异性基因ITS、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针；
其中，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌18S核糖体DNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
本发明实施例中的内标基因(internal amplification control，int)，是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。水稻核糖体DNA内转录间隔区ITS基因与目的基因同源性极低，可以选取该基因片段作为内标。对18S rDNA、ITS、int基因序列进行同源性比对，选取保守片段分别设计针对这3个基因的特异性引物和荧光标记探针。
步骤103、取内标加入到核酸抽提液中，加入比例为1∶50，后面实验步骤均使用加入内标的核酸抽提液。
步骤104、取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤105、取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤106、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤107、配置酶试剂；
其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
步骤108、将18S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；将ITS基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；
步骤109、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增；
其中，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号，所述内标为含有内标int基因片段的工程菌；
步骤110、对于18S rDNA基因和ITS基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的JOE通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
其中，检测结果根据CT值进行判定，仪器FAM通道CT栏显示Undet.同时JOE通道CT值≤35，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道、JOE通道CT值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间，JOE通道CT值≤35，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。下表1为可能出现的结果及解释：
表1可能出现的结果及解释
本发明采用Taqman探针实时荧光PCR方法。NCBI blast同源性比对侵袭性真菌18S核糖体DNA、烟曲霉特异性基因ITS、内标int基因，选取18S rDNA、ITS、int基因保守片段设计引物和荧光标记探针。18S rDNA、ITS基因探针5’端标记FAM荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记TAMRA荧光素为荧光淬灭基团(用Q表示)；int基因设计的探针5’端标记JOE荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记BHQ1荧光素为荧光淬灭基团(用Q表示)Q基团能在近距离吸收R基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，探针先与模板结合，随后引物模板结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号；当反应进行到延伸阶段时，Taq DNA聚合酶5’→3’外切酶将探针降解，探针上的R基团游离出来，Q基团无法吸收R基团发出的的荧光信号，检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应的进行，PCR产物的增加与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线，实现目的基因的检测。
实施例三
本发明实施例提供了一种检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、18S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、ITS基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，检测18S rDNA基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测18S rDNA基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测ITS基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测ITS基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测int基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测int基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。
所述核酸抽提液由2％(MN)Chelex-100、1％(VN)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。
所述第一引物探针混合液由2μL 10×PCR Buffer、2μL 25mmol/LMgCl2、1.6μL2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L 1对目的基因引物、0.2μL 10μmol/L的1条目的基因探针、0.6μL 10μmol/L内标引物及0.2μL 10μmol/L内标探针和7.4μL灭菌纯化水组成；所述第二引物探针混合液由2μL 10×PCR Buffer、2μL 25mmol/LMgCl2、1.2μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L 1对目的基因引物、0.2μL 10μmol/L的1条目的基因探针、0.6μL 10μmol/L内标引物及0.2μL 10μmol/L内标探针和7.8μL灭菌纯化水组成
PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合组成。
PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，对于18S rDNA基因和ITS基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的JOE通道进行扩增。
所述阳性对照品为含有灭活的E-18S rDNA菌和E-ITS菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL，E-18S rDNA菌为含有18SrDNA基因片段的工程菌，E-ITS菌为含有ITS基因片段的工程菌。
本试剂盒具有准确率高，临床样本检测结果与DNA测序结果总符合率98％以上；特异性强，与痰液和肺泡灌洗液中常见致病菌大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、白喉杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带假丝酵母、新型隐球菌、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人痰液和肺泡灌洗液样本中侵袭性真菌特异性基因18S rDNA和烟曲霉特异性基因ITS。为临床确定侵袭性真菌和烟曲霉感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
实施例四
本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式，首先收集人痰液和咽拭子样本，采用发明实施例三中提供的试剂盒进行检测，统计结果符合率。
1、样本核酸制备
取内标加入到核酸抽提液中，加入比例为1∶50，后面实验步骤均使用加入内标的核酸抽提液。
(1)痰液：取痰液加入2倍体积的4％NaOH(自备)，摇匀，室温下放置30min液化，12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，12,000rpm 5min；去尽上清，沉淀中直接加入一管颗粒提取物(自备)和核酸抽提液60μL充分混匀，充分混匀，用振荡器高速震荡5min，98℃10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清4μL做PCR反应。
(2)肺泡灌洗液：取3～5mL样本，12,000rpm离心2min；弃去上清，沉淀中直接加入一管颗粒提取物(自备)和核酸抽提液60μL充分混匀，用振荡器高速震荡5min，98℃加热10min。12,000rpm离心5min，取上清4μL做PCR反应。
2、对照品准备
取阳性对照品、阴性对照品各50μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10s)，分别加入核酸抽提液50μL充分混匀，98℃10min，然后12,000rpm5min，取上清4μL做PCR反应。
3、酶试剂配制
取n×16μL侵袭性真菌18S核糖体(18S rDNA)基因PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×16μL烟曲霉特异性(ITS)基因PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。
4、加样
分别取上述混合液16μL置于PCR管中，然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。
5、PCR扩增
反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15sec，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为20μL。
荧光通道检测选择：18S rDNA、ITS基因选用FAM通道，内标基因选用JOE通道。
6、结果判定
检测结束后，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器FAM通道CT栏显示Undet.同时JOE通道CT值≤35，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道、JOE通道CT值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间，JOE通道CT值≤35，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
7、检测结果检验
本发明的检测结果与细菌培养鉴结果一致，荧光PCR检测结果如图1和图2所示，图1为侵袭性真菌感染样本的荧光定量PCR曲线图，可见随着PCR反应的进行，18S rDNA基因对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，可判断18S rDNA基因为阳性，ITS基因为阴性。图2为烟曲霉感染样本的荧光定量PCR曲线图，可判断18S rDNA基因和ITS基因均为阳性。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种检测烟曲霉特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测侵袭性真菌特异性基因18S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌特异性基因18S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。
2.根据权利要求1所述的检测烟曲霉特异性基因的引物和探针，其特征在于，18SrDNA、ITS基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA；int基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
3.一种检测烟曲霉特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对侵袭性真菌特异性基因18S rDNA、烟曲霉特异性基因ITS、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测侵袭性真菌特异性基因18S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测侵袭性真菌特异性基因18S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测烟曲霉特异性基因ITS的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测烟曲霉特异性基因ITS的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
取内标加入到核酸抽提液中，加入比例为1∶50，后面实验步骤均使用加入内标的核酸抽提液。
取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
将18S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；将ITS基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号，所述内标为含有内标int基因片段的工程菌；
对于18S rDNA基因和ITS基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的JOE通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
4.一种检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、18S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、ITS基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、int基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述内标为含有int基因片段的工程菌组成；
其中，检测18S rDNA基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测18S rDNA基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检 测ITS基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测ITS基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测int基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测int基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。
5.根据权利要求4所述的检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。
6.根据权利要求4所述的检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液由2μL 10×PCR Buffer、2μL 25mmol/LMgCl2、1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L 1对目的基因引物、0.2μL 10μmol/L的1条目的基因探针、0.6μL 10μmol/L内标引物及0.2μL 10μmol/L内标探针和7.4μL灭菌纯化水组成；所述第二引物探针混合液由2μL10×PCR Buffer、2μL25mmol/LMgCl2、1.2μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L 1对目的基因引物、0.2μL 10μmol/L的1条目的基因探针、0.6μL 10μmol/L内标引物及0.2μL 10μmol/L内标探针和7.8μL灭菌纯化水组成。
7.根据权利要求4所述的检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3∶1比例混合组成。
8.根据权利要求4所述的检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，对于18S rDNA基因和ITS基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的JOE通道进行扩增。
9.根据权利要求4所述的检测烟曲霉特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有灭活的E-18S rDNA菌和E-ITS菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL，E-18S rDNA菌为含有18S rDNA基因片段的工程菌，E-ITS菌为含有ITS基因片段的工程菌。
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