CN107841568A - 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107841568A CN107841568A CN201710819686.0A CN201710819686A CN107841568A CN 107841568 A CN107841568 A CN 107841568A CN 201710819686 A CN201710819686 A CN 201710819686A CN 107841568 A CN107841568 A CN 107841568A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mycobacterium tuberculosis
- probe
- pcr
- detection
- gyrb
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对(gyrB)、16S rDNA核酸保守区设计引物和荧光标记探针。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对临床样本中的结核分枝杆菌(MTB)及非结核分枝杆菌(NTM)进行快速、准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起人类肺结核的主要致病菌，全世界有三分之一人口感染MTB，是严重的公共卫生威胁之一。近年来，非结核分枝杆菌(Non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染呈现明显的上升趋势，NTM有超过160种，对人类致病的只有一小部分，主要引起慢性肺部感染，NTM肺部感染临床症状与MTB感染以及其它呼吸系统疾病如肺癌相似，难以区分，但用药有较大差异。常用的抗MTB药物有利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素等，NTM感染一般采用大环内酯类药物治疗，其它药物还有阿米卡星、利福霉素、乙胺丁醇等。因此，快速检测区分MTB与NTM具有临床意义。
目前临床上最常用的NTM鉴定方法仍以传统的分离培养为主，最常用的液体培养技术为Bactec 960方法，固体培养基有罗氏培养基和Middlebrook 7H10、7H11。这些培养法耗时长，操作繁琐，培养出后还需通过及一系列生理生化反应进一步鉴定。也有报道应用高效液相色谱、质谱法鉴定，但样本仍需要进行前期培养，且每次只能检测1个样本限制了其使用。分子生物学法通过对特异性靶基因的检测能够准确鉴定NTM，且临床样本只需简单处理提取核酸后即可用于检测。本研究采用Taqman探针荧光PCR法对MTB和NTM进行检测，不仅操作过程简单、检测时间短，能同时对多个样本进行检测，对临床初步鉴定NTM具有一定的意义。
发明内容
本发明提供一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中采用细菌培养鉴定结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)，不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物和探针，检测结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌特异性基因DAN旋转酶B亚单位(gyrB)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16S核糖体DAN基因(16S rDNA)的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。
一种检测结核分枝杆菌特异性基因的方法，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因及非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测结核分枝杆菌的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S rDAN的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
将gyrB基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将16S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取抽提后的DNA模板、阴性对照品和阳性对照品上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃ 2分钟，94℃2分钟，循环1次；93℃15秒，60℃30秒，循环35次，并在60℃采集荧光信号；
采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
一种检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，gyrB基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：2～3所示，gyrB基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：4所示，16S rDNA基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：6～7所示，16S rDNA基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：8所示，两个探针的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端合有淬灭基团MGB。
本发明的有益效果：本试剂盒具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率98％以上；特异性强，与痰液和肺泡灌洗液中常见致病菌鼠伤寒沙门氏菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、血链球菌、表皮葡萄球菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本发明可用于体外定性检测人痰液和肺泡灌洗液样本中结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位基因(gyrB)和非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)，为临床确定NTM感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例四的结核分枝杆菌(MTB)感染样本的荧光定量PCR曲线图；
图2为本发明实施例四的非结核分枝杆菌(NTM)感染样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物和探针，检测结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
其中，针对结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-gyrB-F：5’-GAGATGGCGTTCCTCAACAAG-3’
下游引物P-gyrB-R：5’-GACGTCGCTGACCACTTCGT-3’
针对结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-gyrB：5’-FAM-TGACCATCAACCTGACCGA-MGB-3’
针对非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-16S rDNA-F：5’-TAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAA-3’
下游引物P-16S rDNA-R：5’-TCACCCCACCAACAAGCTGATA-3’
针对非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-16S rDNA：5’-FAM-CTGGTGGAAAGCTTTT-MGB-3’
上述两种Taqman探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。
实施例二
本发明实施例中又提供了一种检测结核分枝杆菌特异性基因的方法，包括：
步骤101、样本核酸制备，以获得核酸模板；
步骤102、分别针对结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因及非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)设计特异性引物和荧光标记探针；
其中，检测结核分枝杆菌gyrB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌gyrB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16SrDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。
步骤103、配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
步骤104、取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤105、取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤106、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤107、将gyrB基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；将16S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；
其中，gyrB基因PCR检测混合液由1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L引物、0.1μL 10μmol/L探针、2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 25mmol/LMgCl2及11.35μL灭菌纯化水组成。16S rDNA基因PCR检测混合液由1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL 10μmol/L引物、0.1μL 10μmol/L探针、2μL 10×PCR Buffer、1.2μL25mmol/LMgCl2及11.75μL灭菌纯化水组成。
步骤108、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取抽提后的DNA模板、阴性对照品和阳性对照品上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃ 2分钟，94℃2分钟，循环1次；93℃ 15秒，60℃30秒，循环35次，并在60℃采集荧光信号；
步骤109、采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
其中，检测结果根据CT值进行判定，仪器CT栏显示Undet.(ABI StepOne，ABI 7500)表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品CT≤35，检测结果报告为阳性；待检样品CT显示在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。结果判断解释如表1所示。
表1可能出现的结果及解释
| 序号 | gyrB | 16S rDAN | 结果解释 |
| 1 | + | - | 结核分枝杆菌感染 |
| 2 | - | + | 非结核分枝杆菌感染 |
| 3 | - | - | 阴性 |
本发明的技术方法是采用Taqman探针实时荧光PCR法，在同源性比对结核分枝杆菌特异性基因gyrB、非结核分枝杆菌16S rDNA序列的基础上，选取保守片段分别设计针对这2个基因的特异性引物和特异性的荧光标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记MGB为荧光淬灭基团(用Q表示)，它在近距离内能吸收5’端荧光报告基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，探针先与模板上的目的基因结合，随后引物与目的基因结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号；当反应进行到延伸阶段时，Taq DNA聚合酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光信号没被Q基团吸收，检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应的进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线，实现目的基因的检测。
实施例三
本发明实施例还提供了一种检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；其中，gyrB基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：2～3所示，gyrB基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：4所示，16S rDNA基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：6～7所示，16SrDNA基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：8所示，两个探针的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端结合有淬灭基团MGB。
所述核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。
所述第一引物探针混合液和所述第二引物探针混合液分别由1.6μL 2.5mmol/LdN(U)TP、0.6μL 10μmol/L引物及0.1μL 10μmol/L探针组成。
所述第一引物探针混合液还包括2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 25mmol/L MgCl2及11.35μL灭菌纯化水。所述第二引物探针混合液中还包括2μL 10×PCR Buffer、1.2μL25mmol/L MgCl2及11.75μL灭菌纯化水。
PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合组成。
PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环35次；反应体系为20μL，选用FAM通道进行扩增。
所述阳性对照品为含有灭活的含有gyrB基因片段的工程菌E-gyrB、含有16S rDNA基因片段的工程菌E-16S rDNA的菌溶液，菌浓度为105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度为105CFU/mL。
本试剂盒具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率98％以上；特异性强，与痰液和肺泡灌洗液中常见致病菌鼠伤寒沙门氏菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、血链球菌、表皮葡萄球菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本发明可用于体外定性检测人痰液和肺泡灌洗液样本中结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位基因(gyrB)和非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)，为临床确定NTM感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
实施例四
实际应用过程中，首先收集临床样本，经细菌培养鉴定法确定为结核分枝杆菌感染、NTM感染各3例，采用本试剂盒进行检测，统计结果符合率。
1、样本核酸制备
痰液：取痰液加入2倍体积的4％NaOH，摇匀，室温下放置直至液化，取足量液化后的样本12,000rpm离心5min，弃上清；沉淀加1mL无菌生理盐水打匀洗涤，12,000rpm离心5min，弃上清；沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，98℃加热10min(误差不超过1min)。12,000rpm离心5min，取上清2μL用于荧光PCR检测。
肺泡灌洗液：取1～3mL样本，12,000rpm离心2min；弃去上清，沉淀中直接加入核酸抽提液50μL，充分混匀，98℃加热10min(误差不超过1min)。12,000rpm离心5min，取上清2μL做PCR反应。
2、对照品准备
取阳性对照品、阴性对照品各50μL置于1.5mL离心管中(冻存试剂融解后震荡混匀10s)，分别加入核酸抽提液50μL充分混匀，98℃加热10min(误差不超过1min)。12,000rpm离心5min，取上清2μL用于荧光PCR检测。
3、酶试剂配制
取n×18μL结核分枝杆菌DNA旋转酶B亚单位基因(gyrB)PCR检测混合液PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×18μL非结核分枝杆菌16S核糖体DNA(16S rDNA)PCR检测混合液PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。
4、加样
分别取上述混合液18μL置于PCR管中，然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各2μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。
5、PCR扩增
反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环35次；单点荧光检测在60℃，反应体系为20μL，荧光通道检测选择：选用FAM通道。
6、结果判定
检测结束后，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器CT栏显示Undet(ABI StepOne，ABI 7500)表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品CT≤35，检测结果报告为阳性；待检样品CT显示在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
7、检测结果检验
本发明的检测结果与细菌培养鉴定结果一致，荧光PCR检测结果如图1和图2所示，图1为结核分枝杆菌感染样本的荧光PCR曲线图，可见随着PCR反应的进行，gyrB对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，可判断gyrB为阳性；图2为非结核分枝杆菌NTM感染样本的荧光PCR曲线图，可见荧光PCR扩增曲线呈典型的“S型”，可判断16S rDNA为阳性。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位((gyrB))基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位((gyrB))基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。
2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，两种Taqman探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。
3.一种检测结核分枝杆菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因及非结核分枝杆菌16S核糖体DNA基因(16S rDNA)设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测结核分枝杆菌gyrB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测结核分枝杆菌gyrB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测非结核分枝杆菌16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测非结核分枝杆菌16S rDNA的Taqman探针核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
取痰液样本，加入2倍体积的4％NaOH摇匀，室温放置直至液化，取液化后的样本离心收集沉淀，加入无菌生理盐水洗涤一次后离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取肺泡灌洗液样本离心收集沉淀，加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
将gyrB基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；将16S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取抽提后的DNA模板、阴性对照品和阳性对照品上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃ 2分钟，94℃ 2分钟，循环1次；93℃ 15秒，60℃30秒，循环35次，并在60℃采集荧光信号；
采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
4.一种检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、结核分枝杆菌特异性基因DNA旋转酶B亚单位(gyrB)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、非结核分枝杆菌16S核糖体DAN基因(16S rDNA)的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，gyrB基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：2～3所示，gyrB基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：4所示，16S rDNA基因特异性的上游和下游引物的序列如SEQIDNO：6～7所示，16S rDNA基因的Taqman探针序列如SEQIDNO：8所示，两个探针的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端合有淬灭基团MGB。
5.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。
6.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液和所述第二引物探针混合液分别由1.6μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6μL10μmol/L引物及0.1μL 10μmol/L探针组成。
7.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液还包括2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 25mmol/L MgCl2及11.35μL灭菌纯化水。所述第二引物探针混合液中还包括2μL 10×PCR Buffer、1.2μL 25mmol/L MgCl2及11.75μL灭菌纯化水。
8.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合组成。
9.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环35次；反应体系为20μL，选用FAM通道进行扩增。
10.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有灭活的含有gyrB基因片段的工程菌E-gyrB、含有16S rDNA基因片段的工程菌E-16S rDNA的菌溶液，菌浓度为105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度为105CFU/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710819686.0A CN107841568A (zh) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710819686.0A CN107841568A (zh) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107841568A true CN107841568A (zh) | 2018-03-27 |
Family
ID=61683299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710819686.0A Pending CN107841568A (zh) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107841568A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108959850A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-12-07 | 奥然生物科技（上海）有限公司 | 一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法 |
| CN109468316A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-15 | 上海市肺科医院 | 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用 |
| CN110628927A (zh) * | 2019-11-13 | 2019-12-31 | 上海市食品药品检验所 | 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法 |
| CN110964842A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-07 | 广州金域医学检验集团股份有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法 |
| CN113444782A (zh) * | 2020-03-26 | 2021-09-28 | 台达电子工业股份有限公司 | 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒 |
| CN114134241A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-04 | 山东博弘基因科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103038346A (zh) * | 2010-05-27 | 2013-04-10 | 蔚山大学校产学协力团 | 使用双重聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法 |
| CN106222248A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
-
2017
- 2017-09-13 CN CN201710819686.0A patent/CN107841568A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103038346A (zh) * | 2010-05-27 | 2013-04-10 | 蔚山大学校产学协力团 | 使用双重聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法 |
| CN106222248A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TOM A. MENDUM ET AL.: "The PCR amplification of non-tuberculous mycobacterial 16S rRNA sequences from soil", 《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》 * |
| 毛欣茹: "建立基于gyrB基因检测结核分枝杆菌复合物的荧光定量PCR法", 《临床检验杂志》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108959850A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-12-07 | 奥然生物科技（上海）有限公司 | 一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法 |
| CN108959850B (zh) * | 2018-07-19 | 2020-07-17 | 奥然生物科技（上海）有限公司 | 一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法 |
| CN109468316A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-15 | 上海市肺科医院 | 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用 |
| CN109468316B (zh) * | 2018-12-10 | 2020-06-05 | 上海市肺科医院 | 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用 |
| CN110628927A (zh) * | 2019-11-13 | 2019-12-31 | 上海市食品药品检验所 | 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法 |
| CN110628927B (zh) * | 2019-11-13 | 2024-01-30 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法 |
| CN110964842A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-07 | 广州金域医学检验集团股份有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法 |
| CN113444782A (zh) * | 2020-03-26 | 2021-09-28 | 台达电子工业股份有限公司 | 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒 |
| CN114134241A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-04 | 山东博弘基因科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107841568A (zh) | 一种检测结核分枝杆菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN106222248A (zh) | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN101680027A (zh) | 检测hiv耐药变异体的系统和方法 | |
| CN106755560A (zh) | 一种多重荧光pcr法检测高血压用药基因多态性的试剂盒 | |
| CN109735639A (zh) | 一种用于检测肺炎克雷伯菌及三种主要碳青霉烯酶基因的引物和探针组合物及试剂盒 | |
| CN101880711A (zh) | 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法 | |
| CN108384867A (zh) | 一种实时荧光pcr检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN101469327B (zh) | 对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用 | |
| CN106191239A (zh) | 一种实时荧光pcr检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN104059975B (zh) | 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用 | |
| CN108588246A (zh) | 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN110669851A (zh) | 检测引发血流感染的球菌的引物和/或探针组合物及其应用 | |
| CN102010910A (zh) | 基于环介导等温扩增技术的疟原虫属和种的核酸筛查方法 | |
| WO2014157176A1 (ja) | アシネトバクター属菌の遺伝型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット | |
| CN102888455B (zh) | 环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒及其引物 | |
| US10669591B2 (en) | Selective detection of Haemophilus influenzae | |
| CN102229989A (zh) | 一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒 | |
| CN105603084B (zh) | 检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法 | |
| CN105950773A (zh) | 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
| CN113403420A (zh) | 一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用 | |
| CN105755134A (zh) | 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用 | |
| CN101864491A (zh) | 痰样本细菌快速鉴定的试剂盒及其检测方法 | |
| CN107227372A (zh) | Aldh2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 | |
| CN110093434A (zh) | 一种引物和探针组合物及试剂盒 | |
| CN101235413A (zh) | 一种检测志贺氏菌及其ipaH毒力岛的方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: He Xiao Document name: Notice of first office action |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 3 / F, building 16, Chuang e Huigu, 777 Zhongguan Road, Zhuangshi street, Zhenhai District, Ningbo City, Zhejiang Province, 315201 Applicant after: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) Co.,Ltd. Address before: 802, Kechuang building, 777 Zhongguan Road, Zhuangshi street, Zhenhai District, Ningbo City, Zhejiang Province, 315201 Applicant before: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) Co.,Ltd. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180327 |