CN108959850A - 一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其包括首先截取各PCR曲线扩增段的曲线特征，然后通过对其自身求卷积来放大它们之间的差异，以纵坐标最小的曲线为基准进行归一化，且通过最小二乘法计算各曲线的平均斜率。然后选定平均斜率最大的曲线作为阴性对照曲线，以0值曲线作为阳性对照曲线，对于其它各条曲线而言，则分别计算该条曲线与阴性对照曲线以及阳性对照曲线之间的差异，并由此得到该条曲线的阴性概率和阳性概率。如果阳性概率大于阴性概率，则判定该曲线为阳性。本申请的有益效果在于阴性模型和阳性模型均无需外部输入，仅仅识别阴性曲线的扩增期，并截取其它曲线在同一时期的曲线即可，可实现自动化判定结核分枝杆菌基因突变。

Description

一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体来说，涉及一种自动化判定结核分枝杆菌基因 突变的方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗 性疾病，其发病率高，危害性极大，是全世界感染性疾病中的第二大杀手。WHO已 将结核病作为重点控制的传热疾病之一，并与1995年起将每年的3月24日定为“世 界防治结核病日”，以提醒公众关注结核病。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术发明至今取得了 不断发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

近年来，由于抗生素类药物的滥用和不合理的治疗方案，导致结核分枝杆菌 基因发生突变。目前关于结核分枝杆菌基因突变通常采用样本对比的方法进行检 测，在检测过程中，如何判断结核分枝杆菌基因是否发生突变一直是困扰结核病诊 断自动化的一个难题。判定结核分枝杆菌基因是否发生突变时需要医生或者检验人 员有一定的经验，自动化设备很难进行正确判定。

具体来说，参考图1，在采用样本对比法检测结核分枝杆菌基因突变过程中， 通常会得到包括至少3条曲线的检测样品的PCR图谱，其中荧光幅值最高的曲线， 通常可直接判定为阴性。阳性的判定方法是与阴性曲线对比，人为经验上判断其为 阳性的概率。一般来说，存在一条阳性曲线即可判定检测样品存在结核分枝杆菌基 因突变。但是，样本对比方法必须依赖有经验的医生或者检测人员来进行判断，不 能实现自动化判断。

为此，本领域迫切需要开发一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法。

发明内容

本申请之目的在于提供一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，从而 解决上述现有技术中的技术问题。具体来说，本申请的自动化判定结核分枝杆菌基 因突变的方法首先截取各PCR曲线扩增段的曲线特征，然后通过对其自身求卷积 来放大它们之间的差异，以纵坐标最小的曲线为基准进行归一化，且通过最小二乘 法计算各曲线的平均斜率。然后选定平均斜率最大的曲线作为阴性对照曲线，以0 值曲线作为阳性对照曲线，对于其它各条曲线而言，则分别计算该条曲线与阴性对 照曲线以及阳性对照曲线之间的差异，并由此得到该条曲线的阴性概率和阳性概 率。如果该条曲线的阴性概率大于阳性概率，则判定该条曲线为阴性；如果该条曲 线的阳性概率大于阴性，则判定该条曲线为阳性。只要有任何一条曲线显示为阳性， 则判定检测样品发生了结核分枝杆菌基因突变。所有这些数据处理过程可通过计算 机来进行，从而可以实现自动化判定结核分枝杆菌基因是否发生突变。

为了实现上述目的，本申请提供下述技术方案。

在第一方面中，本申请提供一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法， 所述方法可包括下述步骤：

S1：截取至少3条结核分枝杆菌核酸荧光PCR曲线扩增段的曲线特征，得到 至少3条扩增段曲线；

S2：放大所述至少3条扩增段曲线的曲线特征，得到至少3条放大的扩增段 曲线；

S3：以纵坐标值最小的曲线作为基准，对所述至少3条放大的扩增段曲线进 行归一化，并分别计算每条放大的扩增段曲线的平均斜率；

S4：以所述至少3条放大的扩增段曲线中平均斜率最大的曲线作为阴性对照 曲线，以0值曲线作为阳性对照曲线，分别计算其它各条曲线与阴性对照线的差异 Dneg以及分别计算其它各条曲线与阳性对照线的差异Dpos，以及基于上述差异来 分别计算各条曲线的阴性概率Rneg和阳性概率Rpos；以及

S5：自动判断检测样品是否发生结核分枝杆菌基因突变，如果所有曲线的阴 性概率Rneg大于阳性概率Rpos，则表明该检测样品没有发生结核分枝杆菌基因突 变；如果有任一曲线的阴性概率Rneg小于阳性概率Rpos，则表明该检测样品发生 结核分枝杆菌基因突变；

其中在步骤S3中，对于除了阴性对照曲线以外的每一条曲线，通过下述公式(100)来计算其阴性概率Rneg；和/或，通过下述公式(200)来计算其阳性概率 Rpos：

以及

在第一方面的一种实施方式中，在步骤S2中，放大所述至少3条扩增段曲线 的曲线特征包括将各曲线以离散函数方式表达，然后求该函数自身的卷积，其中所 述函数通过公式(1)表示，且卷积通过公式(2)表示：

f(n)＝y(n)*y(n) 公式(2)，

其中，y表示曲线各点值的纵坐标，x表示曲线各点值的横坐标，a₁……a_n表 示横坐标为1……n时所对应的具体纵坐标值，n为1到各曲线点值总数之间的正 整数，f表示卷积。

在第一方面的一种实施方式中，在步骤S3中，通过最小二乘法来计算每条放 大的扩增段曲线的平均斜率，其计算过程如公式(3)所示：

其中a表示曲线的平均斜率，N表示各曲线的点值总数，X_i和Y_i表示各点值的 横坐标值和纵坐标值，i为1到N之间的正整数，n为1到N之间的正整数。

在第一方面的一种实施方式中，在步骤S4中，通过下述公式(4)来计算其 它各条曲线与阴性对照线的差异Dneg，和/或通过公式(5)来计算其它各条曲线 与阳性对照线的差异Dpos：

其中，i为1到各曲线点值总数之间的正整数，f(i)表示待判断的曲线，N(i) 为选为阴性的参考曲线，P(i)为阳性参考曲线。

在第一方面的一种实施方式中，在步骤S4中，通过公式(5)来计算其它各 条曲线与阳性对照线的差异Dpos：

在第一方面的一种实施方式中，在步骤S4中，通过下述公式(7)来计算其 阴性概率Rneg；和/或，通过下述公式(8)来计算其阳性概率Rpos：

在第一方面的一种实施方式中，所述结核分枝杆菌核酸提取自结核病患者的 体液。在一种具体实施方式中，所述体液包括结核病患者的痰液等。

在第一方面的一种实施方式中，待检测样品的PCR曲线通过下述来获得：设 计一对或多对引物，以及对应目标突变碱基的探针，对目标基因进行荧光PCR扩增 及检测。

与现有技术相比，本申请的有益效果在于通过截取PCR曲线扩增段的曲线特 征并进行分析，阴性模型和阳性模型均无需外部输入；不需要识别每条曲线的第二 段扩增期，仅仅识别阴性曲线的扩增期，并截取其它曲线在同一时期的曲线即可； 可实现自动化判定结核分枝杆菌基因突变。

附图说明

图1示意性显示根据现有技术的待检测样品的PCR图谱。

图2示意性显示根据本申请的一个实施例的原始数据曲线。

图3示意性显示根据本申请的一个实施例的特征段曲线。

图4示意性显示根据本申请的一个实施例的对自身求卷积后的曲线。

图5示意性显示根据本申请的另一个实施例的归一化后的曲线。

具体实施方式

下面将结合附图以及本申请的实施例，对本申请的技术方案进行清楚和完整 的描述。

在一种具体实施方式中，本申请提供了一种可自动化判定结核分枝杆菌基因 突变的方法。该方法包括首先截取有用的扩增段信息，进行分析。然后，对曲线进 行卷积，放大特征差异。接下来，该方法包括对放大特征差异地曲线进行归一化， 利于计算。

在一种具体实施方式中，本文所述的方法还包括建立阴性和阳性的模型。该 阴性模型来自曲线斜率最高的曲线的序列，无需外部输入。该阳性模型通过0值曲 线作为阳性模型曲线序列，也无需外部输入。

在一种具体实施方式中，本文所述的方法采用一种新型的概率算法，计算除 阴性曲线外所有曲线和阴性模型与阳性模型对比，其为阴性的概率和为阳性的概 率。在一种具体实施方式中，通过曲线的阴性概率和阳性概率来判定其为阴性或者 阳性。如果该曲线的阴性概率大于阳性概率，则该曲线为阴性；如果该曲线的阳性 概率大于阴性概率，则该曲线为阳性。在一种具体实施方式中，只要有任意一条曲 线为阳性，则判断待检测样品存在结核分枝杆菌基因突变。

在一种优选的实施方式中，本文所述的方法包括下述步骤：

第一步：曲线特征提取。

待检测样品的PCR曲线一般分为3段，第一段为基线期，为一条接近0值的 直线；第二段为扩增期，一般为一段滚升的曲线，其中前半段近似为指数曲线；第 三段为平台期，为一条略微上扬的直线。第三段可能由于浓度原因，在有限的反应 次数内体现不出来。

本文所述方法所涉及的曲线大部分信息特征都在第二段内，所以特征提取主 要包括对第二段曲线进行特征提取。

在本文所述的方法中，并不需要识别每条曲线的第二段扩增期，仅仅识别阴 性曲线的扩增期，并截取其它曲线在同一时期的曲线即可。

第二步：特征放大。

从图1中可以观察到，扩增期阴性和阳性的判定，在人为判定过程中，根据 经验可能会判定得比较准确。但在计算机系统看来，其特征差异可能并不明显。所 以本文所述方法的下一步需要放大该特征。

经验性地识别阴阳性包括判断曲线在各个扩增阶段的荧光幅值是否符合预期 的指数曲线。通常正常扩增曲线应该非常接近、甚至重合的。但有阳性样本的曲线， 在扩增之初就呈现了荧光量不足的特征，在后续的反应中，其荧光量和同期的阴性 相比会进一步拉开。根据这样的物理特性，使用对该曲线进行求自身的卷积，会放 大该荧光量不足的特性，从而拉开阴阳性特征区别。

该过程数学计算过程如下：

首先是抽象该曲线为函数，由于曲线本身并不是由函数计算得来，扩增期的 点数也不多，所以通常以多项式来表达：

f(n)＝y(n)*y(n) 公式(2)。

在上述公式(1)和公式(2)中，y表示曲线各点值的纵坐标，x表示曲线各 点值的横坐标，a₁……a_n表示横坐标为1……n时所对应的具体纵坐标值，n为1到 各曲线点值总数之间的正整数，f表示卷积。

第三步：归一化与斜率计算。

在对各曲线求自身卷积之后，阴性曲线与阳性曲线的特征变得非常明显。最 明显的特征便是各曲线之间的纵坐标差值。由于Y值较大，最后体现出来的曲线相 对集中，所以对Y值按最小曲线进行归一化后得到的是斜率差别巨大的几条线。可 以通过最小二乘法计算每条曲线的平均斜率。

斜率计算公式如下：

其中a表示曲线的平均斜率，N表示各曲线的点值总数，X_i和Y_i表示各点值的 横坐标值和纵坐标值，i为1到N之间的正整数，n为1到N之间的正整数。

第四步：建立阴阳参考曲线。

选择斜率最大曲线，作为阴性对照曲线。选择0值曲线作为阳性对照，其中0 值曲线指各个点位都是0的曲线。

第五步：计算其它曲线的阴阳概率。

分别把其它曲线与阴性对照曲线与阳性对照曲线做差异分析，得出该曲线的 阴阳概率。其它曲线与阴性对照曲线之间的差异Dneg以及其它曲线与阳性对照曲 线之间的差异Dpos的计算方法如下：

其中，i为1到各曲线点值总数之间的正整数，f(i)表示待判断的曲线，N(i) 为选为阴性的参考曲线，P(i)为阳性参考曲线。

按照第三步中所述，令P(i)＝0的话，可得：

接下来，可通过公式(100)来计算曲线的阴性概率Rneg，以及可通过公式(200) 来计算曲线阳性概率Rpos：

把公式(4)和公式(6)分别代入上述公式(100)和公式(200)可得下述 公式(7)和公式(8)：

然后比较同一曲线的阴性概率Rneg和阳性概率Rpos，如果阴性概率Rneg大 于阳性概率Rpos，则判定该曲线为阴性；如果阴性概率Rneg小于阳性概率Rpos， 则判定该曲线为阳性。

实施例1

获取临床结核分枝杆菌基因突变患者的痰液作为检测样品，提取核酸，利用 《高灵敏度结核及利福平耐药核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)》进行扩增复制 DNA。

《高灵敏度结核及利福平耐药核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)》试剂的原 料、配方和上机条件如下：

1、引物探针：

1.1来源：Dual-Probe Assay for Rapid Detection of Drug-ResistantMycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Nov.2004,p.5277–5285。

1.2引物序列

Primer F	ACACCGCAGACGTTGATCA
		Primer R	GCTCCAGCCCGGCACGCTCACG
rpoB1	HEX-CCATGAATTGGCTCAGC-MGB
		rpoB2	CY5.5-TTCATGGACCAGAACAA-MGB
rpoB3	ROX-TCAACCCCGACAGC-MGB
		rpoB4	CY5-TGACCCACAAGCGC-MGB
rpoB5	FAM-CAGCGCCGACAGT-MGB

1.3基因序列和突变位点

1.3.1RpoB基因序列(参见SEQ ID NO:1)

ACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGT

1.3.2突变位点

rpoB Q513L(CAA/CTA)

rpoB D516V(GAC/GTC)

rpoB D516Y(GAC/TAC)

rpoB S522L(TCG/TTG)

rpoB H526Y(CAC/TAC)

rpoB H526D(CAC/GAC)

rpoB H526R(CAC/CGC)

rpoB H526L(CAC/CTC)

rpoB H526N(CAC/AAC)

rpoB S531L(TCG/TTG)

rpoB S531W(TCG/TGG)

rpoB L533P(CTG/CCG)

2、试剂配方

2.1来源：菲鹏生物股份有限公司生产的Hotstart HiTaq DNA Polymerase

试剂组分：Hotstart HiTaq DNA Polymerase 5U/ul

5*HS HiTaq buffer

Solution I(10X)

2.2试剂配方

3、使用仪器：Bio-Rad CFX96

4、上机条件:

得到的原始数据并如图2以及下文表1所示。

表1.实施例1的原始数据

接下来，截取曲线1、曲线2和曲线3的扩增段的曲线特征，得到如表2和图 3所示数据。

表2.各曲线的特征段数据

根据公式(2)，对各曲线求自身卷积，得到如表3和图4所示数据。

表3.各曲线对自身求卷积后的数据

接下来，进行归一化。因为曲线2的Y值最小，将曲线2作为1，对曲线1 和曲线3进行归一化，得到如下文表4和图5所示的数据。

表4.各曲线归一化后的数据

然后，根据公式(3)可求得最大斜率的是曲线1，曲线1应作为阴性参考。 同时0值曲线作为阳性参考。

其计算过程如下：

曲线1的斜率计算如下：

a₁＝(3757.7-2303.8)/(7800-6084)＝0.84726

根据同样的方法，可求得曲线2和曲线3的斜率分别为：

a₂＝0.07625

a₃＝0.21182

由此可知，曲线1斜率最大。

根据公式(7)和公式(8)求曲线2与曲线3的阴阳概率如下文表5所示：

表5曲线的阴性概率和阳性概率

	曲线2	曲线3
			阴性概率	9.00％	25.00％
阳性概率	91.00％	75.00％

对于曲线2和曲线3而言，其阴性概率均小于阳性概率，故曲线2和曲线3 均应该为阳性。该结果和经验判定完全一致，最后结论为该肺结核分枝杆菌基因存 在突变。

上述对实施例的描述是为了便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本 申请。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在 此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必付出创造性的劳动。因此，本申请不 限于这里的实施例，本领域技术人员根据本申请披露的内容，在不脱离本申请范围 和精神的情况下做出的改进和修改都本申请的范围之内。

Claims (8)

1.一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，所述方法包括下述步骤：

S1：截取至少3条结核分枝杆菌核酸荧光PCR曲线扩增段的曲线特征，得到至少3条扩增段曲线；

S2：放大所述至少3条扩增段曲线的曲线特征，得到至少3条放大的扩增段曲线；

S3：以纵坐标值最小的曲线作为基准，对所述至少3条放大的扩增段曲线进行归一化，并分别计算每条放大的扩增段曲线的平均斜率；

S4：以所述至少3条放大的扩增段曲线中平均斜率最大的曲线作为阴性对照曲线，以0值曲线作为阳性对照曲线，分别计算其它各条曲线与阴性对照线的差异Dneg以及分别计算其它各条曲线与阳性对照线的差异Dpos，以及基于上述差异来分别计算各条曲线的阴性概率Rneg和阳性概率Rpos；以及

S5：自动判断检测样品是否发生结核分枝杆菌基因突变，如果所有曲线的阴性概率Rneg大于阳性概率Rpos，则表明该检测样品没有发生结核分枝杆菌基因突变；如果有任一曲线的阴性概率Rneg小于阳性概率Rpos，则表明该检测样品发生结核分枝杆菌基因突变；

其中在步骤S3中，对于除了阴性对照曲线以外的每一条曲线，通过下述公式(100)来计算其阴性概率Rneg；和/或，通过下述公式(200)来计算其阳性概率Rpos：

以及

2.如权利要求1所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，在步骤S2中，放大所述至少3条扩增段曲线的曲线特征包括将各曲线以离散函数方式表达，然后求该函数自身的卷积，其中所述函数通过公式(1)表示，且卷积通过公式(2)表示：

f(n)＝y(n)*y(n) 公式(2)，

其中，y表示曲线各点值的纵坐标，x表示曲线各点值的横坐标，a₁……a_n表示横坐标为1……n时所对应的具体纵坐标值，n为1到各曲线点值总数之间的正整数，f表示卷积。

3.如权利要求1所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，在步骤S3中，通过最小二乘法来计算每条放大的扩增段曲线的平均斜率，其计算过程如公式(3)所示：

其中a表示曲线的平均斜率，N表示各曲线的点值总数，X_i和Y_i表示各点值的横坐标值和纵坐标值，i为1到N之间的正整数，n为1到N之间的正整数。

4.如权利要求2所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，在步骤S4中，通过下述公式(4)来计算其它各条曲线与阴性对照线的差异Dneg，和/或通过公式(5)来计算其它各条曲线与阳性对照线的差异Dpos：

其中，i为1到各曲线点值总数之间的正整数，f(i)表示待判断的曲线，N(i)为选为阴性的参考曲线，P(i)为阳性参考曲线。

5.如权利要求4所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，在步骤S4中，通过公式(5)来计算其它各条曲线与阳性对照线的差异Dpos：

6.如权利要求5所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，在步骤S4中，通过下述公式(7)来计算其阴性概率Rneg；和/或，通过下述公式(8)来计算其阳性概率Rpos：

7.如权利要求1-6中任一项所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌核酸提取自结核病患者的体液。

8.如权利要求1-6中任一项所述的自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法，其特征在于，待检测样品的PCR曲线通过下述来获得：设计一对或多对引物，以及对应目标突变碱基的探针，对目标基因进行荧光PCR扩增及检测。