CN108588194A - 利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法及装置。该方法包括：待测样本预处理并提取DNA；根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；通过高通量的方法进行测序，得序列信息；过滤掉低质量的序列，利用检出流程进行检测，检出流程包括：利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。应用本发明的技术方案，检测的精度更高，效果更好。

Description

利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法及装置
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法及装置。
背景技术
在肿瘤样本中，常常由于各种体细胞突变导致肿瘤的发生发展，因此，评估变异数量十分重要，即评估每兆碱基中发生单核苷酸突变和插入/缺失突变的总数。
肿瘤突变负荷的评估通常是从肿瘤样本中提取DNA，捕获人类全外显子组，进行高通量测序，通过计算体细胞突变中，每兆碱基中发生单核苷酸突变和插入/缺失突变的总数确定肿瘤突变负荷状态。
目前常用的肿瘤突变负荷检测方法是Lawrence团队2015年在Nature上提出的策略，通过计算全外显子组(平均深度<200X)的体细胞突变数目来判断肿瘤突变负荷状态。然而，这种方法由于测序深度较低常常会遗漏部分重要的体细胞突变，并且在计算时未去除驱动基因突变及同义突变。以上判定方法常常导致假阳性和假阴性情况发生。
发明内容
本发明旨在提供一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法及装置，以提高肿瘤突变负荷评估的准确性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法。该方法包括以下步骤：S1，待测样本预处理并提取DNA；S2，根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；S3，通过高通量的方法进行测序，得序列信息；S4，过滤掉低质量的序列，利用检出流程进行检测，检出流程包括：S41，利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；S42，对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
进一步地，S41中采用的比对软件为BWA-mem比对软件。
进一步地，S41中采用samtools软件建立index。
进一步地，S42中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测。
进一步地，S42中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
进一步地，驱动基因包括：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
根据本发明的另一方面，提供了一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的装置。该装置包括：DNA提取单元，用于待测样本预处理并提取DNA；目标区域捕获单元，用于根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；高通量测序单元，用于通过高通量的方法进行测序，得序列信息；检出单元，用于过滤掉低质量的序列，利用检出流程模块进行检测，检出流程模块包括：比对子模块，用于利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；突变负荷确定子模块，用于对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
进一步地，比对子模块中采用的比对软件为BWA-mem比对软件。
进一步地，比对子模块中采用samtools软件建立index。
进一步地，突变负荷确定子模块中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测。
进一步地，突变负荷确定子模块中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
进一步地，驱动基因包括：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
应用本发明的技术方案，结合了目标区域捕获技术、高通量测序技术，提供了一套高特异性、高灵敏性的流程，能够从DNA中检测肿瘤突变负荷。与使用全外显子组进行检测的方法相比，本方法检测的测序深度更高，可以得到肿瘤样本中的低频突变。除此之外，检测流程可以很好地利用病理样本和对照样本的测序数据，辅之本发明的过滤流程，使得检测的精度更高，效果更好。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明一典型实施方式的确定肿瘤突变负荷的流程示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法，从DNA水平通过高通量测序技术确定肿瘤突变负荷的状态，解决基于目标区域捕获的二代测序数据检测肿瘤突变负荷的问题。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法。该方法包括以下步骤：S1，待测样本预处理并提取DNA；S2，根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；S3，通过高通量的方法进行测序，得序列信息；S4，过滤掉低质量的序列，利用检出流程进行检测，检出流程包括：S41，利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index(索引)；S42，对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
在本发明中，“过滤掉低质量的序列”中的“低质量”可以根据本领域通常认同的规则进行限定，例如比对质量MAPQ<30的序列。S42中的“变异检测”也是指本领域的常规检测，例如主要包括对单核苷酸变异及小片段插入及缺失变异的检测，最小支持读段数为4条，最小深度为400X；S42中的“同义突变进行过滤”亦为本领域的常规含义，即对目标区域进行注释，去除其中注释成同义变异的位点。
应用本发明的技术方案，结合了目标区域捕获技术、高通量测序技术，提供了一套高特异性、高灵敏性的流程，能够从DNA中检测肿瘤突变负荷。与使用全外显子组进行检测的方法相比，本方法检测的测序深度更高，可以得到肿瘤样本中的低频突变。除此之外，检测流程可以很好地利用病理样本和对照样本的测序数据，辅之本发明的过滤流程，使得检测的精度更高，效果更好。
根据本发明一种典型的实施方式，S41中采用的比对软件为BWA-mem比对软件，采用samtools软件建立index。
根据本发明一种典型的实施方式，S42中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测。优选的，S42中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
TMB(肿瘤突变负荷，Tumor Mutational Burden)高的患者与TMB低的患者，通常有经典的驱动基因突变。为了去除驱动基因对TMB数值的影响，所以需要予以去除。优选的，驱动基因为如下的10个驱动基因：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的装置。该装置包括：用于待测样本预处理并提取DNA的DNA提取单元；用于根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因的目标区域捕获单元；用于通过高通量的方法进行测序，得序列信息的高通量测序单元；以及检出单元，检出单元用于过滤掉低质量的序列，利用检出流程模块进行检测，检出流程模块包括：比对子模块，用于利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；突变负荷确定子模块，用于对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
应用本发明的技术方案，结合了目标区域捕获技术、高通量测序技术，提供了一套高特异性、高灵敏性的流程，能够从DNA中检测肿瘤突变负荷。与使用全外显子组进行检测的方法相比，本方法检测的测序深度更高，可以得到肿瘤样本中的低频突变。除此之外，检测流程可以很好地利用病理样本和对照样本的测序数据，辅之本发明的过滤流程，使得检测的精度更高，效果更好。
根据本发明一种典型的实施方式，比对子模块中采用的比对软件为BWA-mem比对软件，采用samtools软件建立index。
根据本发明一种典型的实施方式，突变负荷确定子模块中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测，突变负荷确定子模块中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
TMB高的患者与TMB低的患者，通常有经典的驱动基因突变。为了去除驱动基因对TMB数值的影响，所以需要予以去除。优选的，目标基因为如下的10个驱动基因：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
根据本发明一种典型的实施方式，如图1所示，主要包括数据检测程序外完成和检测程序内完成两部分，其中检测程序外完成部分主要包括：用于检测肿瘤突变负荷的主要步骤如下：1)样本预处理并提取DNA；2)目标区域捕获原理使用特定序列的探针捕获肿瘤相关基因；3)通过高通量的方法进行测序，得到相应的序列信息；4)过滤掉低质量的序列，利用本发明的检出流程进行检测。其中，数据处理部分如图1所示，主要包括数据检测程序外完成和检测程序内完成两部分，其中检测程序外完成部分主要包括数据处理，利用BWA-mem比对软件将高通量测序序列比对到人类参考基因组上，未比对上的序列形成软截断。然后根据比对的位置进行排序，并用samtools软件建立index，相当于建立比对文件；检测程序内完成部分包括将肿瘤样本比对后序列及对照样本比对后序列分别使用VarScan软件进行变异检测，计算体细胞突变中体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量，对以上突变中的驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。其中，驱动基因优选包括10个驱动基因为EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。本发明中没有详细描述的步骤或试剂可以通过本领域的常规技术手段或常规商购试剂实现。
实施例1
在本实施例的第一部分中，待检的样本是已知高肿瘤突变负荷的肺癌病理样本(肺癌FFPE手术组织石蜡卷片作为组织样本)及相应的对照样本(提取的白细胞作为对照样本)。
在实施例中，主要试剂用品是市售的，信息如下表1：
表1
试验步骤如下：
1.提取样本DNA(采用商用试剂盒，KAPA Express Extract)，利用荧光定量计(Qubit)进行定量，其浓度为3.8ng/ul，体积为130ul；利用超声破碎仪(Covaris)对样品DNA进行片段化，使DNA片段大小在200～400bp之间，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合要求。
2.先将片段化的样品DNA进行磁珠纯化，然后进行末端修复和3’端腺苷化，体系配置见下面表2，基本步骤如下：先在20℃温浴30min，其次在65℃温浴30min结束反应。
表2
末端修复和3’端腺苷化缓冲液 7μl
末端修复和3’端腺苷化酶混合液 3μl
DNA 50ul(500ng)
3.将上述修复后的DNA进行接头连接(商用试剂盒。NEXTflex DNA Barcodes-24)，接头连接体系详见下表3，在20℃温浴15min。
表3
试剂 体积
带标签的接头 2.5μl
DNA样品 60ul
连接反应液 30ul
连接酶 10ul
无核酸酶的水 7.5ul
4.将上述接头连接后的产物进行磁珠纯化，然后进行PCR扩增(PCR扩增引物为P5接头端引物和P7接头端引物)，得到足量的带接头的DNA片段，基本步骤如下：先在98℃预变性45s，其次在98℃变性15s，然后在60℃退火30s，72℃延伸30s；重复变性退火延伸过程7次；最后在72℃延伸1min，结束反应。扩增体系见下表4：
表4
试剂 体积
快速热启动聚合酶 25μL
扩增引物 1uL
连上接头的DNA片段 24μL
5.对PCR扩增产物进行磁珠纯化后，利用Qubit定量得到浓度后，取出500ng扩增产物，使用浓缩仪将扩增产物体积浓缩到4.4ul，然后进行封闭和探针杂交，杂交反应体系如下表5所示。
表5
试剂 体积
封闭试剂混合液 5.6μl
P5、P7封闭试剂 2ul
快速封闭试剂 5ul
RNA酶封闭试剂 2ul
针对目标区域的生物素探针 2ul
杂交缓冲液 6ul
无核酸酶的水 3ul
PCR扩增产物 4.4ul
杂交反应条件如下表6所示：
表6
6.使用链霉亲合素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将50ul磁珠加入1.5ml离心管，置于磁力架上，弃上清，用200ul连接缓冲液清洗三遍后，使用200ul连接缓冲液重悬磁珠，将与探针(Agilent商业化探针)杂交的样品加入磁珠，混匀仪上颠倒混匀30min，置于磁力架上，弃上清，用清洗液1清洗1遍，然后用预热到65℃的清洗液2清洗3遍，期间保证磁珠和缓冲液2的温度在65℃。最后置于磁力架上，弃上清，加入38ul无核酸酶的水，重悬磁珠。
7.将磁珠捕获到的DNA片段进行PCR扩增(采用针对Illumina P5、P7接头引物)，扩增体系见下表，得到足量的加上接头的DNA片段，基本步骤如下：先在98℃预变性2min，其次在98℃变性30s，然后在60℃退火30s，72℃延伸1min；重复变性退火延伸过程14次；最后在72℃延伸5min，结束反应。反应体系如下表7所示：
表7
试剂 体积
高保真DNA聚合酶 1ul
扩增引物 1ul
高保真DNA聚合酶反应混和液 10ul
单核苷酸混合液 0.5ul
磁珠上的目标区域DNA 37.5ul
8.将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，然后利用qPCR定量，利用2100进行片段大小检测。
9.测序，在x-ten基因测序仪上完成测序，测序平台将得到的光信号转化为碱基序列下机数据为fq文件存储所有测序片段结果。
在本实施例的第二部分中，将下机数据fq文件比对上参考基因组(在本实施例中，使用软件BWA-MEM与人类参考基因组Hg19进行比对)，去除低质量序列，使用如图1所示的检测流程进行检测。
样本检测结果为：
肿瘤突变负荷为12.3个/Mb，目前设定阈值为5个/Mb。高于该阈值可以判定为高肿瘤负荷，与样本状态一致。
另外，采用本发明的方法对另外30例已知肿瘤突变负荷状态的肺癌样本进行检测，所有样本均可以正确检出。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)本发明的方法平均深度1000X，使用高深度的测序数据，可以检测到更加低频的体细胞突变，辅之软件流程、方法以及过滤流程进行肿瘤突变负荷判定；
2)结合靶向捕获测序检测肿瘤突变负荷的方法，使用本发明的肿瘤突变负荷检出流程，能够进行肿瘤突变负荷检测，该方法具有高灵敏性和高特异性的特点。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，待测样本预处理并提取DNA；
S2，根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；
S3，通过高通量的方法进行测序，得序列信息；
S4，过滤掉低质量的序列，利用检出流程进行检测，所述检出流程包括：
S41，利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；
S42，对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S41中采用的比对软件为BWA-mem比对软件。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S41中采用samtools软件建立index。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S42中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S42中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驱动基因包括：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
7.一种利用高通量测序数据检测肿瘤突变负荷的装置，其特征在于，包括：
DNA提取单元，用于待测样本预处理并提取DNA；
目标区域捕获单元，用于根据目标区域捕获原理使用探针捕获肿瘤相关基因；
高通量测序单元，用于通过高通量的方法进行测序，得序列信息；
检出单元，用于过滤掉低质量的序列，利用检出流程模块进行检测，所述检出流程模块包括：
比对子模块，用于利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因组上，未比对上的序列形成软截断，根据比对的位置进行排序，并建立index；
突变负荷确定子模块，用于对比对上的序列进行变异检测，对检测到的变异使用RMSK数据库注释，去除注释上的重复区，以及对驱动基因和同义突变进行过滤，计算过滤后体细胞突变数目，确定样本肿瘤突变负荷。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述比对子模块中采用的比对软件为BWA-mem比对软件。
9.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述比对子模块中采用samtools软件建立index。
10.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述突变负荷确定子模块中使用VarScan软件对比对上的序列进行变异检测。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述突变负荷确定子模块中变异检测包括计算体细胞突变中发生单核苷酸位点突变及插入缺失突变的数量。
12.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述驱动基因包括：EGFR、BRAF、PIK3CA、NF1、KRAS、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。
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