CN109427412A - 用于检测肿瘤突变负荷的序列组合和其设计方法 - Google Patents

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CN109427412A CN201811303219.3A CN201811303219A CN109427412A CN 109427412 A CN109427412 A CN 109427412A CN 201811303219 A CN201811303219 A CN 201811303219A CN 109427412 A CN109427412 A CN 109427412A
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Abstract

本发明公开了用于检测肿瘤突变负荷的序列组合和其设计方法。所述方法包括：a)确定需要设计探针的目标区域，并获得包含大样本测定的肿瘤突变数据的数据库；b)对于每个目标区域，以一个窗口长度进行滑动获得多个窗口，对所述每个窗口进行打分；c)对于每个目标区域，得分最高的窗口是目标探针区域。本发明还公开了计算组织和血浆样本TMB的方法，以及计算组织和血浆样本TMB的质控方法。

Description

用于检测肿瘤突变负荷的序列组合和其设计方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体而言，本发明涉及用于检测肿瘤突变负荷的序列组合和方法。
背景技术
近年来，程序性死亡抑制因子-1(PD-1)蛋白或其配体(PD-L1)免疫检查点抑制剂创造了不少奇迹，其中不乏有患者从濒危状态中被挽救过来并获得长期生存。但是，对于未经生物标记物选择的患者，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的有效率只有～20％。因此，该类抑制剂的疗效预测指标便成为了研究热点。
PD-L1表达是目前已经纳入NCCN指南的预测指标。根据临床数据，可以看到随着PD-L1表达水平的提高，患者对派姆单抗的应答率、无进展生存期和中位生存期也在明显提高。尤其是在Keynote001(Study of Pembrolizumab(MK-3475)in Participants WithProgressive Locally Advanced or Metastatic Carcinoma,Melanoma,or Non-smallCell Lung Carcinoma)中，PD-L1表达大于50％的患者客观缓解率是45.2％；而PD-L1表达小于1％的患者客观缓解率只有10.7％(PMID:25891174)。但是，PD-L1指标也存在一些局限性。首先，PD-L1表达适用的癌症类型和药物有限；其次，PD-L1的表达在肿瘤组织中分布不均匀，容易造成假阴性的结果；再次，不同检测抗体和平台的结果不一致。
肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden,TMB)是目前研究较多的潜在预测指标，是指编码区内的肿瘤体细胞突变数目，被定义为每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。高肿瘤突变负荷(TMB-H)是高新抗原负荷的指征。研究表明，TMB-H患者的客观有效率(ORR)、持续临床获益(DCB)等均优于TMB-L的患者(PMID:25765070)。微卫星高度不稳定(MSI-H)是已经获得FDA批准的另一PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂疗效预测指标。研究表明，87％～100％的MSI-H的癌症会表现为TMB-H，而一部分微卫星稳定(Microsatellite Stable(MSS))的癌症患者因为POLE、POLD1等基因突变，会出现TMB极高的情况。因此，相对于MSI，TMB指标可以使得更多的患者获得接受免疫治疗的机会，有望成为应用前景最为广泛的预测指标。
TMB的检测可以是基于全外显子组数据，也可以是基于目标区域捕获测序，由于目标区域大小不一，通常折算为每Mb编码区的数目。TMB的优势在于：无需增加实验成本，包括价格成本和样本量成本，在获得驱动突变(比如，基因EGFR、ALK、ROS1等)的同时，可以获得TMB；可以量化，横跨多个肿瘤进行横向分析；可潜在甄别具体的突变模式和推测新抗原负荷。TMB分析的难点在于如何确定样本中肿瘤DNA的比例、计算规则和阈值。
目前，TMB的计算方法以及阈值未形成指南性规范，本领域中需要一种用于检测TMB的序列组合以及计算TMB的方法，用于预测免疫检查点抑制剂的疗效。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可以同时检测肿瘤驱动基因等与多个肿瘤相关基因的点突变(SNV)、短片段插入缺失(InDel)、拷贝数变异(CNV)和结构变异(SV)例如融合基因和肿瘤突变负荷(TMB)的序列组合；以及一种计算组织和血浆样本TMB的计算方法和一种计算TMB的质控方法。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于检测肿瘤突变负荷的序列组合的设计方法，所述方法包括：
a)确定需要设计探针的目标区域，并获得包含大样本测定的肿瘤突变数据的数据库；
b)对于每个目标区域，以一个窗口长度(例如120bp)进行滑动获得多个窗口(例如以1、2或5个碱基的步长进行滑动)，对所述每个窗口进行打分，打分方式如下：
1)对于窗口的每个碱基位置根据式1.1得到所述肿瘤突变数据的数据库的打分；
x是指该碱基位置在所述数据库中发生变异的次数；
2)对于每个目标区域，按照式1.2计算该目标区域中得分最高的窗口，从而得到该目标区域的打分，将该目标区域的每个窗口按照得分值降序排列，从而选择最优的窗口：
其中Score是指该目标区域内得分最高的窗口的分数，max指取最大值，WTR(windows of target region)表示该目标区域的所有窗口，x表示每个窗口，xi表示窗口中第i个碱基；
c)对于每个目标区域，得分最高的窗口是目标探针区域。
优选地，所述目标区域是基因编码区。
优选地，所述肿瘤突变数据的数据库选自如下的一个或多个：COSMIC数据库、TCGA数据库和吉因加数据库(Geneplusdatabase)。选用多个数据库时，分别对每个数据库进行打分，对于每个目标区域，所述多个数据库得分之和得分最高的窗口是目标探针区域。
优选地，通过要检测的基因集、突变位点或相关区域，确定探针的目标区域。
优选地，目标区域为表1中的288个基因检测全部CDS区域、表2中的740个基因检测部分CDS或特定区域。
优选地，所述方法还包括，对于表3中的33个基因的非编码区，这一部分主要是针对融合基因的检测，融合断点的相关区域为目标区域。
优选地，所述方法还包括，增加SEQ ID NO.1所示的探针。
在第二方面，本发明还提供了利用本发明第一方面的方法制备的探针集。
优选地，所述探针集包括针对1033个肿瘤相关基因的探针，所述1033个肿瘤相关基因是表1中的288个基因检测全部CDS区域、表2中的740个基因检测部分CDS或特定区域以及表3中的33个基因的非编码区；另外，还包括针对该突变的探针SEQ ID NO.1。
在第三方面，本发明提供一种测定组织和血浆样本TMB的方法，包括以下步骤：
a)提取所述组织或血液样本的DNA样本，
b)利用本发明第二方面的探针集捕获所述DNA样本，对探针的捕获序列进行测序，并确定编码区的体细胞突变，并进而确定所述体细胞突变的突变数目，所述体细胞突变为SNV和Indel，所述体细胞突变不包括同义突变；
对于组织样本：检出的突变丰度(或者频率)≥1％，优选≥5％；
对于血浆样本：检出的突变丰度(或者频率)≥0.1％，优选≥0.5％；
c)
单位:突变/Mb，其中突变数目是指所述采用b)计算的体细胞突变的突变数目；所述CDS区大小是指对如下探针的编码区大小(单位：M)。
优选地，所述方法还包括对所述组织和血浆样本TMB的进行质控的步骤：
对于组织：首先进行镜检，肿瘤细胞含量低于10％为不合格样本，不进行TMB计算；
对于血浆样本：最高体细胞突变频率(或丰度))小于1％，且无融合和拷贝数变异检为不合格样本，不进行TMB计算。
本发明不仅可以特异性地一次性检测出与1033个与肿瘤相关基因的不同变异类型，同时也能预测TMB等与免疫治疗预后相关指标，其优势如下：(1)更加全面检测多种与肿瘤相关的基因：本发明探针覆盖1033个与肿瘤相关基因，覆盖面广，不仅能检测与KRAS、EGFR、EML4-ALK等与肿瘤相关的常见变异，更能检测罕见变异，真正实现全方面检测；(2)适用样本类型更广：本检测方法不仅适用于新鲜组织、石蜡包埋组织的检测，同时适用于血浆样本检测；(3)灵敏度更高：本发明对于血浆样本的检测可以检测1％比例的ctDNA的各种突变以及TMB；(4)临床用途更广：本发明不仅覆盖所有靶向用药基因检测，并且覆盖免疫治疗疗效预测指标；(5)通量高：能够在短时间内同时进行多例样本检测，从而压缩成本，有利于临床的推广。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明：
图1示出了本发明的样本检测实施流程图；
图2示出了全外显子组测序与本发明采用的panel测序对于计算TMB的一致性；
图3示出了非小细胞肺癌组织TMB分布图；
图4示出了血浆(bTMB)与组织(tTMB)配对TMB分布；
图5示出了bTMB-H/L的接受免疫治疗的客观缓解率。
具体实施方式
本发明的用途在于提供肿瘤靶向用药和免疫治疗及疗效预测的指导方案。包括FDA批准靶向药物或NCCN指南推荐靶向药物或临床试验靶向药物正在开展的肿瘤驱动基因的敏感突变和耐药突变检测；对于TMB-H受检者，提示可能可以从PD1/PDL1抑制剂免疫治疗中获益。一种用于针对选择性区域检测肿瘤突变负荷的肿瘤基因突变富集探针的设计方法
在本发明中，所述肿瘤突变数据的数据库可以是长期积累获得的体细胞突变数据，构建体细胞突变数据库。该数据库应包含多种癌症类型，大量患者的数据。可以根据
NCCN指南、COSMIC、TCGA数据库和相关文献确定基因集，突变位点或相关区域，确定探针的主要目标区域。COSMIC数据库是Catalogue of Somatic Mutations in Cancer的缩写，是全球最大的肿瘤体细胞突变数据库。TCGA数据库是The Cancer Genome Atlas的缩写，包括30多种癌症11000多个患者的临床与基因信息，致力于癌症基因图谱绘制和分子机制探索。
在一个实施方案中，所述肿瘤突变数据的数据库选自如下的一个或多个：COSMIC数据库、TCGA数据库和吉因加数据库(Geneplusdatabase)，所述方法包括：
a)确定需要设计探针的目标区域，并获得包含大样本测定的肿瘤突变数据的数据库；
b)对于每个目标区域，以一个窗口长度(例如120bp)进行滑动获得多个窗口(例如以1、2或5个碱基的步长进行滑动)，对所述每个窗口进行打分，打分方式如下：
1)对于窗口的每个碱基位置根据式1.1得到COSMIC数据库,TCGA数据库和吉因加数据库(Geneplus)打分；
其中SCOSMIC|TCGA|Geneplus是指该碱基位置分别在所述三个数据库中的打分；
[1,10]、(10,100]和(1000,+]：分段的原因是体现该碱基位置在数据库出现次数越多，该位置越重要，需要优先被纳入目标区域；
x是指该碱基位置在数据库中发生变异的次数；
2)对于每个目标区域，按照式1.2计算该目标区域中得分最高的窗口，从而得到该目标区域的打分，将该目标区域的每个窗口按照得分值降序排列，从而选择最优的窗口：
其中Score是指该目标区域内得分最高的窗口的分数；
WTR(windows of target region)表示该目标区域的所有窗口，x表示每个窗口，xi表示窗口中第i个碱基；
SxiCOSMIC是指在COSMIC数据库中，该窗口中某碱基位置的分数；
SxiTCGA是指在TCGA数据库中，该窗口中某碱基位置的分数；
Sxigeneplus是指在吉因加数据库中，该窗口中某碱基位置的分数；
c)对于每个目标区域，得分最高的窗口是目标探针区域。
利用上述方法，获得的探针集共包含针对740个肿瘤相关基因的1167条探针。发明人单独利用COSMIC、TCGA和Geneplus中的一个数据库进行了测试。
在本发明第三方面的方法中，对于组织：首先进行镜检，肿瘤细胞含量低于10％的属于样本检测前质控不合格，无法进行TMB计算。
对于血浆样本：使用MAFmax(最高体细胞突变频率(或丰度))来预测肿瘤细胞含量，MAFmax小于1％，且无融合和拷贝数变异检出的判定为未知
TMB(TMB-U).
在本发明中，IDT或者罗氏可以合成探针。
本发明的目的在于提供一种同时检测点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异、结构变异(SV)例如融合基因以及基于上述变异计算TMB的探针集。该探针集共包含针对1033个肿瘤相关基因的12807条探针，针对的是表1中的288个基因检测全部CDS区域、表2中的740个基因检测部分CDS或特定区域(表中*号表示该基因部分/全部区域为算法PanelRS确定的区域)以及表3中的33个基因的非编码区；另外，为了更好捕捉EGFR基因常见的19号外显子缺失突变，增加针对该突变的探针(SEQ ID NO.1)：
TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGG。
表1本发明的探针覆盖所有CDS的基因列表
ABL1 ABL1 ABL2 ACVR1B AKT1 AKT2 AKT3 ALK
PC ARAF ARID1A ARID1B ARID2 AR ASXL1 ATM
ATR ATRX AURKA AURKB AXIN1 AXIN2 AXL B2M
BAP1 BARD1 BCL2L1 BCL2 BCOR BLM BMPR1A BRAF
BRCA1 BRCA2 BRD4 BRIP1 BTK EMSY CASP8 CASP8
CBFB CBL CCND1 CCND2 CCND3 CCNE1 CD274 CDC73
CDH1 CDK12 CDK4 CDK6 CDK8 CDKN1A CDKN1B CDKN2A
CDKN2A CDKN2B CDKN2C CEBPA CHEK1 CHEK2 CIC CREBBP
CRKL CSF1R CTCF CTNNA1 CTNNB1 CUL3 CYLD DAXX
DDR1 DDR2 DICER1 DNMT3A DNMT3A EGFR ELAC2 EP300
EPAS1 EPCAM EPHA2 EPHA3 EPHA5 EPHB2 EPHB6 ERBB2
ERBB3 ERBB4 ERCC1 ERCC3 ERG ERRFI1 ESR1 EXT1
EXT2 EXT2 EZH2 AMER1 FAM175A FANCA FANCD2 FANCD2
FANCM FAS FAT1 FAT2 FBXW7 FCGR2A FCGR3A FGFR1
FGFR2 FGFR3 FGFR4 FH FLCN FLT1 FLT3 FLT4
FOXA1 FOXL2 FOXP1 FUBP1 GAB2 GALNT12 GATA3 GNA11
GNAQ GNAS GRIN2A HDAC1 HDAC4 HGF HNF1A HOXB13
HRAS HSP90AA1 IDH1 IDH2 IFNG IFNGR1 IGF1R IL7R
INPP4B IRF2 IRS2 JAK1 JAK2 JAK3 KDM5A KDM5C
KDM6A KDR KEAP1 KIT KRAS LRP1B MAP2K1 MAP2K2
MAP2K4 MAP3K1 MAPK1 MAX MCL1 MDM2 MDM4 MED12
MEN1 MET MITF MLH1 MLH3 KMT2D KMT2C KMT2A
MPL MRE11 MS4A1 MSH2 MSH3 MSH6 MTOR MUTYH
MYCL MYC MYCN MYD88 NBN NCOR1 NDUFA13 NF1
NF2 NF2 NOTCH1 NOTCH2 NOTCH3 NOTCH4 NPM1 NRAS
NSD1 NTHL1 NTRK1 NTRK1 NTRK3 PALB2 PAX5 PBRM1
PCK1 PDCD1LG2 PDGFRA PDGFRB PDK1 PHF6 PIK3CA PIK3CB
PIK3CG PIK3R1 PIK3R2 PMS1 PMS2 POLD1 POLE POT1
PPM1D PRKAR1A PTCH1 PTCH1 PTCH2 PTEN PTPN11 RAD50
RAD51B RAD51C RAD51D RAD51 RAF1 RARA RB1 RBM10
RET RHEB RHOA RICTOR RINT1 RNASEL RNF43 ROS1
RPS6KB1 RUNX1 SDHAF2 SDHA SDHB SDHC SDHD SERPINB3
SERPINB4 SETD2 SLX4 SMAD2 SMAD4 SMARCA4 SMARCB1 SMARCE1
SMO SOX2 SOX9 SRC STAG2 STAT3 STK11 SUFU
SYK TBX3 TCF7L2 TET2 TET2 TGFBR2 TMEM127 TMPRSS2
TNFAIP3 top1 top2A TP53 TP53 TP53 TP53 TP73
TSC1 TSC2 VEGFA VHL WT1 XPO1 XRCC2 XRCC3
ZFHX3 ZMAT3 EME2 FANCC FANCG
表2本发明的探针所覆盖部分CDS区域的基因及范围
注释：*号表示该基因部分/全部区域为算法PanelRS确定的区域。
表3本发明的探针所覆盖融合基因断点区域及其他区域
注释：intron表示内含子；promotor表示启动子。
在本发明中，基因名称均采用NCBI-Gene里的官方命名(Official Symbol)；参考基因组序列为GRCh37/hg19。
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本发明所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1本例以18例同时检测全外显子组芯片和本发明所述芯片的组织样本为例来阐述本发明检测TMB性能。
图1示出了本发明的样本检测实施流程，包括样本DNA提取，建库，利用液相探针目标区域捕获，高通量测序，生物信息分析，鉴定真正的体细胞突变与胚系突变，计算TMB。
1.DNA提取：样本适用范围包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病例组织和石蜡切片等；本实施例采用血细胞的gDNA的测序结果作为对照用于排除胚系突变。DNA提取步骤：血细胞和组织等样本按照QIAamp DNA Mini Kit提取试剂说明书，进行gDNA的提取。然后采用Qubit定量，要求血细胞gDNA大于100ng；组织DNA大于100ng。
2.文库构建：组织或者用于对照的血细胞提取的基因组DNA，应先打断到200-250bp，然后按照NEBNext Ultra II文库构建试剂盒构建样本文库。
2.1末端修复及加“A”：按照下表配置末端修复以及加“A”反应：
组分 单反应体积(μl)
End Prep Reaction Buffer 7
End Prep Enzyme Mix 3
cfDNA或片段化的DNA 50μl
总体积 60μl
将以上混合物充分振荡混匀并离心，然后按照以下步骤在恒温混匀仪上孵育：首先20℃，孵育30min；然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室温，高速离心机短暂离心。
2.2接头连接：按照下表配置接头连接反应Premix：
组分 单反应体积(μl)
Ligation Master Mix 30
Ligation Enhancer 1
总体积 31
接头加入量随DNA起始量变化而变化，对应关系见下表：
依次向反应管中加入31μl接头连接反应Premix及对应体积的接头，并用ddH2O补充体积至95μl，充分振荡混匀后离心。恒温混匀仪20℃孵育15min。孵育完成后，微量高速离心机短暂离心。
连接反应结束后，使用磁珠对接头连接产物进行纯化，最后回溶至25μL TE(pH8.0)中。
2.3捕获前PCR(Non-C-PCR)引入index：按照下表顺序在PCR管中加入反应组分，并且设置阴/阳性对照：
组分 单反应体积(μl)
index Primer/i7Primer-P7(10p) 5
index Primer/i7Primer-P5(10p) 5
Q5Master Mix 25
Adapter-Ligated library 15
总体积 50
振荡混匀并离心。
2.3.1 PCR上机样本循环数对应关系见下表：
2.3.2 PCR上机程序见下表：
Illumina测序仪的PCR程序：
BGI测序仪的PCR程序：
对Non-C-PCR产物进行纯化，最终溶解在31μl TE(pH 8.0)中。纯化产物进行Qubit-BR定量和2100质控。
3.靶序列富集与上机测序：
3.1扩增后文库质控合格后，分别采用全外显子组芯片(Roch，EZ HumanExome Probes v3.0)和本发明人设计的富集探针(IDT)，参照芯片制造商提供的说明书进行杂交捕获。最后洗脱回溶21μL ddH2O带杂交洗脱磁珠。
3.2杂交捕获产物的扩增。
3.3先除去上一步磁珠，然后进行磁珠纯化，最后回溶30μL ddH2O，进行QC及上机。
3.4采用Illumina测序平台或BGI-seq 500测序仪进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。上机数据量要求：采用本发明探针进行捕获测序的组织样本能获得有效深度500X；全外显子组测序组织样本能获得有效深度200X。
4.信息分析：组织样本采用的的信息分析如下：
4.1序列用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测序序列；
4.2根据4.1中得到的测序序列进行duplicate标记，使用picard的MarkDuplicates进行处理；
4.3对4.2中得到的序列进行GATK的最佳处理(best Practices)，使用GATKIndelRealigner reads对序列末端的indel纠正，使用GATK BaseRecalibrator对序列碱基质量值进行修正；
4.4根据4.3中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率；
4.5 Call SNV/InDel/SV/CNV：根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect2流程和realdcaller流程进行call somatic SNV变异和call somatic InDel变异；用contra.py流程call CNV；用somVar流程call SV；所使用的筛选参数为：对照位点变异率≤2％；变异测序序列条数≥5；突变预测p值≤0.05；
4.6变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已有变异数据库中的该变异的情况。
5.TMB值计算：
5.1根据组织样本测序数据的有效深度要求，确定纳入计算的SNV和Indel的频率：panel(本发明探针)：≥3％；WES(全外显子组)：≥5％；
5.2本发明探针计算TMB的编码区域为1M。因此TMB即为编码区内的体细胞SNV和Indel数目。
6.检测结果：18例同时检测全外显子组芯片和本发明所述芯片的样本，TMB(突变/Mb)结果入下表和图2：
患者ID WES Panle TMB
P001 80 12
P002 65 10
P003 48 10
P004 77 7
P005 35 4
P006 25 4
P007 4 1
P008 26 4
P009 29 3
P010 41 4
P011 17 1
P012 13 1
P013 19 1
P014 9 3
P015 12 3
P016 17 3
P017 285 23
P018 278 23
P019 310 24
P020 145 19
P021 145 23
全外TMB与芯片TMB一致性为90％，相关性Pearsonρ为0.9795。
实施例2非小细胞肺癌tTMB检测。
在本实施例中，按照实施例1所述的TMB计算方法，回顾性的统计采用实施例1相同方法进行检测的1353例非小细胞肺癌数据。
结果：获得非小细胞肺癌的tTMB分布如图3。根据文献报道，目前在非小细胞肺癌相关的临床试验中，以总样本的上四分位或上三分位作为区分TMB-H或TMB-L的阈值。因此，在本实施例中，对于非小细胞肺癌定义TMB≥9突变/Mb为TMB-H，TMB＜9突变/Mb为TMB-L。
实施例3非小细胞肺癌bTMB阈值的确定。
在本实施例中，以100例初诊非小细胞肺癌样本(NSCLC)评估组织血浆TMB一致性，100例样本同时检测未经治疗的组织样本和血浆样本。
本实施例组织样本实验分析流程参考实施例1。
本实施例血浆样本实验分析流程如下，采用血细胞gDNA做为样本对照。
1.DNA提取：
对于全血需要首先进行血浆/血细胞分离：采集10mL外周血，及时进行血浆/血细胞分离(EDTA抗凝管，4h内；Streck管72h内)，分离步骤如下：
第1步：在4℃条件下1600g离心10min，离心后将上层血浆分装到多个1.5mL或者2.0mL的离心管中。分离血浆后，中间层+底层血细胞留取备用，作为正常对照。
第2步：在4℃条件下以16000g离心10min去除残余细胞，将上清转入新的1.5mL或者2.0mL离心管中，即得到所需的血浆。
DNA提取：血浆按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)提取试剂说明书，进行血浆cfDNA的提取。血细胞样本按照QIAamp DNA Mini Kit提取试剂说明书，进行gDNA的提取。然后采用Qubit定量，要求血浆cfDNA大于15ng；血细胞gDNA大于100ng。
2.文库构建：
体液中提取的cfDNA按照NEBNext Ultra II文库构建试剂盒说明书构建样本文库，引物和接头来自于Invitrogen。
2.1末端修复及加“A”：
按照下表配置末端修复以及加“A”反应：
组分 单反应体积(μl)
End Prep Reaction Buffer 7
End Prep Enzyme Mix 3
cfDNA或片段化的DNA 50μl
总体积 60μl
将以上混合物充分振荡混匀并离心，然后按照以下步骤在恒温混匀仪上孵育：首先20℃，孵育30min；然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室温，高速离心机短暂离心。
2.2接头连接：
按照下表配置接头连接反应Premix：
组分 单反应体积(μl)
Ligation Master Mix 30
Ligation Enhancer 1
总体积 31
接头加入量随DNA起始量变化而变化，对应关系见下表：
依次向反应管中加入31μl接头连接反应Premix及对应体积的接头，并用ddH2O补充体积至95μl，充分振荡混匀后离心。恒温混匀仪20℃孵育15min。孵育完成后，微量高速离心机短暂离心。
连接反应结束后，使用磁珠对接头连接产物进行纯化，最后回溶至25μL TE(pH8.0)中。
2.3捕获前PCR(Non-C-PCR)引入index：
按照下表顺序在PCR管中加入反应组分，并且设置阴/阳性对照：
组分 单反应体积(μl)
index Primer/i7Primer-P7(10p) 5
index Primer/i7Primer-P5(10p) 5
Q5Master Mix 25
Adapter-Ligated library 15
总体积 50
振荡混匀并离心。
2.3.1 PCR上机样本循环数对应关系见下表：
样本类型 PCR循环数
ctDNA 8
血细胞 4
2.3.2 PCR上机程序见下表：
Illumina测序仪的PCR程序：
BGI测序仪的PCR程序
对Non-C-PCR产物进行纯化，最终溶解在31μl TE(pH 8.0)中。纯化产物进行Qubit-BR定量和2100质控。
3.靶序列富集与上机测序：
3.1扩增后文库质控合格后并采用本发明设计的富集探针，参照芯片制造商(IDT)提供的说明书进行杂交捕获。最后洗脱回溶21μL ddH2O带杂交洗脱磁珠。
3.2杂交捕获产物的扩增：
3.3先除去上一步磁珠，然后进行磁珠纯化，最后回溶25μL ddH2O，进行QC及上机。
3.4采用Illumina测序平台或BGI-seq 500测序仪进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。上机数据量要求：采用本发明探针进行捕获测序的血浆样本能获得有效深度1000X。
4.信息分析：
采用发明人自主开发的血浆ctDNA低频突变富集测序技术——ER-seq(Enrichment&Rarallele Sequence)(中国专利公开号CN105063208A，公开日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeq Pipeline)，具体方法为：
1)基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片段是文库中与接头引物相连接的DNA片段，经双末端测序，每个片段形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序列1的前12bp碱基和测序序列2的前12bp碱基作为标签，字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前就标记成正链；测序序列2的标签在前就标记为反链；
2)对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序重复测序序列聚集到一起的目的；
3)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过10，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
4)对步骤3)中获得的同一个DNA模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数都达到2对以上，则进行后续分析；
5)对满足4)中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列。对于DNA模板的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80％，且在反链测序序列中的一致率也达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列；
6)将新测序序列用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测序序列；
7)根据6)中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率；
8)Call SNV/InDel/SV/CNV：根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect流程call somatic SNV变异；用gatk流程call somatic InDel变异；用contra.py流程callCNV；用somVar流程call SV；所使用的筛选参数为：对照位点变异率≤2％；纠错后变异测序序列条数≥2；突变预测p值≤0.05；
9)变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已有变异数据库中的该变异的情况。
5.TMB值计算：
根据血浆样本测序数据的有效深度要求，确定纳入计算的SNV和Indel的频率：panel(本发明探针)：≥0.5％
6.检测结果：
100例组织血浆配对样本，TMB(单位为突变/Mb)分级组织(tTMB)血浆(bTMB)一致样本共95对。按照tTMB和bTMB≥9突变/Mb,组织血浆一致性为95％，相关性Pearsonρ为0.9075。各对样本TMB分布详情见图4。
实施例4 bTMB与临床疗效：
取送待检测的经过标准治疗方案治疗后进展的非小细胞肺癌血浆样本27例，均使用了PD-1/PD-L1抑制剂。
参考实施例3进行DNA提取，文库构建，杂交捕获，上机测序及信息分析。参照实施例3的结果，选择bTMB≥9突变/Mb作为bTMB-H。
检测结果：
27例样本的检测结果，详细见下表。bTMB-H的ORR(客观缓解率)为37.5％(6/16)；bTMB-L的ORR为0％(0/11)，图5。
样本名 疗效评价 bTMB(突变/Mb) bTMB等级
bTMB001 PR 47 bTMB-H
bTMB007 PR 16 bTMB-H
bTMB010 PR 12 bTMB-H
bTMB011 PR 11 bTMB-H
bTMB012 PR 11 bTMB-H
bTMB016 PR 10 bTMB-H
bTMB015 SD 10 bTMB-H
bTMB019 SD 7 bTMB-L
bTMB009 SD 13 bTMB-H
bTMB018 SD 8 bTMB-L
bTMB017 PD 8 bTMB-L
bTMB002 PD 36 bTMB-H
bTMB003 PD 23 bTMB-H
bTMB004 PD 20 bTMB-H
bTMB005 PD 22 bTMB-H
bTMB006 PD 14 bTMB-H
bTMB008 PD 14 bTMB-H
bTMB013 PD 11 bTMB-H
bTMB014 PD 11 bTMB-H
bTMB020 PD 7 bTMB-L
bTMB021 PD 7 bTMB-L
bTMB022 PD 6 bTMB-L
bTMB023 PD 5 bTMB-L
bTMB024 PD 5 bTMB-L
bTMB025 PD 1 bTMB-L
bTMB026 PD 1 bTMB-L
bTMB027 PD 1 bTMB-L
检测结果解读：从检测结果来看，bTMB-H指标能进行很好的疗效区分，bTMB-H vsbTMB-L为37.5％vs 0％。

Claims (10)

1.一种用于检测肿瘤突变负荷的序列组合的设计方法，所述方法包括：
a)确定需要设计探针的目标区域，并获得包含大样本测定的肿瘤突变数据的数据库；
b)对于每个目标区域，以一个窗口长度(例如120bp)进行滑动获得多个窗口(例如以1、2或5个碱基的步长进行滑动)，对所述每个窗口进行打分，打分方式如下：
1)对于窗口的每个碱基位置根据式1.1得到所述肿瘤突变数据的数据库的打分；
x是指该碱基位置在所述数据库中发生变异的次数；
2)对于每个目标区域，按照式1.2计算该目标区域中得分最高的窗口，从而得到该目标区域的打分，将该目标区域的每个窗口按照得分值降序排列，从而选择最优的窗口：
其中Score是指该目标区域内得分最高的窗口的分数，max指取最大值，WTR(windowsof target region)表示该目标区域的所有窗口，x表示每个窗口，xi表示窗口中第i个碱基；
c)对于每个目标区域，得分最高的窗口是目标探针区域。
2.根据权利要求1所述的方法，所述目标区域是基因编码区。
3.根据权利要求1所述的方法，所述肿瘤突变数据的数据库选自如下的一个或多个：COSMIC数据库、TCGA数据库和吉因加数据库(Geneplus database)。
4.根据权利要求1所述的方法，通过要检测的基因集、突变位点或相关区域，确定探针的目标区域。
5.根据权利要求1所述的方法，目标区域为表1中的288个基因检测全部CDS区域、表2中的740个基因检测部分CDS或特定区域。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，所述方法还包括，对于表3中的33个基因的非编码区，这一部分主要是针对融合基因的检测，融合断点的相关区域为目标区域；以及增加SEQ ID NO.1所示的探针。
7.利用权利要求1-6任一项的方法制备的探针集。
8.根据权利要求7的探针集，所述探针集包括针对1033个肿瘤相关基因的探针，所述1033个肿瘤相关基因是表1中的288个基因检测全部CDS区域、表2中的740个基因检测部分CDS或特定区域以及表3中的33个基因的非编码区；另外，还包括针对该突变的探针SEQ IDNO.1。
9.一种测定组织和血浆样本TMB的方法，包括以下步骤：
a)提取所述组织或血液样本的DNA样本，
b)利用权利要求7或8的探针集捕获所述DNA样本，对探针集的捕获序列进行测序，并确定编码区的体细胞突变，并进而确定所述体细胞突变的突变数目，所述体细胞突变为SNV和Indel，所述体细胞突变不包括同义突变；
对于组织样本：检出的突变丰度(或者频率)≥1，优选≥5％；
对于血浆样本：检出的突变丰度(或者频率)≥0.1，优选≥0.5％；
c)
单位:突变/Mb，其中突变数目是指所述体细胞突变的突变数目；CDS区大小是指对如下探针的编码区大小(单位：M)。
10.权利要求9的方法，所述方法还包括对组织和血浆样本TMB进行质控的步骤：
对于组织：首先进行镜检，肿瘤细胞含量低于10％为不合格样本，不进行TMB计算；
对于血浆样本：最高体细胞突变频率(或丰度))小于1％，且无融合和拷贝数变异检为不合格样本，不进行TMB计算。
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