CN110643703A - bTMB生物标记、测定方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血液肿瘤突变负荷(bTMB)生物标记、测定方法和用途。本发明提供一种bTMB生物标记，其中所述bTMB生物标记如下获得：从受试者的血液样品中获得游离DNA(cfDNA)，测定测序碱基上的体细胞突变数，将低等位基因丰度的体细胞突变数作为所述bTMB生物标记，表示为LAF‑bTMB，其中所述低等位基因丰度是指等位基因频率小于例如25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.3％‑25％之间，优选小于例如13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.5％‑13％，尤其优选小于6.5％，6％，5.5％，5％，4.5％，4％，3.5％，3％，2.5％，其中根据样品测定区域变异总数计算LAF‑bTMB。

Description

bTMB生物标记、测定方法和用途
技术领域
本发明涉及生物标记和基因检测领域，更具体地，涉及一种通过循环肿瘤DNA测定的血液肿瘤突变负荷(bTMB)生物标记、测定方法和用途。
背景技术
肿瘤免疫检查点抑制剂(以下简称免疫治疗)是目前肿瘤领域最为炙手可热的免疫疗法，其包括程序性死亡受体-1及其配体的特异性抗体(anti-PD-1/PD-L1)以及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体(anti-CTLA-4)等。此类药物通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动患者自身免疫系统功能消除肿瘤。目前免疫治疗已在多种晚期实体肿瘤治疗中取得了突破性进展，尤其是可有效延长患者总生存期(Overall survival，OS)，且不良反应可控。然而在未经标记物筛选的人群中，免疫治疗单药有效率偏低，如在非小细胞肺癌中仅为14％-21％。因此寻找能够精准识别免疫治疗获益人群的生物标记物是目前肿瘤领域的热点和难点。
既往临床研究及转化研究显示，基于组织检测的肿瘤突变负荷(tissue-basedtumor mutational burden，tTMB)状态与客观缓解率(Objective response rate，ORR)、无进展生存期(Progression-free survival，PFS)以及OS相关，因此被认为是指导免疫治疗的重要标记物。其原理为，TMB与基因组不稳定性以及新生抗原的产生高度相关，而新生抗原增多可以增强肿瘤的免疫原性，为免疫治疗提供肿瘤特异性靶点，因此TMB高的患者更有可能从免疫治疗中获益。由于tTMB检测对于组织样本的数量和质量要求较高，而晚期实体瘤患者尤其是多线治疗失败的患者中，有高达40-70％的情况是无法获取肿瘤组织或者组织样本不合格的，因此基于血液样本中循环肿瘤DNA(ctDNA)计算TMB(即blood-based TMB，bTMB)成为了免疫治疗领域广泛关注的焦点。
近期，国际肿瘤学知名期刊Nautre Medicine和JAMA Oncology先后报道了通过bTMB检测预测非小细胞肺癌患者接受免疫治疗疗效的研究。其中，Nature Medicine研究[Nat Med.2018Sep；24(9)：1441-1448.doi：10.1038/s41591-018-0134-3]为美国Foundaion Medcine，Inc与罗氏制药有限公司联合发表，其利用二代测序技术(nextgeneration sequencing，NGS)，通过394基因(覆盖1.1Mb编码区)FoundationOne CDxTM(F1CDx)panel针对POPLAR(NCT01903993)和OAK(NCT02008227)两项临床研究中患者的血液样本进行测序并计算bTMB。当bTMB≥16被定义为bTMB-高(bTMB-H)时，免疫治疗组对比多西他赛化疗组的PFS显著更优；而在bTMB-低(bTMB-L)的亚组中，两治疗组间的PFS无显著差异。在OAK验证集中，bTMB≥16同样可以预测PFS获益。发表于JAMA Oncology(JAMAOncol.2019Feb 28.doi：10.1001/iamaoncol.2018.7098.)的研究由思路迪医学检验所完成。该研究利用NGS技术，通过覆盖150基因的NCC-GP150panel，针对50例中国非小细胞肺癌患者的血液样本进行测序并计算bTMB。当bTMB＝6定义为临界值时，免疫治疗组内的bTMB-H人群对比bTMB-L人群，ORR和PFS均显著改善。相关现有的bTMB计算方法已经分别于文献NatMed.2018Sep；24(9)：1441-1448.doi：10.1038/s41591-018-0134-3和JAMAOncol.2019Feb28.doi：10.1001/jamaoncol.2018.7098中公开。然而在以上两项研究中，bTMB状态均与OS无关，无法预测OS获益。由于OS是评价肿瘤药物疗效的金标准，且显著改善OS也是免疫治疗区别于其他治疗方式的亮点，因此现有的bTMB计算方法并不能满足临床需求。
发明内容
本发明针对以上问题，首次发现了影响bTMB预测效能的因素为ctDNA含量(以maximum somatic allele frequency-MSAF表示)，并针对bTMB算法进行校正，重新定义了bTMB-Low allele ffequency-bTMB(LAF-bTMB)。因此，本发明提供了新的bTMB生物标记，将所述bTMB生物标记命名为LAF-bTMB。无论在免疫治疗对比化疗组间还是在免疫治疗组内，使用LAF-bTMB方法均可准确预测OS以及PFS获益。
为解决现有bTMB计算方法不能有效预测肿瘤患者接受免疫治疗OS获益的缺陷，本发明的目的是提供一种新的bTMB(LAF-bTMB)及其测定方法，本发明的LAF-bTMB生物标记和测定方法可排除血液中影响bTMB预测效能的干扰因素，准确筛选能够从免疫治疗中获得OS及PFS获益的人群，有效指导免疫治疗，满足肿瘤患者的临床需求。为实现以上目的，本发明可以包括下述一种或多种技术方案。
1.一种bTMB生物标记，其中所述bTMB生物标记如下获得：
从受试者的血液样品中获得游离DNA(cfDNA)，
测定测序碱基上的体细胞突变数，
将低等位基因丰度的体细胞突变数作为所述bTMB生物标记，表示为LAF-bTMB，其中所述低等位基因丰度是指等位基因频率小于例如25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.3％-25％之间，优选小于例如13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.5％-13％，尤其优选小于6.5％，6％，5.5％，5％，4.5％，4％，3.5％，3％，2.5％，其中根据样品测定区域变异总数计算LAF-bTMB。
2.项目1所述的bTMB生物标记，其中将所述cfDNA进行片段化处理，得到片段长度为例如100-1000bp，例如100-500bp，例如200-300bp。
3.项目1或2所述的bTMB生物标记，其中体细胞突变数量包括1)单核苷酸变体(SNV)数，2)INDEL突变数，3)FUSION(融合)，和/或4)FRAMESHIFT(移码)数。
4.项目1-3任一项所述的bTMB生物标记，其中体细胞突变数量包括1)单核苷酸变体(SNV)数和2)INDEL突变数。
5.项目1-4任一项所述的bTMB生物标记，其中测序碱基在约100kb至约10Mb之间，例如0.8-2.4Mb，例如0.8Mb-1.2Mb，例如1.1Mb，例如1.2Mb。
6.项目1-4任一项所述的bTMB生物标记，其中通过思路迪NCC-GP150、思路迪OK伴侣、思路迪OK伴侣无创版、吉因加OncoD-C1021、世和基因世和一号、燃石医学OncoscreenPlusTM、拓普基因洛氏伐Target、MSKCC-IMPACT、FoundationOneCDx、FoundationACT、Guardant360、GuradantOMNI、PlasmaSELECT64、Caris Molecular Intelligence、IlluminaTruSight500gene panel、Thermo Fisher Scientific Oncomine Tumor Mutation LoadAssay、NEO New Oncology NEOplus v2RUO、TruSight Tumor 170、QIAGEN GeneReadDNAseq Comprehensive Cancer Panel、NEO New Oncology NEOplus覆盖的基因组计算LAF-bTMB。
7.项目1-6任一项所述的bTMB生物标记，其中来自所述样品的LAF-bTMB在1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
8.项目1-7任一项所述的bTMB生物标记，其中所述受试者为癌症患者或怀疑患有癌症的受试者，所述癌症例如为实体瘤，例如为肾上腺癌、甲状腺癌、胃癌、肛门癌、阑尾癌症、结直肠癌、小肠癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、胆囊癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌阴道癌、食管癌、头颈癌(口腔癌、咽喉癌、鼻咽癌等)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑色素瘤、中皮瘤、神经内分泌肿瘤、皮肤癌(黑色素瘤、默克细胞癌、基底细胞癌)、中枢神经系统肿瘤(脑癌、脊柱癌)、软组织肉瘤，例如为获批免疫检查点抑制剂药物适应症的癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、胃癌及胃食管交界处腺癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌dMMR/MSI-H实体瘤、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌。
9.项目1-8任一项所述的bTMB生物标记，其还包括参比LAF-bTMB，所述参比LAF-bTMB包括下述一种或多种：组织肿瘤突变负荷(tTMB)、来自参比受试者的LAF-bTMB，包括例如健康对照、患有癌症的受试者、已经采用免疫治疗如PD-1/PD-L1抗体治疗的受试者。
10.一种测定bTMB生物标记的试剂盒，其包括用于确定项目1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂。
11.一种测定项目1-9任一项所述的bTMB生物标记的方法，所述方法包括从受试者的血液样品中获得游离DNA(cfDNA)，测定测序碱基上的体细胞突变数，和测定低等位基因丰度的体细胞突变数，作为所述bTMB生物标记，表示为LAF-bTMB；任选地来自受试者的样品和参比样品平行进行高通量测序，并将测序数据进行比对。
12.项目1-9任一项所述的bTMB生物标记和/或确定项目1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂在制备鉴定剂或试剂盒中的用途，所述鉴定剂或试剂盒1)用于鉴定能够受益于免疫治疗的患者，2)用于鉴定患有癌症的受试者的预后，3)用于鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或4)用于鉴定对免疫治疗的反应性。
13.项目12所述的用途，其中所述免疫治疗包括例如免疫检查点抑制剂治疗，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3拮抗剂治疗，例如抗体治疗，例如抗PD-1抗体纳武单抗(Nivolumab)、派母单抗(Pembrolizumab)、Cemiplimab、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Sintilimab)，抗PD-1抗体Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab，以及抗CTLA-4抗体依匹木单抗(Ipilimumab)等的治疗，例如下述抗PD-1/PD-L1：Tislelizumab，Camrelizumab，Spartalizumab，CS-1003，BI-754091，KN035，AK-103，AK-105，Genolimzumab，INCB-086550，TSR-042，AGEN-2034，MGA-012，SG-001，MEDI-0680，AB-122，Sym-021，STW-204，BAT-1306，IBI-318，SCT-I10A，PF-06801591，RB-0004，JTX-4014，CMA8819，CX-188，GLS-010，LZM-009，例如抗LAG-3抗体BMS-986016，例如抗TIM-3抗体RO7121661，或多特异性抗体，例如AK104(抗PD-1/CTLA-4)、MEDI-5752(抗PD-1/CTLA-4)、CA170(抗PD-L1/VISTA)，SL-279252(抗PD-1/OX40L)，XmAb20717(抗PD-1/CTLA-4)，MGD-019(抗PD-1/CTLA-4)，MGD-013(抗PD-1/LAG-3)。
14.项目12或13所述的用途，其中LAF-bTMB高于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为能够受益于免疫治疗的患者，LAF-bTMB低于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为较少受益于免疫治疗的患者，其中所述临界值包括例如1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
15.项目12-14任一项所述的用途，其中所述患者的无进展生存期(PFS)延长、总生存期(OS)延长和/或客观反应率(ORR)增加。
16.项目12-15任一项所述的用途，其中来自所述患者的肿瘤中检测到PD-L1表达。
17.项目12-16任一项所述的用途，其中还可以对所述患者施用另外的治疗剂，包括例如抗肿瘤剂，化学治疗剂，生长抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法或细胞毒剂。
18.一种用于鉴定患有癌症受试者的试剂盒，用于确定项目1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂，任选地包括使用所述试剂鉴定能够受益于免疫治疗的患者的说明书，其中LAF-bTMB高于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为能够受益于免疫治疗的患者，LAF-bTMB低于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为较少受益于免疫治疗的患者，其中所述临界值包括例如1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
19.一种装置，所述装置1)用于测定项目1-9任一项所述的bTMB生物标记；2)用于鉴定能够受益于免疫治疗的患者，3)用于鉴定患有癌症的受试者的预后，4)用于鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或5)用于鉴定对免疫治疗的反应性，
所述装置包括：
处理器；
存储器，其上存储有指令，所述指令在由所述处理器执行时使得所述处理器执行根据项目11所述的方法，和任选地执行下述步骤：基于测定的LAF-bTMB，鉴定能够受益于免疫治疗的患者，鉴定患有癌症的受试者的预后，鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或鉴定对免疫治疗的反应性。
20、一种存储指令的计算机可读存储介质，所述指令在由处理器执行时使得所述处理器执行根据项目11所述的方法，和任选地执行下述步骤：基于测定的LAF-bTMB，鉴定能够受益于免疫治疗的患者，鉴定患有癌症的受试者的预后，鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或鉴定对免疫治疗的反应性。
本发明人发现导致bTMB与tTMB预测效能差异的潜在因素来源于血液样本本身。在技术层面上，血液中ctDNA突变的检出依赖于从肿瘤细胞释放到血液中的ctDNA的含量，通常用MSAF来表示，即MSAF越高，检测出ctDNA变异的可能性越大，bTMB水平也随之越高。然而既往研究显示，MSAF越高的患者，其肿瘤负荷也越高，免疫治疗疗效越差。因此，虽然bTMB-H的患者理论上新生抗原更多，免疫治疗疗效更好，但是由于其MSAF水平更高，肿瘤负荷更大，预后更差，从而抵消了这部分患者从免疫治疗中的获益，导致bTMB无法有效预测免疫治疗的疗效。本发明因此提供了排除MSAF影响的bTMB计算方法，以改善其预测免疫治疗疗效的效能。
本发明人已发现MSAF干扰bTMB预测准确性的机制。为了检验bTMB和MSAF之间的关系，首先从https://clinicalstudydatarequest.com/获取POPLAR和OAK两项临床研究的数据(以下简称POPLAR和OAK队列)。由于两项研究的数据一致性非常高，因此将其合并绘制热图(图1)。当MSAF升高时，高丰度的突变数量上升，而低丰度的突变数量未上升，提示根据现有计算方法得到的bTMB可分解为低丰度突变负荷(LAF-bTMB)和高丰度突变负荷(HAF-bTMB)两个部分，且HAF-bTMB可能比LAF-bTMB更容易受到MSAF水平的干扰。
在Pearson相关性分析中，MSAF与HAF-bTMB之间的相关性随着突变丰度的降低而升高，同时MSAF与LAF-bTMB之间的相关性随着突变丰度的降低而下降。当突变丰度在1％-80％的区间内，以0.5％为间隔，逐个检验每一个突变丰度作为临界值时，MSAF分别与HAF-bTMB以及LAF-bTMB的相关性。发现当突变丰度为5％时，MSAF与HAF-bTMB的相关性系数r＝0.648630203，接近最高值；而MSAF与LAF-bTMB的相关系数r＝0.089823966，接近最低值。当突变丰度为4.5％时，MSAF与HAF-bTMB的相关系数近一步升高r＝0.0.651227；而MSAF与LAF-bTMB的相关系数进一步降低r＝0.072094574，接近不相关(图2)。因此，以等位基因丰度4.5％为临界值，将bTMB划分为HAF-bTMB(突变丰度＞4.5％)和LAF-bTMB(突变丰度≤4.5％)两个部分时，两部分各自与MSAF之间的相关性差异最大，而采用突变丰度临界值为5％时比4.5％差异要小：其中HAF-bTMB与MSAF高度相关，而LAF-bTMB则与MSAF几乎不相关，因此MSAF水平主要通过影响HAF-bTMB部分来干扰bTMB的预测效能。而且以突变丰度4.5％作为临界值定义LAF-bTMB对比以5％作为临界值，受到MSAF的干扰更低。在一些实施方案中，通过统计患者的测序结果中基因丰度≥0.5％并且≤5％的体细胞突变的数量，计算所述患者的LAF-bTMB数值。在一些实施方案中，通过统计患者的测序结果中基因丰度≥0.3％并且≤5％的体细胞突变的数量，计算所述患者的LAF-bTMB数值。在一些优选实施方案中，通过统计患者的测序结果中基因丰度≥0.5％并且≤4.5％的体细胞突变的数量，计算所述患者的LAF-bTMB数值。在一些优选实施方案中，通过统计患者的测序结果中基因丰度≥0.3％并且≤4.5％的体细胞突变的数量，计算所述患者的LAF-bTMB数值。在一些实施方案中，体细胞突变数量包括1)单核苷酸变体(SNV)数，2)INDEL突变数，3)FUSION(融合)，和/或4)FRAMESHIFT(移码)数。在一些实施方案中，突变计算时纳入同义突变。在一些实施方案中，突变优选包括1)单核苷酸变体(SNV)数和2)INDEL突变数，已经发现由此计算的LAF-bTMB与常规bTMB相比具有优异的预测效能，尤其能够准确筛选能够从免疫治疗中获益的人群。
经过POPLAR和OAK合并队列验证，HAF-bTMB人群中，排序在前25％的患者其MSAF水平以及死亡风险均显著高于排序在后75％的患者(无论接受免疫治疗或化疗)(图3)，证明HAF-bTMB是负向预后因子，验证了本发明人关于HAF-bTMB是抵消免疫治疗获益的主导因素的设想。因此，本发明人提出，LAF-bTMB可能是预测免疫治疗疗效的更为有效的方法。
有益效果
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
本发明提供的重新定义的bTMB和相关测定方法，其中只纳入本发明定义的突变等位基因丰度(例如≤4.5％或≤5％)的LAF-bTMB部分。由于排除了与MSAF水平高度相关的HAF-bTMB部分，摒除了来自MSAF水平以及肿瘤负荷的干扰。重新定义的LAF-bTMB方法可以将按照现有计算方法被划分为bTMB-H却不能从免疫治疗中获益的患者，以及按照现有计算方法被划分为bTMB-L却可以从免疫治疗中获益的患者筛选出来，并重新归类，使其接受适宜的疗法。从而能够有效预测免疫治疗疗效，包括PFS和OS，克服了现有bTMB的不足。
附图说明
图1：描绘突变等位基因丰度以及bTMB随着MSAF水平变化的分布趋势的热图。其中横轴为MSAF，纵轴为bTMB。
图2：在不同的突变丰度临界值下，MSAF与LAF-bTMB及HAF-bTMB之间的相关性。其中横轴为突变丰度临界值，纵轴为MSAF与bTMB的相关性。
图3：POPLAR&OAK合并人群中，HAF-bTMB排序在前25％的患者与排序在后75％的患者的MSAF水平对比(A)，以及死亡风险对比(B)。
图4：POPLAR&OAK合并人群中，不同LAF-bTMB临界值与PFS(A)及OS(B)风险比之间关系的森林图。
图5：POPLAR&OAK合并人群中，当以4.5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，治疗组内以及免疫对比化疗组间，LAF-bTMB与OS和PFS获益的关系。在免疫治疗组(阿特珠单抗)或化疗组(多西他赛)内，LAF-bTMB≥12的亚组对比LAF-bTMB＜12的亚组OS(A)和PFS(B)生存曲线。LAF-bTMB≥12和＜12亚组各自接受免疫治疗(阿特珠单抗)对比化疗(多西他赛)的OS(C)和PFS(D)生存曲线。
图6：POPLAR&OAK合并人群中，当以5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，治疗组内以及免疫对比化疗组间，LAF-bTMB与OS和PFS获益的关系。在免疫治疗组(阿特珠单抗)或化疗组(多西他赛)内，LAF-bTMB≥12的亚组对比LAF-bTMB＜12的亚组OS(A)和PFS(B)生存曲线。LAF-bTMB≥12和＜12亚组各自接受免疫治疗(阿特珠单抗)对比化疗(多西他赛)的OS(C)和PFS(D)生存曲线。
图7：POPALR&OAK合并队列中，以4.5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，bTMB与LAF-bTMB的对比。A)Venn图给出肿瘤突变负荷状态为bTMB-H和LAF-bTMB-H的患者之间的重合；B)bTMB-L/LAF-bTMB-H患者接受免疫治疗(阿特珠单抗)对比化疗(多西他赛)的OS生存曲线；C)bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗对比化疗的OS生存曲线；D)bTMB-H/LAF-bTMB-H对比bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗的OS生存曲线；E)bTMB-H/LAF-bTMB-H对比bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗的PFS生存曲线。
图8：POPALR&OAK合并队列中，以5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，bTMB与LAF-bTMB的对比。A)Venn图给出肿瘤突变负荷状态为bTMB-H和LAF-bTMB-H的患者之间的重合；B)bTMB-L/LAF-bTMB-H患者接受免疫治疗(阿特珠单抗)对比化疗(多西他赛)的OS生存曲线；C)bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗对比化疗的OS生存曲线；D)bTMB-H/LAF-bTMB-H对比bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗的OS生存曲线；E)bTMB-H/LAF-bTMB-H对比bTMB-H/LAF-bTMB-L患者接受免疫治疗的PFS生存曲线。
图9：NCC队列中，当以4.5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，免疫治疗组内，LAF-bTMB与OS及PFS获益的关系。A)LAF-bTMB与MSAF的相关性，横轴为MSAF，纵轴为LAF-bTMB；B)表示不同LAF-bTMB临界值与OS风险比之间关系的森林图；C)LAF-bTMB＜7和LAF-bTMB≥7亚组分别接受免疫治疗后的OS生存曲线；D)表示不同LAF-bTMB临界值与PFS风险比之间关系的森林图；E)LAF-bTMB＜7和LAF-bTMB≥7亚组分别接受免疫治疗后的PFS生存曲线；F)bTMB-H/LAF-bTMB-L和bTMB-H/LAF-bTMB-L患者分别接受免疫和资料后的OS生存曲线。
图10：NCC队列中，当以5％作为突变丰度临界值计算LAF-bTMB，免疫治疗组内，LAF-bTMB与OS及PFS获益的关系。A)LAF-bTMB与MSAF的相关性，横轴为MSAF，纵轴为LAF-bTMB；B)表示不同LAF-bTMB临界值与OS风险比之间关系的森林图；C)LAF-bTMB＜7和LAF-bTMB≥7亚组分别接受免疫治疗后的OS生存曲线；D)表示不同LAF-bTMB临界值与PFS风险比之间关系的森林图；E)LAF-bTMB＜7和LAF-bTMB≥7亚组分别接受免疫治疗后的PFS生存曲线；F)bTMB-H/LAF-bTMB-L和bTMB-H/LAF-bTMB-L患者分别接受免疫和资料后的OS生存曲线。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行说明：
实施例1
非小细胞肺癌患者接受免疫治疗对比化疗，以及免疫治疗组内，OS和PFS获益的预 测
bTMB检测数据以及患者临床病理数据来源
首先将POPLAR(NCT01903993，N＝211)和OAK(NCT02008227，N＝642)研究数据合并。POPLAR研究是一个II期随机对照研究，对比了未经PD-L1表达筛选的晚期或转移性非小细胞肺癌患者接受二/三线阿特珠单抗治疗和标准治疗多西他赛化疗的疗效。OAK研究是一个III期随机对照研究，对比了转移性非小细胞肺癌患者接受阿特珠单抗和多西他赛化疗的疗效。两项研究中的bTMB检测数据以及患者临床病理参数获取白https:// clinicalstudvdatarecluest.com/。
LAF-bTMB计算
每个患者的测序结果中等位基因丰度≥0.5％并且≤4.5％或≤5％的体细胞突变的数量的总和即为每一位患者的LAF-bTMB数值。突变类型包括SNV(单个核苷酸变化)，同时纳入同义突变。
统计学分析
使用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，并用Log-rank检验确定P值。使用Cox回归模型确定风险比(HR)。使用Mann-Whitney U检验对组间差异进行检验。在Cox回归模型中，同时纳入治疗方式，标记物和治疗方式与标记物的交互项，确定治疗方式和标记物的交互作用。所有P值均为双侧检验的，P＜0.05被认为是具有显著差异。所有分析均使用R3.4.2进行，所有附图均使用Graphpad Prism v6.0绘制。
LAF-bTMB状态预测非小细胞肺癌患者接受免疫治疗的疗效
POPLAR和OAK队列合并后，无论使用AF＝4.5％还是5％，整体人群的LAF-bTMB均为0～62，中位LAF-bTMB均为5。采用LAF-bTMB＝2、4、6、8、10、12、14、16、18为临界值，对其预测效能进行评估，发现当临界值为12时，LAF-bTMB对OS获益的预测效能最优(P＝0.007)(图4)(AF＝4.5％与AF＝5％的OS及PFS森林图趋势一致，图4仅给出了AF＝5％的森林图)。因此以LAF-bTMB＝12作为临界值，将患者分为LAF-bTMB-高(LAF-bTMB-H)和LAF-bTMB-低(LAF-bTMB-L)两个人群，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
当AF＝4.5％：
在免疫治疗组内，LAF-bTMB≥12的患者对比LAF-bTMB＜12的患者OS和PFS获益更显著(OS，HR，0.68，95％CI，0.50-0.93，P＝0.02；PFS，HR，0.61，95％CI，0,47-0.79P＜0.001)，而在化疗组中则无此趋势(OS，HR，1.19，95％CI，0.92-1.54，P＝0.19；PFS，HR，1.24，95％CI，0,98-1.58P＝0.07)(图5A、B)。此外，对于LAF-bTMB≥12的亚组，接受免疫治疗比接受化疗的OS和PFS获益更显著(OS，HR，0.42，95％CI，0.29-0.61，P＝0.007；PFS，HR，0.47，95％CI，0.34-0.66，P＜0.001)(图5C、D)。交互作用检验显示，在预测OS方面，LAF-bTMB≥12与治疗方式呈显著相关(P＝0.007)，在预测PFS方面，LAF-bTMB≥12与治疗方式呈显著相关(P＜0.001)。
当AF＝5％：
在免疫治疗组内，LAF-bTMB≥12的患者对比LAF-bTMB＜12的患者OS和PFS获益更显著(OS，HR，0.70，95％CI，0.52-0.95；P＝0.02；PFS，HR，0.62，95％CI，0.47-0.80；P＜0.001)，而在化疗组中则无此趋势(OS，HR，1.24，95％CI，0.96-1.59；P＝0.01；PFS，HR，1.29，95％CI，1.02-1.68；P＝0.03)(图6A、B)。此外，对于LAF-bTMB≥12的亚组，接受免疫治疗比接受化疗的OS和PFS获益更显著(OS，HR，0.42，95％CI，0.30-0.61，P＝0.006；PFS，HR，0.47，95％CI，0.34-0.66，P＜0.001)(图6C、D)。交互作用检验显示，在预测OS方面，LAF-bTMB≥12与治疗方式呈显著相关(P＝0.006)，在预测PFS方面LAF-bTMB≥12与治疗方式呈显著相关(P＜0.001)。
LAF-bTMB计算方法与现有bTMB计算方法预测效能的对比分析
当AF＝4.5％：
本发明人还将重新定义的LAF-bTMB计算方法与现有的bTMB计算方法进行直接对比。按照两种方法各自筛选出的LAF-bTMB-H(174人)和bTMB-H(223人)的患者中，有144人是重合的，即这144名患者使用两种计算方法确定的bTMB状态是吻合的(图7A)。有30名按照现有方法计算为bTMB-L的患者被重新界定为LAF-bTMB-H，这部分患者接受免疫治疗对比化疗的OS显著改善(HR，0.26；95％CI，0.09-0.76；P＝0.008)(图7B)。另有79名按照现有方法计算为bTMB-H的患者被界定为LAF-bTMB-L，这部分患者接受免疫治疗和化疗组间的OS无显著差异(HR，0.96；95％CI，0.59-1.57；P＝0.88)(图7C)。按照现有计算方法定义为bTMB-H的223名患者中，有103人接受了免疫治疗，其中62人被确认为LAF-bTMB-H(bTMB-H/LAF-bTMB-H)，而41人被重新定义为LAF-bTMB-L(bTMB-H/LAF-bTMB-L)。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线，发现bTMB-H/LAF-bTMB-H的患者接受免疫治疗后，无论OS还是PFS都显著优于bTMB-H/LAF-bTMB-L的患者(OS HR 0.31，95％CI，0.19-0.50；P＜0.001；PFS HR 0.37，95％CI，0.24-0.57；P＜.001)(图7D、E)。因此，LAF-bTMB方法能够比现有的bTMB方法更准确地筛选适宜免疫治疗的患者。
当AF＝5％：
本发明人还将重新定义的LAF-bTMB计算方法与现有的bTMB计算方法进行直接对比。按照两种方法各自筛选出的LAF-bTMB-H(181人)和bTMB-H(223人)的患者中，有149人是重合的，即这149名患者使用两种计算方法确定的bTMB状态是吻合的(图8A)。有32名按照现有方法计算为bTMB-L的患者被重新界定为LAF-bTMB-H，这部分患者接受免疫治疗对比化疗的OS显著改善(HR，0.29；95％CI，0.11-0.79；P＝0.01)(图8B)。另有74名按照现有方法计算为bTMB-H的患者被界定为LAF-bTMB-L，这部分患者接受免疫治疗和化疗组间的OS无显著差异(HR，1.02；95％CI，0.62-1.68；P＝0.95)(图8C)。按照现有计算方法定义为bTMB-H的223名患者中，有103人接受了免疫治疗，其中64人被确认为LAF-bTMB-H(bTMB-H/LAF-bTMB-H)，而39人被重新定义为LAF-bTMB-L(bTMB-H/LAF-bTMB-L)。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线，发现bTMB-H/LAF-bTMB-H的患者接受免疫治疗后，无论OS还是PFS都显著优于bTMB-H/LAF-bTMB-L的患者(OS HR 0.31，95％CI，0.19-0.50；P＜0.001；PFS HR 0.36，95％CI，0.23-0.55；P＜.001)(图8D、E)。因此，LAF-bTMB方法能够比现有的bTMB方法更准确地筛选适宜免疫治疗的患者。
本实施例说明：①LAF-bTMB方法可以有效指导临床上免疫治疗对比化疗药物的选择，以及针对免疫治疗药物的适宜患者的选择；②重新定义的LAF-bTMB方法可以将按照现有计算方法被划分为bTMB-H却不能从免疫治疗中获益的患者，以及按照现有计算方法被划分为bTMB-L却可以从免疫治疗中获益的患者筛选出来，并重新归类，使其接受适宜的疗法。③以突变丰度4.5％作为临界值定义LAF-bTMB对比以5％作为临界值，受到MSAF的干扰更低。采用突变丰度4.5％或突变丰度5％时可以获得一致性的优异的预测效能。因此，本发明提供了比现有bTMB计算方法更为精准有效的免疫治疗疗效预测的方法。以突变丰度4.5％和5％作为临界值
实施例2
LAF-bTMB指导中国非小细胞肺癌患者人群免疫治疗
病患招募
从2016年8月1日至2018年1月1日，在中国医学科学院肿瘤医院以及北京协和医院招募64例接受一/二/三线免疫治疗(anti-PD-1/PD-L1)的晚期非小细胞肺癌患者。此项研究获得所有参与单位的伦理委员会批准。所有入组患者在研究开始前都签署了知情同意书。所招募的患者以下称为NCC队列。
bTMB检测与LAF-bTMB计算
bTMB的检测方法已于文献JAMA Oncol.2019Feb 28.doi：10.1001/jamaoncol.2018.7098中公开。检测所用的panel为覆盖150个基因的NCC-GP150，也已于文献JAMAOncol.2019Feb 28.doi：10.1001/jamaoncol.2018.7098中公开，样本提取及检测操作流程由思路迪医学检验所进行。思路迪医学检验所已获得美国病理家协会(College ofAmerican Pathologists，CAP)认证。简要地，提取血浆中游离的DNA(cfDNA)，使用30-60ngcfDNA建立基因文库。利用基因特异性DNA探针识别并捕获样本中的目标基因，将靶向捕获的基因文库上样到NextSeq 500(Illumina)进行75bp双端测序。靶向测序的度为4000-5000×。使用ctDNA突变识别(ctDNA variant-calling)方法检测bTMB，通过内置的数字条形码标记单个DNA分子。ctDNA突变识别流程根据来源于BWA Aligner的基因映射信息进行。
每个患者的测序结果中等位基因丰度≥0.5％并且≤5％的体细胞突变的数量的总和即为每一位患者的LAF-bTMB数值。突变类型包括SNV和INDEL，并纳入同义突变。
临床疗效评估标准
PFS定义为自开始接受免疫治疗药物至疾病进展或任何原因所导致死亡的时间。OS定义为自开始接受免疫治疗药物至任何原因所导致死亡的时间。疾病进展的评估遵从实体肿瘤的疗效评价标准1.1版(RECIST v1.1)中所公布的标准。
统计学分析
使用Pearson相关性系数检验LAF-bTMB与MSAF之间的相关性。使用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，并用Log-rank检验确定P值。使用Cox比例风险回归模型确定风险比(HR)。使用Mann-Whitney U检验对组间差异进行检验。通过未分层的Cox比例回归模型进行交互作用检验确定P值，纳入了治疗方式、根据生物标记物划分的亚组、以及根据该亚组所选择的治疗方式之间的相互作用。所有P值均为双侧检验的，P＜0.05被认为是具有显著差异。所有分析均使用R 3.4.2进行，所有附图均使用Graphpad Prism v6.0绘制。
NCC队列中LAF-bTMB预测免疫治疗疗效
在NCC队列中，无论AF＝4.5％或5％为临界值界定LAF-bTMB，整体人群的LAF-bTMB范围均为0～16，而中位LAF-bTMB则分别为3.5和4。MSAF与LAF-bTMB的Pearson相关性系数则分别为可r＝0.00777881739083776和r＝0.0218128402552258(图9A、10A)。
当AF＝4.5％：
当采用LAF-bTMB＝2、3、4、5、6、7、8、9为临界值分析OS风险比时，发现当LAF-bTMB＝7时，不同LAF-bTMB状态人群的OS以及PFS之间的风险比同时具有统计学显著性差异(图9B、D)。LAF-bTMB≥7的人群中接受免疫治疗的OS以及PFS获益显著优于LAF-bTMB＜7人群(OS，HR，0.20；95％CI，0.05-0.84；P＝0.01；PFS，HR，0.22；95％CI，0.09-0.57；P＝0.0006)(图9C、E)。此外，按照现有计算方法以及LAF-bTMB方法被定义为bTMB-H/LAF-bTMB-H的患者，其接受免疫治疗的OS获益显著优于bTMB-H/LAF-bTMB-L的患者(HR，0.16；95％CI，0.04-0.72；P＝.007)(图9F)。
当AF＝5％：
当采用LAF-bTMB＝2、3、4、5、6、7、8、9为临界值分析OS风险比时，发发现当LAF-bTMB＝7时，不同LAF-bTMB状态人群的OS以及PFS之间的风险比同时具有统计学显著性差异(图10B、D)。LAF-bTMB≥7的人群中接受免疫治疗的OS以及PFS获益显著优于LAF-bTMB＜7人群(OS，HR，0.20；95％CI，0.05-0.84；P＝0.02；PFS，HR，0.30；95％CI，0.13-0.70；P＝0.003)(图10C、E)。此外，按照现有计算方法以及LAF-bTMB方法被定义为bTMB-H/LAF-bTMB-H的患者，其接受免疫治疗的OS获益显著优于bTMB-H/LAF-bTMB-L的患者(HR，0.16；95％CI，0.04-0.72；P＝.007)(图10F)。
本实施例进一步在中国非小细胞肺癌患者人群中验证了重新定义的LAF-bTMB和相关测定方法可以准确筛选能够从免疫治疗中获益的人群。本发明显示以突变丰度4.5％作为临界值定义LAF-bTMB对比以5％作为临界值，受到MSAF的干扰更低，采用突变丰度4.5％或突变丰度5％时可以准确筛选能够从免疫治疗中获益的人群。因此，本发明提供了一种更为精准有效的免疫治疗疗效预测的方法。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种bTMB生物标记，其中所述bTMB生物标记如下获得：
从受试者的血液样品中获得游离DNA(cfDNA)，
测定测序碱基上的体细胞突变数，
将低等位基因丰度的体细胞突变数作为所述bTMB生物标记，表示为LAF-bTMB，其中所述低等位基因丰度是指等位基因频率小于例如25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.3％-25％之间，优选小于例如13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，例如在0.5％-13％，尤其优选小于6.5％，6％，5.5％，5％，4.5％，4％，3.5％，3％，2.5％，其中根据样品测定区域变异总数计算LAF-bTMB。
2.权利要求1所述的bTMB生物标记，其中将所述cfDNA进行片段化处理，得到片段长度为例如100-1000bp，例如100-500bp，例如200-300bp。
3.权利要求1或2所述的bTMB生物标记，其中体细胞突变数量包括1)单核苷酸变体(SNV)数，2)INDEL突变数，3)FUSION(融合)，和/或4)FRAMESHIFT(移码)数。
4.权利要求1-3任一项所述的bTMB生物标记，其中体细胞突变数量包括1)单核苷酸变体(SNV)数和2)INDEL突变数。
5.权利要求1-4任一项所述的bTMB生物标记，其中测序碱基在约100kb至约10Mb之间，例如0.8-2.4Mb，例如0.8Mb-1.2Mb，例如1.1Mb，例如1.2Mb。
6.权利要求1-4任一项所述的bTMB生物标记，其中通过思路迪NCC-GP150、思路迪OK伴侣、思路迪OK伴侣无创版、吉因加OncoD-C1021、世和基因世和一号、燃石医学OncoscreenPlusTM、拓普基因洛氏伐Target、MSKCC-IMPACT、FoundationOneCDx、FoundationACT、Guardant360、GuradantOMNI、PlasmaSELECT64、Caris Molecular Intelligence、IlluminaTruSight500gene panel、Thermo Fisher Scientific Oncomine Tumor Mutation LoadAssay、NEO New Oncology NEOplus v2RUO、TruSight Tumor170、QIAGEN GeneRead DNAseqComprehensive Cancer Panel、NEO New Oncology NEOplus覆盖的基因组计算LAF-bTMB。
7.权利要求1-6任一项所述的bTMB生物标记，其中来自所述样品的LAF-bTMB在1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
8.权利要求1-7任一项所述的bTMB生物标记，其中所述受试者为癌症患者或怀疑患有癌症的受试者，所述癌症例如为实体瘤，例如为肾上腺癌、甲状腺癌、胃癌、肛门癌、阑尾癌症、结直肠癌、小肠癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、胆囊癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌阴道癌、食管癌、头颈癌(口腔癌、咽喉癌、鼻咽癌等)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑色素瘤、中皮瘤、神经内分泌肿瘤、皮肤癌(黑色素瘤、默克细胞癌、基底细胞癌)、中枢神经系统肿瘤(脑癌、脊柱癌)、软组织肉瘤，例如为获批免疫检查点抑制剂药物适应症的癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、胃癌及胃食管交界处腺癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌dMMR/MSI-H实体瘤、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌。
9.权利要求1-8任一项所述的bTMB生物标记，其还包括参比LAF-bTMB，所述参比LAF-bTMB包括下述一种或多种：组织肿瘤突变负荷(tTMB)、来自参比受试者的LAF-bTMB，包括例如健康对照、患有癌症的受试者、已经采用免疫治疗如PD-1/PD-L1抗体治疗的受试者。
10.一种测定bTMB生物标记的试剂盒，其包括用于确定权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂。
11.一种测定权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记的方法，所述方法包括从受试者的血液样品中获得游离DNA(cfDNA)，测定测序碱基上的体细胞突变数，和测定低等位基因丰度的体细胞突变数，作为所述bTMB生物标记，表示为LAF-bTMB；任选地来自受试者的样品和参比样品平行进行高通量测序，并将测序数据进行比对。
12.权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记和/或确定权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂在制备鉴定剂或试剂盒中的用途，所述鉴定剂或试剂盒1)用于鉴定能够受益于免疫治疗的患者，2)用于鉴定患有癌症的受试者的预后，3)用于鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或4)用于鉴定对免疫治疗的反应性。
13.权利要求12所述的用途，其中所述免疫治疗包括例如免疫检查点抑制剂治疗，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3拮抗剂治疗，例如抗体治疗，例如抗PD-1抗体纳武单抗(Nivolumab)、派母单抗(Pembrolizumab)、Cemiplimab、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Sintilimab)，抗PD-1抗体Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab，以及抗CTLA-4抗体依匹木单抗(Ipilimumab)等的治疗，例如下述抗PD-1/PD-L1：Tislelizumab，Camrelizumab，Spartalizumab，CS-1003，BI-754091，KN035，AK-103，AK-105，Genolimzumab，INCB-086550，TSR-042，AGEN-2034，MGA-012，SG-001，MEDI-0680，AB-122，Sym-021，STW-204，BAT-1306，IBI-318，SCT-I10A，PF-06801591，RB-0004，JTX-4014，CMA8819，CX-188，GLS-010，LZM-009，例如抗LAG-3抗体BMS-986016，例如抗TIM-3抗体RO7121661，或多特异性抗体，例如AK104(抗PD-1/CTLA-4)、MEDI-5752(抗PD-1/CTLA-4)、CA170(抗PD-L1/VISTA)，SL-279252(抗PD-1/OX40L)，XmAb20717(抗PD-1/CTLA-4)，MGD-019(抗PD-1/CTLA-4)，MGD-013(抗PD-1/LAG-3)。
14.权利要求12或13所述的用途，其中LAF-bTMB高于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为能够受益于免疫治疗的患者，LAF-bTMB低于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为较少受益于免疫治疗的患者，其中所述临界值包括例如1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
15.权利要求12-14任一项所述的用途，其中所述患者的无进展生存期(PFS)延长、总生存期(OS)延长和/或客观反应率(ORR)增加。
16.权利要求12-15任一项所述的用途，其中来自所述患者的肿瘤中检测到PD-L1表达。
17.权利要求12-16任一项所述的用途，其中还可以对所述患者施用另外的治疗剂，包括例如抗肿瘤剂，化学治疗剂，生长抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法或细胞毒剂。
18.一种用于鉴定患有癌症受试者的试剂盒，用于确定权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记的试剂，任选地包括使用所述试剂鉴定能够受益于免疫治疗的患者的说明书，其中LAF-bTMB高于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为能够受益于免疫治疗的患者，LAF-bTMB低于临界值和/或参比LAF-bTMB，将所述患者鉴定为较少受益于免疫治疗的患者，其中所述临界值包括例如1-100之间，例如1-80之间，例如4-18之间，优选例如7-12之间，例如2、4、6、8、10、12、14、16、18，优选例如12。
19.一种装置，所述装置1)用于测定权利要求1-9任一项所述的bTMB生物标记；2)用于鉴定能够受益于免疫治疗的患者，3)用于鉴定患有癌症的受试者的预后，4)用于鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或5)用于鉴定对免疫治疗的反应性，
所述装置包括：
处理器；
存储器，其上存储有指令，所述指令在由所述处理器执行时使得所述处理器执行根据权利要求11所述的方法，和任选地执行下述步骤：基于测定的LAF-bTMB，鉴定能够受益于免疫治疗的患者，鉴定患有癌症的受试者的预后，鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或鉴定对免疫治疗的反应性。
20.一种存储指令的计算机可读存储介质，所述指令在由处理器执行时使得所述处理器执行根据权利要求11所述的方法，和任选地执行下述步骤：基于测定的LAF-bTMB，鉴定能够受益于免疫治疗的患者，鉴定患有癌症的受试者的预后，鉴定患有癌症的受试者的疾病进展，和/或鉴定对免疫治疗的反应性。
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