CN110628927B - 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一方面提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，该方法通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定，其中，该gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；本发明的另一方面是提供伯克霍尔德菌属内“种”水平的一体化检测试剂盒，该试剂盒包括序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对。综上所述，本发明可用于药品、化妆品、食品安全质量控制中伯克霍尔德菌污染物的检测和鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及伯克霍尔德菌检测领域，具体涉及一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法。
背景技术
伯克霍尔德菌属(Burkholderia)是伯克氏菌科的一个属，为革兰阴性杆菌，其中洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)最为常见，该菌株存在范围广，可以促进生物膜的形成，是药品、化妆品和食品安全质量控制中的高风险污染物。
《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)是细菌分类鉴定的金标准，伯克霍尔德菌属共收载16个“种”的菌株信息，其中洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)、多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)、稳定伯克霍尔德菌(B.stabilis)、越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)等隶属于洋葱伯克霍尔德菌复合体(BurkholderiaCepacia Complex,BCC)，是目前的关注热点。BCC是伯克霍尔德菌属内一类表型近似，但在基因型上存在差异的菌群总称，由于此类菌株的表型极其相似，BCC无法通过常规的显微镜检、生化鉴定等表型鉴定手段鉴别区分，对于它们的分类学多基于基因型鉴定水平。由于伯克霍尔德菌属16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因序列的同源性高达98％～100％，导致以16S rRNA基因作为通用鉴定靶点的方法存在局限性，难以进行“种”水平的鉴定。
定位于基因组上的保守性、单拷贝功能基因序列是进行菌株“种”水平鉴定的良好靶点，其中以DNA促旋酶亚基B基因(DNA gyrase subunit B gene，gyrB gene)较为常见，以gyrB基因为靶点，开展短乳杆菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌、地衣芽孢杆菌、克罗诺杆菌等种属的鉴定和分类研究已被广泛报道，但未见其在伯克霍尔德菌属内菌株鉴定的相关研究。已公开的UP-1E/APrU引物对可以扩增gyrB基因片段，但扩增产物的长度约1000bp(较长)，不利于后续核酸测序结果的准确性；另外，该引物对中含有较多的兼并碱基(无法用作测序引物)，需要设计另外的测序引物进行核酸测序，操作不便。因此，目前在伯克霍尔德菌属内菌株鉴定上需要操作准确、简单和特异性强的扩增gyrB基因片段的引物对。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷，提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法。本发明在菌株获取量较少的情况下，收集整理gyrB基因特征参比序列，根据建立的DNA特征序列鉴定方法；设计制作伯克霍尔德菌属内“种”水平检测的一体化检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定；
其中，该gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。
进一步地，该检测方法包括如下步骤：
(1)提取实验菌株的基因组DNA；
(2)核酸扩增：配制扩增体系，在94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min的反应体系中进行扩增；
(3)核酸测序：配制扩增体系，将PCR产物纯化后进行单链扩增，纯化扩增产物后，按照核酸测序仪标准操作规程操作，上机测序；
(4)聚类分析：根据核酸序列比对算法的优化结果，选择统计学计算方式，采用邻接法构建NJ进化树(neighbor-joining tree)，聚类分析“属”内各个“种”之间的进化关系。
其中，步骤(2)和步骤(3)中的扩增所需的gyrB基因扩增引物对为：
gyrBF：5’-CCSACSGACGTGAAGATG-3’(SEQ ID No.1)；
gyrBR：5’-TCCACTGCATSGCGACTTC-3’(SEQ ID No.2)；
进一步地，步骤(2)所述的扩增体系包括：
进一步地，步骤(3)中的扩增体系包括：
进一步地，步骤(3)单链扩增的反应程序为：96℃1min，96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，4℃保温。
进一步地，步骤(3)中采用醋酸钠沉淀法或试剂盒法对单链扩增引物进行纯化。
进一步地，步骤(4)中的统计学计算方式选自Bootstrap Method(1000)、Kimura2-Parameter Model、Uniform Rates或Pairwise Deletion中的一种或几种。
本发明的第二方面是提供伯克霍尔德菌属内“种”水平鉴定的一体化检测试剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的gyrB基因扩增引物对。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明提供的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法以gyrB基因为靶点，设计引物并进行核酸序列水平的特异性评估，建立了属内“种”水平的鉴定方法；此外，本发明收集整理gyrB基因特征参比序列，经比对验证后作为今后“种”水平鉴定的判定依据。
附图说明
图1为本发明一实施例中Genbank数据库中收载伯克霍尔德菌属16S rRNA基因核酸序列NJ进化树状图；
图2为本发明一实施例中伯克霍尔德菌Ribotyping鉴定图谱；
图3为本发明一实施例中伯克霍尔德菌属16S rRNA基因序列鉴定NJ进化树状图；
图4为本发明一实施例中PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5为本发明一实施例中伯克霍尔德属gyrB基因DNA特征序列鉴定NJ进化树状图；
图6为本发明一实施例中伯克霍尔德属gyrB基因DNA特征序列鉴定NJ进化树状图。
具体实施方式
本发明提供一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，以gyrB基因为靶点，设计引物并进行核酸序列水平的特异性评估，建立了属内“种”水平的鉴定方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
以下涉及的实验菌株和主要仪器与试剂包括：
实验菌株：洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)、热带伯克霍尔德菌(B.tropica)、污染伯克霍尔德菌(B.contaminans)、乌拉姆伯克霍尔德菌(B.unamae)、含羞草结瘤伯克霍尔德菌(B.nodosa)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)购自北纳生物科技有限公司。
主要仪器：VITEK全自动微生物生化鉴定系统(法国Biomerieux公司)；RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统，及配套EcoR I试剂套装(美国DuPont公司)；ABI9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)；琼脂糖凝胶电泳仪及成像系统(美国BioRad公司)；MIR-254型培养箱(日本SANYO公司)；LABGARD型生物安全柜(美国NuAire公司)。
主要试剂：胰酪胨大豆琼脂平板(TSA，法国Biomerieux公司)；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、Premix TaqTM DNA聚合酶试剂盒(TAKARA，大连宝生物工程有限公司)；POP-7Ploymer、BDT V3.1 SEQ Buffer等核酸测序试剂(美国Lifetech公司)；其他化学试剂均为分析纯。
实施例1
本实施例一方面提供gyrB基因的特异性扩增引物，其序列为：
gyrBF：5’-CCSACSGACGTGAAGATG-3’；
gyrBR：5’-TCCACTGCATSGCGACTTC-3’。
该引物对的设计过程为：分别以伯克氏菌属菌株gyrB基因序列作为筛选条件，搜索Genbank数据库中相应的菌株序列信息，下载fasta文件，导入Mega7.0软件进行序列比对，获取核酸序列的保守区域和特异区域，以保守区域序列设计引物。
本实施例另一方面提供基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法，具体步骤如下：
1.提取实验菌株的基因组DNA。
2.核酸扩增
(1)配制扩增体系
(2)PCR扩增：设置PCR反应体系但不局限于：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min；4℃保存。
3.核酸测序
(1)配制扩增体系：PCR产物1μl、正向引物和反向引物(3.2pmol)各4μl、BigDye(2.5×)8μl、ddH2O 7μl；
(2)设置反应条件：96℃1min，96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，4℃保温；
(3)采用醋酸钠沉淀法或试剂盒(BigDyeXTerminator Purification Kit)法纯化步骤(2)得到的单链扩增产物后，按照核酸测序仪标准操作规程操作，上机测序。
4.聚类分析
根据核酸序列比对算法的优化结果，选择Bootstrap Method(1000)、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计学计算方式，采用邻接法构建NJ进化树(neighbor-joining tree)，聚类分析各个种属之间的进化关系。
由图4可知，参照UP-1E/APrU引物对，可以看出gryBF/gyrBR引物中含有的兼并碱基较少、扩增条件的耐用性更好、扩增效率较高；以该引物对扩增代表菌株gyrB基因特异性片段大小适宜、更有利于后续核酸序列测定。(其中，UP-1E/APrU引物对的序列如SEQ IDNo.3～SEQ ID No.4所示，
UP-1E：5’-CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA-3’(SEQ ID No.3)；
APrU：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA-3’(SEQ ID No.4))。
对比例1
本对比例提供现有数据库中16S rRNA基因序列特异性及鉴定水平评估。
1.伯克霍尔德菌鉴定16S rRNA基因序列的筛选
(1)收集整理《伯杰氏系统细菌学手册》中伯克霍尔德菌属内16个“种”的信息，共19条核酸序列(表1)。登录Genbank数据库，以菌株序列号为关键词检索对应菌株的核酸序列，下载fasta序列文件。收集整理Genbank公共数据库中克霍尔德属核酸参比序列(reference sequence)共42条，覆盖属内36个种，下载fasta序列文件。菌株信息如表2。
表1《伯杰氏系统细菌学手册》中收载伯克霍尔德菌属菌株信息表
表2 Genbank公共数据库中伯克霍尔德菌属菌株参比序列信息表
(2)将以上《伯杰氏系统细菌学手册》和Genbank数据库中获取的核酸序列合并后，导入Mega7.0序列分析软件，运行Align By Muscle程序，以Neighbor Joining ClusteringMethod方法进行序列比对；以Phylogeny功能，采用以下算法进行序列聚类，构建进化树，包括但不局限于：
1)系统发育计算法(Phylogeny test)：Bootstrap Method 1000；Interior-branch test；
2)替代模型(Substitution model)：Kimura 2-Parameter Model；p-distanceModel；
3)运算参数(Rases and patterns)：Uniform Rates；
4)使用的数据子集(Data subset to use)：Complete Deletion，PairwiseDeletion，Partial Deletion。
由图1可知，伯克霍尔德菌“属”内“种”间16S rRNA基因核酸序列的同源性较高，洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)、鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)、多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)、稳定伯克霍尔德菌(B.stabilis)、越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)等典型菌株的分辨率均较低；采用16S rRNA基因参比序列作为后续标准菌株和分离株DNA特征序列鉴定时，仅能精确鉴定至“属”的水平；在进行“种”水平的鉴定时，需借助其他特异性序列进行分析。
对比例2
本对比例提供传统的生化鉴定和Ribotyping核糖体分型鉴定方法鉴定伯克霍尔德菌属的实验菌株。
具体步骤包括：收集整理遗传信息确认的伯克霍尔德菌7株，分别采用VITEK生化鉴定和Ribotyping核糖体分型方法，对于收集的菌株进行多相分类鉴定，确认菌株遗传背景。
由表3可知，VITEK生化鉴定结果中，洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)、污染伯克霍尔德菌(B.contaminans)、越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)能够鉴定到“属”的水平；由于VITEK系统数据库的局限性，热带伯克霍尔德菌(B.tropica)、乌拉姆伯克霍尔德菌(B.unamae)、含羞草结瘤伯克霍尔德菌(B.nodosa)未获得明确的鉴定信息；
由图2可知，Ribotyping核糖体分型鉴定结果中，不同菌株的核糖体分型图谱各不相同，可聚类为两个分支，洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)和越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)聚类为一个支，污染伯克霍尔德菌(B.contaminans)、热带伯克霍尔德菌(B.tropica)、乌拉姆伯克霍尔德菌(B.unamae)、含羞草结瘤伯克霍尔德菌(B.nodosa)聚类为一个支，图谱鉴定结果显示：洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)可以鉴定到“种”的水平；热带伯克霍尔德菌(B.tropica)和乌拉姆伯克霍尔德菌(B.unamae)、未获得明确的鉴定信息；其他菌株均指向洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)，与菌种信息不一致，且鉴定图谱的相似度均小于0.80。
综上所述，传统的生化鉴定和Ribotyping核糖体分型鉴定均无法将伯克霍尔德菌属的菌株鉴定到“种”的水平。
表3伯克霍尔德菌属菌株多相分类鉴定结果统计表
对比例3
本对比例对伯克霍尔德菌属遗传背景确认的7种实验菌株16S rRNA基因核酸序列进行鉴定。
具体步骤包括：将遗传背景确认的菌株进行16S rRNA基因V1-V3区域核酸序列测定，将获得的核酸序列进行聚类分析。
由图3可知，洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)，热带伯克霍尔德氏菌(B.tropica)，污染伯克霍尔德氏菌(B.contaminans)等代表性菌株DNA特征序列区分度较小，依据此方法无法进行“种”水平鉴定与分类，需进一步采用其他特征核酸序列，确认最终的分类归属。
验证实施例
本验证实施例验证gyrB基因特征序列可用于试验菌株“种”水平的鉴定。
具体步骤包括：
(1)分别下载Genbank数据库中gyrB基因、recA基因和rpoD基因的核酸序列，采用Blast比对方法评估各鉴定靶点的序列特异性。结果表明：recA基因适用于洋葱伯克霍尔德菌群复合体的鉴定，但用于热带伯克霍尔德菌(B.tropica)、乌拉姆伯克霍尔德菌(B.unamae)、含羞草结瘤伯克霍尔德菌(B.nodosa)等菌株鉴定时，未找到通用的序列保守区设计核酸扩增和测序引物；rpoD基因也未找到适用于整个“属”水平的鉴定位点；综合评估核酸序列特异性、方法通用性等因素，选择gyrB基因序列用于伯克霍尔德菌属的鉴定。
(2)为扩大验证，进一步将遗传信息确认的7株伯克霍尔德菌gyrB基因特征序列、Genbank数据库中伯克霍尔德菌属中Burkholderiaglumae、Burkholderiaplantarii、Burkholderiadolosa、Burkholderiaambifaria、Burkholderiapyrrocinia等20个代表性菌株的gyrB基因特征序列一并导入Mega7.0软件，运行Align By Muscle程序，以NeighborJoining Clustering Method方法进行序列比对；进一步以Phylogeny功能，BootstrapMethod 1000、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建NJ进化树。
由图5可知，洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)、污染伯克霍尔德氏菌(B.contaminans)、热带伯克霍尔德氏菌(B.tropica)、乌拉姆伯克霍尔德氏菌(B.unamae)和含羞草结瘤伯克霍尔德氏菌(B.nodosa)均与各自的参考序列聚类为一个支。
由图6可知，所有代表性菌株的核酸序列均各自聚类为一个支。
综上所述，gyrB基因特征序列适用于伯克霍尔德菌属内“种”水平的鉴定。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市食品药品检验所
<120> 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> gyrBF
<400> 1
ccsacsgacg tgaagatg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> gyrBR
<400> 2
tccactgcat sgcgacttc 19
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> UP-1E
<400> 3
caggaaacag ctatgaccay gsnggnggna arttyra 37
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> APrU
<400> 4
tgtaaaacga cggccagtgc nggrtcytty tcytgrca 38
Claims (5)
1.一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌鉴定方法，所述方法为非疾病诊断目的，其特征在于，通过扩增伯克霍尔德菌的gyrB基因对伯克霍尔德菌进行属内“种”水平的鉴定；
其中，所述gyrB基因的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；
所述伯克霍尔德菌鉴定方法包括步骤：
（1）提取实验菌株的基因组DNA；
（2）核酸扩增：配制扩增体系，在94℃ 3 min；94℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 5 min的反应体系中进行扩增；
（3）核酸测序鉴定：配制扩增体系，将PCR产物纯化后进行扩增，纯化扩增产物后，按照核酸测序仪标准操作规程操作，上机测序；
（4）聚类分析：根据核酸序列比对算法的优化结果，选择统计学计算方式，采用邻接法构建NJ进化树，聚类分析“属”内各个“种”之间的进化关系；
步骤（2）所述的扩增体系包括：
Premix缓冲液 10μl
基因组DNA模板 0.5μl
正向引物 0.25μl
反向引物 0.25μl
ddH2O 9μl；
步骤（3）中所述的扩增体系包括：
PCR产物 1μl
正向引物 4μl
反向引物 4μl
BigDye缓冲液 8μl
ddH2O 7μl。
2.根据权利要求1所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌鉴定方法，其特征在于，步骤(3)扩增的反应程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，4℃保温。
3.根据权利要求1所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中采用醋酸钠沉淀法或试剂盒法对扩增产物进行纯化。
4.根据权利要求1所述的一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌鉴定方法，其特征在于，步骤(4)所述的统计学计算方式选自Bootstrap Method、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates或Pairwise Deletion中的一种或几种。
5.伯克霍尔德菌属内“种”水平鉴定的一体化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.2所示的gyrB基因扩增引物对，且按照如权利要求1-4任一项所述的基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌鉴定方法进行操作。
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