CN106701914A

CN106701914A - 一种基于dna条形码的细菌核酸测序鉴定方法

Info

Publication number: CN106701914A
Application number: CN201610984864.0A
Authority: CN
Inventors: 冯震; 杨美成; 李芳�; 李琼琼; 杨燕; 洪小栩; 许华玉; 刘浩
Original assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Current assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，能够高效准确地鉴定药品生产环境中常见细菌污染物，包括步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；步骤四，提取并纯化PCR产物；步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。

Description

一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种核酸测序鉴定方法，尤其涉及一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法。

背景技术

16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)是细菌系统分类学研究中最常用的分子标记，全长约1500bp左右，包含9个可变区(Variable Region,V区)和10个恒定区(Constant Region,C区)，在结构与功能上具有高度保守性，适用于进化距离不同的各类细菌亲缘关系研究。随着药品生产质量规范(GMP2010)和国家药品质量标准的提升，药品生产和质量控制中对于微生物鉴定的要求越来越高，如美国注射剂协会技术指南(ParenteralDrug Association Technical Report，PDA TR)中要求，ISO5或6级(A/B)区中所有超警戒限或纠偏限度的分类菌株，包括原料、辅料、制剂、环境和水等，对于分离到的微生物应鉴定到“种”的水平；《中国药典》2015年版四部微生物检查法及指导原则中要求，对于药品中的检出微生物，需采用适宜的方法技术手段进行鉴定。目前，以16S rRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究(16S rRNA gene sequenceanalysis for bacterial identification in the clinical laboratory.RinshoByori.2013Dec；61(12):1107-15；The use of molecular techniques based onribosomal RNA and DNAfor rumen microbial ecosystem studies:a review.Mol BiolRep.2008Jun；35(2):265-74.)，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道；以16S rRNA核酸测序方法进行微生物鉴定的文献中，所选取的测序靶点和测序引物各异(Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.JMicrobiol Methods.2003Dec；55(3):541-55；Identification of bacteria through 16SrRNA sequencing:principles,methods and applications in clinicalmicrobiology.Enferm Infecc Microbiol Clin.2004Apr；22(4):238-45.)，符合药品质量控制要求的具有鉴定和分类意义的DNA条形码核酸序列片段尚不清晰明确；现有研究中的核酸测序结果多数是通过Blast分析法与Genebank数据库中的核酸序列进行比对，对于测序结果的质量核查和Genebank数据库中序列信息的准确性关注度较小，测序结果的判定依据尚不规范统一。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，能够高效准确地鉴定药品生产环境中常见细菌污染物。

本研究在广泛查阅《美国药典》、《欧洲药典》、《日本药典》等国内外药品质量标准、《伯杰氏系统细菌学手册》和国内外权威参考文献的基础上，确立了以细菌16S rRNA为基础的核酸测序鉴定技术方案。

通过比较药品生产环境中葡萄球菌、微球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、革兰阴性肠杆菌等常见微生物污染物的16S rRNA序列，以可变区中特异性核酸序列为DNA条形码、以恒定区中保守核酸序列设计通用测序引物，确定符合药品微生物质量控制要求的标准核酸序列的范围和长度，并通过Genebank数据库Blast分析、国家权威微生物菌种保藏中心的代表性标准菌株和实验室分离株鉴定进行DNA条形码序列的验证，最终确立用于药品生产环境中常见微生物污染物鉴定的DNA条形码，并建立DNA条形码标准核酸序列数据库。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；

步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；

步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；

步骤四，提取并纯化PCR产物；

步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；

步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；

步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所提供的技术措施还包括：

优选地，所述通用核酸测序引物对选自序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的一对。

优选地，所述DNA条形码标准序列核心数据库建立方法为：

步骤A，Genebank数据库检索目标菌属，获得其16S rRNA核酸序列；

步骤B，将步骤A获得的核酸序列进行序列比对分析，选择具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，并根据保守区域核酸序列设计通用核酸测序引物对；

步骤C，以核酸测序通用引物对为两端进行定位，截取长度相同的核酸序列片段，并获取可信度高的核酸序列片段，将该序列导入序列分析软件进行聚类分析，构建NJ化树；

步骤D，对NJ进化树中各类菌属的聚类关系进行分析；通过NJ进化树的聚类关系分析进一步验证各菌株中具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，最终确定各类菌属核酸测序鉴定的DNA条形码序列，作为核心参比序列录入DNA条形码标准序列核心数据库。

更优选地，DNA条形码标准序列核心数据库建立方法还包括：

步骤E，收集整理国家权威微生物菌种保藏中心的代表性标准菌株和微生物检验实验室的常见环境细菌菌株，提取基因组DNA，以通用测序引物扩增DNA条形码区域的核酸序列，经序列拼接和测序质量的核查，确认DNA条形码标准核酸序列，经与核心参与序列比对无误后录入数据库。

进一步地，所述步骤三中PCR扩增反应体系以25μl为参照，包括：1×PCR反应缓冲液，2.5mmol/L MgCl₂，2.5mmol/L dNTPs，10umol/L正向/反向引物对，DNA模板，1.0U TaqDNA聚合酶，加无菌双蒸水至25μl；同时设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照；PCR扩增反应程序：94℃，预变性1min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸3min。

进一步地，所述步骤四中提取并纯化PCR产物具体操作为采取1.5％琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，将3～5μl PCR产物与上样缓冲液混合均匀，加入含1.5％琼脂糖凝胶孔中，在TAE缓冲液中电泳，同时选用合适的DNA梯度标准品作为参考，电泳后，在紫外凝胶成像仪中确认单一目标条带的存在，然后去除多余的PCR引物和脱氧核糖核苷酸分子。

进一步地，所述步骤五中测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列过程为：将已纯化的PCR产物加载入核酸测序仪，以通用核酸测序引物进行双向测序，获得PCR产物的核酸序列。

进一步地，所述步骤七中对细菌进行鉴定中，菌株亲缘关系小于或等于97％认定为不同的属，亲缘关系小于或等于99％认定为不同的种。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1、建立了药品生产和质量控制中常见细菌污染物的核酸测序鉴定方法；

2、明确了16S rRNA中具有鉴定和分类意义的DNA条形码序列的范围和长度；

3、对核酸测序结果进行质量核查，以通用测序引物定位的方式，建立了细菌核酸测序鉴定DNA条形码；

4、建立在本发明基础上的标准核酸测序数据库，可为药品微生物的检验结果提供可靠的判定依据。

附图说明

图1为药品生产环境中常见微生物污染物核酸测序鉴定DNA条形码比对示意图；

图2为实施例一中药品生产环境中常见微生物污染物DNA条形码聚类关系NJ进化树；

图3为实施例二中33株常见葡萄球菌DNA条形码及菌株聚类关系NJ进化树；

图4为实施例三中25株常见假单胞菌DNA条形码及菌株聚类关系NJ进化树；

图5为实施例四中11株常见芽孢杆菌DNA条形码及菌株聚类关系NJ进化树；

图6为实施例五中葡萄球菌DNA条形码序列聚类关系NJ进化树；

图7为实施例六中假单胞菌DNA条形码序列聚类关系NJ进化树；

图8为实施例七中芽孢杆菌DNA条形码序列聚类关系NJ进化树；

图9为实施例八中葡萄球菌分离株DNA条形码与核心数据库聚类关系NJ进化树。

具体实施方式

本发明提供了一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；

步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；

步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；

步骤四，提取并纯化PCR产物；

步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一、药品生产环境中常见微生物污染物鉴定DNA条形码及标准核酸序列数据库的建立

1.登录NCBI Genebank数据库，在Taxonomy项下检索目标菌属，如葡萄球菌、微球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌等，进一步通过filter过滤功能筛选“16SrRNAand refSeq and length 1000～2000bp”，获得符合条件的16S rRNA核酸序列。

2.以Fasta文件格式从Genebank数据库下载上述序列，导入Bioedit序列比对软件，以ClustalW Multiple Alignment功能，Full Multiple Alignment、Bootstrap NJTree(1000numbers)的统计方式进行ClustalW序列比对分析，选择具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，并根据保守区域核酸序列设计通用测序引物。

3.标准核酸序列的筛选与DNA条形码的建立：

(1)以核酸测序通用引物为两端进行定位，截取长度相同的核酸序列片段；

(2)将核酸序列未能完全覆盖、兼并碱基数量≥1％、“unverified sequence”等的序列删除，获取可信度较高的核酸序列片段；将该序列导入Mega序列分析软件，以Phylogeny功能，Bootstrap Method 1000、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建Neighbor-Joining进化树(NJ进化树)；

(3)对NJ进化树中各类菌属的聚类关系进行分析，应与预期一致；通过NJ进化树的聚类关系分析进一步验证各类微生物污染物种属中具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，最终确定各类菌属核酸测序鉴定的DNA条形码序列，作为核心参比序列录入数据库，作为菌株鉴定和分类的参考依据。

(4)收集整理微生物检验实验室的常见环境细菌菌株，提取基因组DNA，以通用测序引物扩增DNA条形码区域的核酸序列，经序列拼接和测序质量的核查，确认DNA条形码标准核酸序列，经与核心参与序列比对无误后录入数据库，扩充数据库容量。

4.通用测序引物的建立和标准核酸序列数据库的建立

(1)DNA条形码序列片段范围的筛选与通用测序引物的建立

经16S rRNA核酸序列筛选，具有鉴定和分类意义的DNA条形码序列大多位于V1区(61～106bp)、V2区(121～240bp)、V3区(436～500bp)、V4区(588～671bp)和V7区(990～1045bp)，代表性菌株V2区核酸序列的比对情况如图1所示，在此基础上设计核酸测序鉴定的通用引物如下：

其中，V1forward(27F)引物GC含量50％、Tm值68、无Hairpin发夹环结构；V3reverse(548R)引物GC含量65％、Tm值78、无Hairpin发夹环结构；上、下游引物与各类菌属16S rRNA核酸序列的匹配度均为100％，且引物之间未发现同源性序列，为核酸测序鉴定的首选通用引物。

(2)药品生产环境中常见微生物污染物鉴定DNA条形码及标准核酸序列数据库的建立

分别以V1forward(27F)和V3reverse(548R)引物为两端，将筛选得到的DNA条形码序列范围和长度进行定位，删除可信度较低的序列，以Phylogeny功能，Bootstrap Method1000、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类关系分析，构建NJ进化树，如图2。结果显示：各类菌株种属之间的碱基序列差异明显，种属间的同源性及聚类关系与预期一致，该通用引物适用于药品生产环境中常见微生物污染物的核酸测序鉴定，以此为基础形成的DNA条形码序列可作为菌株鉴定和分类的参考依据。

实施例二、药品生产环境中葡萄球菌污染物鉴定DNA条形码及数据库的建立

一、试验方法及操作步骤

1.登录NCBI Genebank数据库，在Taxonomy项下检索葡萄球菌(Staphylococcus)，进一步通过filter过滤功能筛选“16S rRNAand refSeq and length 1000～2000bp”，获得符合条件的16S rRNA核酸序列。

2.以Fasta文件格式从Genebank数据库下载上述序列，导入Bioedit序列比对软件，以ClustalW Multiple Alignment功能，Full Multiple Alignment、Bootstrap NJTree(1000numbers)的统计方式进行ClustalW序列比对，以通用测序引物V1forward(27F)和V3reverse(548R)为两端进行定位，截取长度相同的核酸序列片段；

3.将核酸序列未能完全覆盖、兼并碱基数量≥1％、“unverified sequence”等的序列删除，获取可信度较高的核酸序列片段；将该序列导入Mega序列分析软件，以Phylogeny功能，Bootstrap Method 1000、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建Neighbor-Joining进化树(NJ进化树)；

4.对NJ进化树中各类葡萄球菌的聚类情况进行分析，葡萄球菌属内、种间的聚类情况应与预期一致；通过NJ进化树的聚类分析验证上述核酸序列，最终确定统一、规范的葡萄球菌核酸测序鉴定DNA条形码，作为核心参比序列录入数据库。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，葡萄球菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，通用引物V1forward(27F)和V3reverse(548R)适用于药品生产环境中葡萄球菌污染物的核酸测序鉴定，以此为基础形成的DNA条形码序列可作为葡萄球菌鉴定和分类的参考依据，如图3。

实施例三、药品生产环境中假单胞菌污染物鉴定DNA条形码及数据库的建立

一、试验方法及操作步骤

1.登录NCBI Genebank数据库，在Taxonomy项下检索假单胞菌(Pseudomonas)，进一步通过filter过滤功能筛选“16S rRNA and refSeq and length 1000～2000bp”，获得符合条件的16S rRNA核酸序列。

4.对NJ进化树中各类假单胞菌的聚类情况进行分析，假单胞菌属内、种间的聚类情况应与预期一致；通过NJ进化树的聚类分析验证上述核酸序列，最终确定统一、规范的假单胞菌核酸测序鉴定DNA条形码，作为核心参比序列录入数据库。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，假单胞菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，通用引物对V1forward(27F)和V3reverse(548R)适用于药品生产环境中假单胞菌污染物的核酸测序鉴定，以此为基础形成的DNA条形码序列可作为假单胞菌鉴定和分类的参考依据，如图4。

实施例四、药品生产环境中芽孢杆菌污染物鉴定DNA条形码及数据库的建立

一、试验方法及操作步骤

1.登录NCBI Genebank数据库，在Taxonomy项下检索芽孢杆菌(Bacillus)，进一步通过filter过滤功能筛选“16S rRNAand refSeq and length1000～2000bp”，获得符合条件的16S rRNA核酸序列。

4.对NJ进化树中各类芽孢杆菌的聚类情况进行分析，芽孢杆菌属内、种间的聚类情况应与预期一致；通过NJ进化树的聚类分析验证上述核酸序列，最终确定统一、规范的芽孢杆菌核酸测序鉴定DNA条形码，作为核心参比序列录入数据库。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，芽孢杆菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，通用引物对V1forward(27F)和V3reverse(548R)适用于药品生产环境中芽孢杆菌污染物的核酸测序鉴定，以此为基础形成的DNA条形码序列可作为芽孢杆菌鉴定和分类的参考依据，如图5。

实施例五、葡萄球菌鉴定DNA条形码在Genebank数据库中的验证

一、试验方法及操作步骤

1.依据上述筛选原则，将葡萄球菌DNA条形码核心数据库的参比序列导出，将其作为“待测序列(Query Sequence)”在Genebank“16S ribosomal RNA sequences(Bacteriaand Archaea)”数据库中进行Blast比对分析。以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为例，该菌株“种”水平核酸测序鉴定的标准DNA条形码序列为：

GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT(SEQ ID NO.9)，且种内遗传距离为零。

将Blast比对结果以fasta文件形式导出，筛选并获取DNA条形码序列长度完全相同的核酸序列，以Phylogeny功能，Bootstrap Method 1000、Kimura2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建NJ进化树，验证该序列是否为金黄色葡萄球菌的同源性序列。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，待测金黄色葡萄球菌与Genebank数据库中其他金黄色葡萄球菌的同源性高、聚类关系近，葡萄球菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，试验结果表明：葡萄球菌DNA条形码核心数据库的参比序列可作为该种属内各类菌株鉴定和分类的参考依据，如图6。

实施例六、假单胞菌鉴定DNA条形码在Genebank数据库中的验证

一、试验方法及操作步骤

1.依据上述筛选原则，将假单胞菌DNA条形码核心数据库的参比序列导出，将其作为“待测序列(Query Sequence)”在Genebank“16S ribosomal RNA sequences(Bacteriaand Archaea)”数据库中进行Blast比对分析。以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为例，该菌株“种”水平核酸测序鉴定的标准DNA条形码序列为：

ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGT((SEQ ID NO.10)，且种内遗传距离为零。

将Blast比对结果以fasta文件形式导出，筛选并获取DNA条形码序列长度完全相同的核酸序列，以Phylogeny功能，Bootstrap Method 1000、Kimura2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建NJ进化树，验证该序列是否为铜绿假单胞菌的同源性序列。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，待测铜绿假单胞菌与Genebank数据库中其他铜绿假单胞菌的同源性高、聚类关系近，假单胞菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，试验结果表明：假单胞菌DNA条形码核心数据库的参比序列可作为该种属内各类菌株鉴定和分类的参考依据，如图7。

实施例七、芽孢杆菌鉴定DNA条形码在Genebank数据库中的验证

一、试验方法及操作步骤

1.依据上述筛选原则，将芽孢杆菌DNA条形码核心数据库的参比序列导出，将其作为“待测序列(Query Sequence)”在Genebank“16S ribosomal RNA sequences(Bacteriaand Archaea)”数据库中进行Blast比对分析。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为例，该菌株“种”水平核酸测序鉴定的标准DNA条形码序列为：

GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT(SEQ ID NO.11)，种内遗传距离为0.0135，其中第256位和第436位存在A/G突变。

将Blast比对结果以fasta文件形式导出，筛选并获取DNA条形码序列长度完全相同的核酸序列，以Phylogeny功能，Bootstrap Method 1000、Kimura2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计方式进行聚类分析，构建NJ进化树，验证该序列是否为枯草芽孢杆菌的同源性序列。

二、结果

根据上述分析手段建立的NJ进化树中，待测枯草芽孢杆菌与Genebank数据库中其他枯草芽孢杆菌的同源性高、聚类关系近，芽孢杆菌属各类菌株之间的同源性及聚类关系与预期一致，试验结果表明：芽孢杆菌DNA条形码核心数据库的参比序列可作为该种属内各类菌株鉴定和分类的参考依据，如图8。

实施例八、基于DNA条形码的葡萄球菌核酸测序鉴定方法的应用

一、试验方法及操作步骤

1.葡萄球菌的培养与纯化

收集整理葡萄球菌标准菌株14株和金黄色葡萄球菌分离株6株待测。菌株采用胰酪大豆胨等适宜的液体或琼脂培养基培养，挑取单菌落进行传代培养，最终获得单克隆菌株用于基因组DNA的提取。

2.DNA提取及模板制备

以碱裂解法配合溶菌酶、蛋白酶K等进行菌体破壁，提取葡萄球菌基因组DNA，也可采用适宜的试剂盒提取。提取完成的基因组DNA需要测定浓度和纯度，一般采用紫外分光光度计检测，纯化后的DNA浓度约50～500ng/ul，OD260/280比值应在1.8～2.0之间，1OD260约等于50μg/ml。

3.PCR扩增

以通用测序引物V1forward(27F)和V3reverse(548R)扩增葡萄球菌DNA条形码序列，PCR反应体系以25μl为参照，包括：1×PCR反应缓冲液，2.5mmol/L MgCl₂，2.5mmol/LdNTPs，10umol/L正向/反向引物对，DNA模板，1.0U Taq DNA聚合酶，加无菌双蒸水至25μl；同时设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照；PCR扩增反应程序：94℃，预变性1min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸3min。

4.PCR产物检测

采取1.5％琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，扩增片段约500bp，阴性对照应无条带。将3～5μl PCR产物与适宜体积的上样缓冲液混合均匀，加入含1.5％(w/v)琼脂糖凝胶孔中，在TAE缓冲液中电泳，同时选用合适的DNA梯度标准品作为参考。电泳后，在紫外凝胶成像仪中确认单一目标条带的存在。使用适宜的PCR产物纯化方法去除多余的PCR引物和脱氧核糖核苷酸分子。

5.核酸测序

将已纯化的PCR产物加载入核酸测序仪，以PCR扩增引物作为通用测序引物，进行双向测序，获得PCR产物的核酸序列。也可将PCR产物送公司测序。

6.核酸序列的获得

(1)序列拼接

应用Chromas、Bioedit、Secental、CodoncodeAligner等序列分析软件对双向测序峰型图进行序列拼接，以通用核酸测序引物定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列。

(2)序列质量与方向

为确保DNA条形码序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。

7.结果判定

将获得的序列导入DNA条形码标准序列核心数据库、或GenBank数据库中，应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法进行序列比对，根据序列比对结果对待鉴定物种进行判定。一般而言，菌株亲缘关系小于或等于97％被认定为不同的属、亲缘关系小于或等于99％被认定为不同的种。

二、结果

收集整理葡萄球菌样本20株，在进行基因组DNA提取、PCR扩增、测序质量核查后，将所有待测核酸序列导入DNA条形码核心数据库，结果显示：金黄葡萄球菌(CICC10473、CICC21600、CICC23478、CICC23699、ATCC6538、CMCC26003、金葡分离株isolates1-6)、表皮葡萄球菌(CICC10294、CMCC26069)、缓慢葡萄球菌(CICC21602)、头状葡萄球菌(CICC10290)、假中间葡萄球菌(CICC10499)、小牛肉葡萄球菌(CICC10850)、木糖葡萄球菌(CICC22112)、腐生葡萄球菌(CICC22941)等20株待测序列均按照各自的种属特征、与数据库中的参比序列聚类，聚类分析结果与预期一致(图9)。试验结果表明：建立在核酸测序鉴定规范法基础上的DNA条形码及标准核酸序列数据库，对于菌株的鉴定和分类准确可靠，可为存疑菌株的鉴定和分类提供判定依据。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市食品药品检验所

<120> 一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 扩增引物

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<211> 20

<212> DNA

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gtattaccgc ggctgctggc 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cctacgggag gcagcag 17

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物

<400> 4

attaccgcgg ctgctgg 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增序列

<400> 5

cttaatggcg ccgtcgac 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物

<400> 6

ccgtcaattc atttaagttt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物

<400> 7

aaactcaaag gaattgacgg 20

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物

<400> 8

gggttgcgct cgttg 15

<210> 9

<211> 496

<212> DNA

<213> Staphylococcus arlettae

<400> 9

gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaacggacga gaagcttgct 60

tctctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtggat aacctaccta taagactggg 120

ataacttcgg gaaaccggag ctaataccgg ataatatttt gaaccgcatg gttcaaaagt 180

gaaagacggt cttgctgtca cttatagatg gatccgcgct gcattagcta gttggtaagg 240

taacggctta ccaaggcaac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactgga 300

actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg 360

aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggtct tcggatcgta aaactctgtt 420

attagggaag aacatatgtg taagtaactg tgcacatctt gacggtacct aatcagaaag 480

ccacggctaa ctacgt 496

<210> 10

<211> 483

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 10

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggatgaaggg agcttgctcc 60

tggattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac 120

gtccggaaac gggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga 180

cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca 240

aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt 300

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca 360

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag 420

ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaactt 480

cgt 483

<210> 11

<211> 496

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 11

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60

cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120

aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180

aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240

aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420

ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgt 496

Claims

1.一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；

步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；

步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；

步骤四，提取并纯化PCR产物；

步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；

2.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述通用核酸测序引物对选自序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的一对。

3.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述通用核酸测序引物对为序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对。

4.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述DNA条形码标准序列核心数据库建立方法为：

5.根据权利要求4所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述DNA条形码标准序列核心数据库建立方法还包括：

步骤E，收集整理代表性标准菌株和微生物检验实验室的常见环境细菌菌株，提取基因组DNA，以通用测序引物扩增DNA条形码区域的核酸序列，经序列拼接和测序质量的核查，确认DNA条形码标准核酸序列，经与核心参与序列比对无误后录入数据库。

6.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤三中PCR扩增反应体系以25μl为参照，包括：1×PCR反应缓冲液，2.5mmol/LMgCl₂，2.5mmol/L dNTPs，10umol/L正向/反向引物对，DNA模板，1.0U Taq DNA聚合酶，加无菌双蒸水至25μl；同时设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照；PCR扩增反应程序：94℃，预变性1min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸3min。

7.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤四中提取并纯化PCR产物具体操作为采取1.5％琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，将3～5μl PCR产物与上样缓冲液混合均匀，加入含1.5％琼脂糖凝胶孔中，在TAE缓冲液中电泳，同时选用合适的DNA梯度标准品作为参考，电泳后，在紫外凝胶成像仪中确认单一目标条带的存在，然后去除多余的PCR引物和脱氧核糖核苷酸分子。

8.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤五中测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列过程为：将已纯化的PCR产物加载入核酸测序仪，以通用核酸测序引物进行双向测序，获得PCR产物的核酸序列。

9.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤七中对细菌进行鉴定中，菌株亲缘关系小于或等于97％认定为不同的属，亲缘关系小于或等于99％认定为不同的种。