CN113311168A - 金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法 - Google Patents

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郝莹莹
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宋真
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    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Abstract

本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其是涉及一种金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法。包括以下步骤：收集金黄色葡萄球菌株，对收集的菌株进行菌种鉴定和药物敏感性试验，得到菌株表型结果；对所收集的菌株进行分子流行病学调查，得到菌株表型结果；对PVL表达出的蛋白质进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，对PBP2a进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比得到的菌株表型结果找到PVL特征峰的位置和PBP2a特征峰的位置；分别建立不同菌株的蛋白质指纹图谱，分别建立PVL特征峰和PBP2a特征峰的蛋白质指纹图谱。本发明成本低、效率高、操作简单，能够将菌种鉴定和药敏表型筛选时间缩短。

Description

金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法
技术领域
本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其是涉及一种金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法。
背景技术
中国是金黄色葡萄球菌流行比较严重的国家，抗生素使用不规范普遍存在。万古霉素是治疗MRSA严重感染的首选药物，国外一些国家和地区已经出现了万古霉素中介或耐药的金黄色葡萄球菌，面临无药可用的局面。耐药性向致病性较强的CA-MRSA扩散，已经引起广泛的关注和重视。为了规范抗生素的使用，遏制耐药性的传播，国内外相继出台了《耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染防治专家共识》、《亚洲MRSA院内获得性肺炎诊疗共识》、《IDSA成人及儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的临床实践指南》等专家共识和临床指南。
目前对MRSA的微生物鉴定还停留在传统的生化反应进行微生物学鉴定及药物敏感性试验，通常需要1-2天的时间，花费高，这对于初始正确的抗生素治疗具有一定的局限性。时间飞行质谱技术在微生物鉴定方面具有快速、高通量、低成本的特点，已经开始普及应用于临床，能够在几分钟内得到鉴定结果。但其应用还仅仅局限于微生物鉴定，无法在得到病原菌种类的同时获得其药物敏感表型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，基于飞行时间质谱检测原理，成本低、效率高、操作简单，能够将菌种鉴定和药敏表型筛选时间缩短。
本发明提供一种金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，包括以下步骤：
(1)收集金黄色葡萄球菌株，对收集的菌株进行菌种鉴定和药物敏感性试验，得到菌株表型结果；
(2)采用分子生物学的方法对所收集的菌株进行分子流行病学调查，得到菌株表型结果；
(3)构建PVL表达载体，对PVL表达出的蛋白质进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比步骤(1)和步骤(2)得到的菌株表型结果找到PVL特征峰的位置；
(4)对PBP2a进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比步骤(1)和步骤(2)得到的菌株表型结果找到PBP2a特征峰的位置；
(5)分别建立不同菌株的蛋白质指纹图谱，分别建立PVL特征峰和PBP2a特征峰的蛋白质指纹图谱。
优选地，增加步骤(1)的菌株收集数量，重复步骤(1)～(5)，对步骤(5)得到的数据库的特异性、敏感性进行进一步验证。
优选地，步骤(1)中的菌株包括CA-MRSA、CA-MSSA、HA-MRSA和HA-MSSA，避免样本种类太少对实验结果产生影响。
优选地，所述步骤(5)中不同菌种包括CA-MRSA、CA-MSSA、HA-MRSA和HA-MSSA。
优选地，所述步骤(1)中对收集的菌株进行菌种鉴定和药物敏感性试验采用的是微生物学方法。
优选地，所述步骤(1)中药物敏感性试验是对多种抗生素的药物敏感性试验。
优选地，所述步骤(2)中的分子流行病学调查包括：MLST分型、SPA分型、SCCmec分型和毒素筛查。
优选地，毒素筛查为：对包括PVL在内的多种肠毒素进行PCR扩增、测序。
本发明的有益效果：
(1)本发明基于飞行时间质谱检测原理，能够实现在获得菌种鉴定结果的同时对耐药表型进行筛选，将药敏表型的筛选时间从2天缩短至1-2小时，从而第一时间指导临床合理使用抗生素，成本低、效率高、操作简单。
(2)检验成本从100元左右降低至20元左右，大大降低了检验费用，具有显著的经济学效益。
(3)目前尚无质谱检测MRSA致病因子的相关报道，本发明将MRSA的微生物的鉴定具体到亚种，本发明能够区分CA-MRSA、HA-MRSA，对MRSA致病力进行评估，有助于推测菌株来源于医院还是社区，从而加强感染的防控。
附图说明
图1是实施例1中CA-MRSA系统进化树图谱；
图2是实施例1中SCCmec分型图；
图3是实施例1中SPA分型电泳图；
图4是实施例1中部分菌株肠毒素多重PCR扩增电泳图；
图5是实施例1中部分菌株PVL扩增电泳图；
图6是实施例1中MRSA蛋白质指纹图谱；
图7是实施例1中MSSA蛋白质指纹图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
收集金黄色葡萄球菌株，采用微生物学方法对收集的菌株进行菌种鉴定：CA-MRSA、CA-MSSA各100株，其中呼吸道标本各50株，血液标本各50株，HA-MRSA 64株，HA-MSSA38株。采用微生物学方法对上述菌株进行对13种抗生素的药物敏感性试验，采用分子生物学的方法对上述菌株进行分子流行病学调查：MLST分型、SPA分型、SCCmec分型进行了分析，对菌株的分子流行病学特点有了初步了解，CA-MRSA系统进化树图谱如图1，发现ST59是我国CA-MRSA的主要MLST型，SCCmecIV型是主要的耐药基因盒，t441是主要的spa亚型，SCCmec分型图见图2、SPA分型电泳图见图3。对包括PVL在内的多种肠毒素进行了PCR扩增、测序，部分菌株肠毒素多重PCR扩增电泳图见图4，部分菌株PVL扩增电泳图见图5。发现CA-MRSA与HA-MRSA对PVL的携带率有明显统计学差异，可以作为质谱区分CA-MRSA和HA-MRSA的重要标志之一。
构建PVL表达载体，对上述菌株的PVL表达出的蛋白质进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比药物敏感性、MLST分型、SPA分型、SCCmec分型进行了的分析菌株表型结果找到PVL特征峰的位置；
对PBP2a进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比药物敏感性、MLST分型、SPA分型、SCCmec分型进行了的分析菌株表型结果找到PBP2a特征峰的位置；
以Reference Spectra(参照光谱)自建库的方式，将得到的所有的蛋白质指纹图谱为参照，分别建立CA-MRSA、HA-MRSA、CA-MSSA、HA-MSSA蛋白质指纹图谱数据库，MRSA的蛋白质指纹图谱见图6，MSSA的蛋白质指纹图谱见图7，以Super Spectra(超级光谱)自建库的方式，筛选得到的所有的蛋白质指纹图谱中的特征峰，分别建立CA-MRSA、HA-MRSA、CA-MSSA、HA-MSSA蛋白质指纹图谱数据库。
再次收集400株菌株，重复上述收集完菌株之后的所有步骤，得到更多的数据加入到数据库中，对数据库的特异性、敏感性进行进一步验证，提高数据库的准确性。
用飞行时间质谱检测仪检测对待测菌株的质谱蛋白质指纹图谱，对比已建立的蛋白质指纹图谱，通过PVL因子相应的特征峰来区分CA-MRSA、CA-MSSA和HA-MRSA、HA-MSSA，有PVL特征峰的是CA-MRSA、CA-MSSA，没有PVL特征峰的是HA-MRSA、HA-MSSA；通过PBP2a因子相应的特征峰来区分CA-MRSA、CA-MSSA和HA-MRSA、HA-MSSA，有PBP2a特征峰的是CA-MSSA、HA-MSSA，没有PBP2a特征峰的是CA-MRSA、HA-MRSA。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集金黄色葡萄球菌株，对收集的菌株进行菌种鉴定和药物敏感性试验，得到菌株表型结果；
(2)采用分子生物学的方法对所收集的菌株进行分子流行病学调查，得到菌株表型结果；
(3)构建PVL表达载体，对PVL表达出的蛋白质进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比步骤(1)和步骤(2)得到的菌株表型结果找到PVL特征峰的位置；
(4)对PBP2a进行质谱检测，得到蛋白质指纹图谱，通过对比步骤(1)和步骤(2)得到的菌株表型结果找到PBP2a特征峰的位置；
(5)分别建立不同菌株的蛋白质指纹图谱，分别建立PVL特征峰和PBP2a特征峰的蛋白质指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，增加步骤(1)的菌株收集数量，重复步骤(1)～(5)，对步骤(5)得到的数据库的特异性、敏感性进行进一步验证。
3.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的菌株包括CA-MRSA、CA-MSSA、HA-MRSA和HA-MSSA。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中不同菌种包括CA-MRSA、CA-MSSA、HA-MRSA和HA-MSSA。
5.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中对收集的菌株进行菌种鉴定和药物敏感性试验采用的是微生物学方法。
6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中药物敏感性试验是对多种抗生素的药物敏感性试验。
7.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的分子流行病学调查包括：MLST分型、SPA分型、SCCmec分型和毒素筛查。
8.根据权利要求7所述的金黄色葡萄球菌耐药表型蛋白质指纹图谱库的构建方法，其特征在于，毒素筛查为：对包括PVL在内的多种肠毒素进行PCR扩增、测序。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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