CN111575397A - 一种基于dna微条形码技术的有毒鹅膏菌物种鉴定方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体公开了一种基于DNA微条形码的鹅膏菌属物种鉴定方法及应用。该方法通过提取有毒鹅膏菌基因组DNA，然后利用自主设计的DNA微条形码引物进行PCR扩增，将纯化后的PCR产物进行测序，将测序所得的DNA微条形码片段序列与公共数据库中的参考序列进行比对，根据序列的匹配相似度进行物种鉴别。本方法操作简便，准确性高，能够鉴别出人工模拟消化后的鹅膏菌样品，在分析鹅膏菌或误食后的呕吐物等场景中具有较大的应用潜力。

Description

一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌物种鉴定方法及 应用
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体而言，涉及一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法及应用。
背景技术
鹅膏菌属隶属于真菌界（Fungi）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、鹅膏菌科（Amanitace），是大型真菌中分布较广的大属。全世界报道且被验证的鹅膏菌有近500种，我国报道的有130多种（亚种、变种及变型）。在这些鹅膏菌中，既有可食用的鹅膏菌，如橙盖鹅膏菌(Amanita caesarea)、卵盖鹅膏菌(Amanita ovoidea)、红黄鹅膏菌(Amanita hemibapha)等，也有含毒的鹅膏菌，如锥鳞白鹅膏菌（Amanita virgineoides）、小毒绳鹅膏菌（Amanita melleiceps）、鳞柄白鹅膏菌(Amanita virosa)。鹅膏菌属多分布于林地边缘或林中透光多的地方，在灌木丛或者树木茂密的地方则分布较少，在我国主要分布于亚热带地区，如广州、湖南、云南、山东等地；少数分布于我国温带或热带地区，如海南的灰盖粉褶鹅膏（Amanita griseorosea）、假褐云斑鹅膏菌（Amanita pseudoporphyria）等。据统计，贵州省2012-2016年期间每年由野生毒蕈中毒引起的死亡数均占当年总死亡数的50%以上，2016年占比最高达94.44%，其中大多数病例是由于食用鹅膏菌属引起的，如致命鹅膏（Amanita exitialis）、淡红鹅膏（Amanita pallidorosea）、假淡红鹅膏（Amanita subpallidorosea）等。据不完全统计，我国2019年共发生了53起蘑菇中毒事件，其中有36起事件成功鉴定出了具体的毒蘑菇种类，主要是灰花纹鹅膏（Amanita fuliginea）、裂皮鹅膏（Amanita rimosa）以及大青褶伞（Chlorophyllum molybdites）；27起（占49.09%）事件未能鉴定出毒蘑菇种类。
DNA条形码（DNA Barcoding）技术是利用一段标准的、较短的DNA序列作为分子标记，通过对生物体中一个或多个基因进行扫描，从而实现物种鉴定的技术。目前DNA条形码技术已经广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术。内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）是18S-26S的核基因组DNA的内转录间隔区部分相对保守的片段区域，含有许多高度可变的无义序列，在进化过程中承受的自然选择压力较小，变异程度高，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，是真菌界中是最常用的DNA条形码。但是在一些加工食品中，由于其DNA遭到破坏，导致无法提取到完整的ITS基因，此时提取到部分ITS基因（100 bp-400 bp）也可以准确鉴定物种。
本发明提供一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法，有利于实现不同有毒鹅膏菌的准确鉴别。该方法与传统的形态学鉴定方法相比，可以解决形态学鉴定中因样品残缺不全无法准确鉴定的问题，而且鉴定准确性大大提高。此外，该方法可以为保存时间久远的蘑菇标本的鉴定以及为蘑菇中毒事件中无法获得原始样本时蘑菇中毒原因排查提供理论基础和技术支持。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺陷，本发明旨在提供一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法，为有毒鹅膏菌蘑菇诱发的食源性中毒风险进行预警以及鹅膏菌属中毒事件中物种鉴定及溯源提供技术支持。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种有毒鹅膏菌属ITS基因的扩增引物，其包括：
MiniITS-39F:AGGTGAACCTGYGGAAGATC；
MiniITS-278R:TTCGCTGYRTTCTTCATCGA。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
1）提取样品DNA；
2) 以步骤1）提取的DNA为模板，利用所述的引物MiniITS-39F和MiniITS-278R进行PCR扩增反应；
3) 用PCR产物纯化试剂ExoSAP-IT™纯化步骤2）中所得PCR产物：每5 μL PCR产物加入2 μL ExoSAP-IT™试剂混匀，放入PCR仪，37℃15 min，80℃ 15 min。对于条带单一的样品，纯化后直接进行测序反应；
4) 将测序所得序列在美国国家生物技术信息中心 （National Center forBiotechnology Information，NCBI）进行比对，根据序列的匹配相似度进行物种鉴别。
进一步地，PCR反应体系以25 μL计包含：2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μM上下引物各0.3 μL，10 ng/μL DNA模板 2 μL，加无菌去离子水至25 μL。
进一步地，PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min，（95 ℃ 45 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2min）30个循环，72 ℃ 10 min。
本发明与的有益效果如下：
本发明提供的鹅膏菌属ITS基因序列的扩增引物，可以有效扩增出290 bp的DNA微条形码片段，可以为保存时间久远的蘑菇标本的鉴定以及为蘑菇中毒事件中无法获得原始样本时蘑菇中毒原因排查提供理论基础和技术支持。
附图说明
图1表示的是所设计的引物MiniITS-39F/278R对已知有毒鹅膏菌属样品DNA的ITS基因序列扩增电泳图。其中，M: Marker 2000 bp; 1：杵柄鹅膏菌（Amanita sinocitrina）；2：小毒蝇鹅膏菌（Amanita melleiceps）；3：红托鹅膏菌（Amanita rubrovolvata）；4：假褐云斑鹅膏菌（Amanita pseudoprinceps）；5：草鸡枞鹅膏菌（Amanita caojizong）；6：袁氏鹅膏菌（Amanita yuaniana）；7：异味鹅膏菌（Amanita kotohiraensis）；8：裂皮鹅膏菌（Amanita rimosa）；9：欧式鹅膏菌（Amanita oberwinklerana）；10：灰花纹鹅膏菌（Amanita fuliginea）；11：灰花纹鹅膏菌（Amanita fuliginea）；灰花纹鹅膏菌（Amanita fuliginea）；12：球基鹅膏菌（Amanita subglobosa）；13：假黄盖鹅膏菌（Amanita pseudogemmata）；14：锥鳞白鹅膏菌（Amanita virgineoides）；15：锥鳞白鹅膏菌（Amanita virgineoides）；16：拟卵盖鹅膏菌（Amanita neoovoidea）；17：鹅膏一种菌（Amanita minutisquama）；18：致死鹅膏菌（Amanita exitialis）；19：土红鹅膏菌（Amanita rufoferruginea）；20：刻鳞鹅膏菌（Amanita sculpta）；21：裂皮鹅膏菌（Amanita rimosa）；22：裂皮鹅膏菌（Amanita rimosa）；23：裂皮鹅膏菌（Amanita rimosa）；24：东方褐盖鹅膏菌（Amanita orientifulva）；25：黄柄鹅膏菌（Amanita flavipes）；26：假淡红鹅膏菌（Amanita vaginata）；27：假淡红鹅膏菌（Amanita vaginata）；28：托鹅膏菌（Amanita vaginata）；29：托鹅膏菌（Amanita vaginata）；30：园足鹅膏菌（Amanita sphaerobulbosa）；31：格纹鹅膏菌（Amanita fritillaria）；32：淡红鹅膏菌（Amanita pallidorosea）；33：淡红鹅膏菌（Amanita pallidorosea）；34：隐青花鹅膏菌（Amanita manginiana）；35：赤脚鹅膏菌（Amanita gymnopus）；36：中华鹅膏菌（Amanita sinensis）；37：白鹅膏菌（Amanita aspericeps）；38：爪哇鹅膏菌（Amanita javanica）；39：暗盖淡鹅膏菌菌（Amanita sepiacea）；40：东方褐盖鹅膏菌2（Amanita orientifulva）；41：东方褐盖鹅膏菌3（Amanita orientifulva）；42：长柄鹅膏菌（Amanita altipes）；43：小豹斑鹅膏菌（Amanita parvipantherina）；b：空白对照。
图2表示的是鹅膏菌样品消化处理前后ITS序列微型DNA条码与常规DNA条码PCR扩增电泳图。其中M：Marker；A：暗盖淡鹅膏菌（Amanita sepiacea）；B：东方褐盖鹅膏菌2（Amanita orientifulva）；C：东方褐盖鹅膏菌3（Amanita orientifulva）；D：长柄鹅膏菌（Amanita altipes）；E：小豹斑鹅膏（Amanita parvipantherina）；1：样品消化前微型DNA条型码；2：样品消化后微型DNA条形码；3：消化后常规DNA条形码；b：空白对照。
图3表示的是存放时间长久的鹅膏菌样品ITS序列的常规DNA条码及微型DNA条码PCR扩增电泳图。其中M：Marker；A：刻鳞鹅膏菌（Amanita sculpta）；B：东方褐盖鹅膏菌（Amanita orientifulva）；C：园足鹅膏菌（Amanita sphaerobulbosa）；D：隐青花鹅膏菌（Amanita manginiana）；E：赤脚鹅膏菌（Amanita gymnopus）；1：引物ITS4/5；2：引物ITS39F/278R；+：阳性对照；b：空白对照。
图4表示的是利用本研究中鹅膏菌属物种序列构建NJ系统发育树。其中A：微型DNA条形码；B：常规DNA条形码。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
本实施例为通过如下试验对有毒鹅膏菌属的DNA微条形码扩增效率和鉴别进行准确度评价。
1.实验材料
本研究使用的33种鹅膏菌共43个蘑菇样本名称见表1。其中假淡红鹅膏菌由中国疾病预防控制中心提供，其余鹅膏菌样品由湖南师范大学陈作红教授提供并作形态学鉴定，所有鹅膏菌均为子实体，在本实验室已经通过基于ITS、核糖体大亚基（Large SubunitRibosomal，LSU）、RNA聚合酶的第二大亚基（the Second Largest Subunit of RNAPolymerase II，RPB2）、β-微管蛋白（β-tubulin）4条DNA条形码鉴定其物种真实性。
表1 收集的鹅膏菌属样品信息
序号 分类地位 样品编号 物种名称 拉丁名 是否有毒
1 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12001 杵柄鹅膏菌 <i>Amanita sinocitrina</i> 是
2 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12002 小毒蝇鹅膏菌 <i>Amanita melleiceps</i> 是
3 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12003 红托鹅膏菌 <i>Amanita rubrovolvata</i> 是
4 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12004 假褐云斑鹅膏菌 <i>Amanita pseudoprinceps</i> 是
5 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12005 草鸡枞鹅膏菌 <i>Amanita caojizong</i> 否
6 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12006 袁氏鹅膏菌 <i>Amanita yuaniana</i> 否
7 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12007 异味鹅膏菌 <i>Amanita kotohiraensis</i> 是
8 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12008 裂皮鹅膏菌 <i>Amanita rimosa</i> 是
9 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12009 欧氏鹅膏菌 <i>Amanita oberwinklerana</i> 是
10 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12010 灰花纹鹅膏菌 <i>Amanita fuliginea</i> 是
11 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12011 灰花纹鹅膏菌 <i>Amanita fuliginea</i> 是
12 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12012 灰花纹鹅膏菌 <i>Amanita fuliginea</i> 是
13 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12013 球基鹅膏菌 <i>Amanita subglobosa</i> 是
14 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12014 假黄盖鹅膏菌 <i>Amanita pseudogemmata</i> 是
15 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12015 锥鱗白鹅膏菌 <i>Amanita virgineoides</i> 是
16 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12016 锥鱗白鹅膏菌 <i>Amanita virgineoides</i> 是
17 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12017 拟卵盖鹅膏菌 <i>Amanita neoovoidea</i> 是
18 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12018 鹅膏一种菌 <i>Amanita minutisquama</i> 是
19 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12019 致命鹅膏菌 <i>Amanita exitialis</i> 是
20 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12020 土红鹅膏菌 <i>Amanita rufoferruginea</i> 是
21 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12021 刻鳞鹅膏菌 <i>Amanita sculpta</i> 是
22 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12022 裂皮鹅膏菌 <i>Amanita rimosa</i> 是
23 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12023 裂皮鹅膏菌 <i>Amanita rimosa</i> 是
24 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12024 东方褐盖鹅膏菌1 <i>Amanita orientifulva</i> 是
25 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12025 黄柄鹅膏菌 <i>Amanita flavipes</i> 是
26 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12026 假淡红鹅膏菌 <i>Amanita subpallidorosea</i> 是
27 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12027 假淡红鹅膏菌 <i>Amanita subpallidorosea</i> 是
28 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12028 灰托鹅膏菌 <i>Amanita vaginata</i> 是
29 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12029 灰托鹅膏菌 <i>Amanita vaginata</i> 是
30 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12030 园足鹅膏菌 <i>Amanita sphaerobulbosa</i> 是
31 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12031 格纹鹅膏菌 <i>Amanita fritillaria</i> 是
32 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12032 淡红鹅膏菌 <i>Amanita pallidorosea</i> 是
33 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12033 淡红鹅膏菌 <i>Amanita pallidorosea</i> 是
34 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12034 隐花青鹅膏菌 <i>Amanita manginiana</i> 否
35 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12035 赤脚鹅膏菌 <i>Amanita gymnopus</i> 是
36 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12036 中华鹅膏菌 <i>Amanita sinensis</i> 否
37 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12037 白鹅膏菌菌 <i>Amanita aspericeps</i> 否
38 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12038 爪哇鹅膏菌 <i>Amanita javanica</i> 是
39 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12039 暗盖淡鹅膏菌菌 <i>Amanita sepiacea</i> 是
40 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12040 东方褐盖鹅膏菌2 <i>Amanita orientifulva</i> 是
41 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12041 东方褐盖鹅膏菌3 <i>Amanita orientifulva</i> 是
42 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12042 长柄鹅膏菌 <i>Amanita altipes</i> 是
43 伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属 CAIQ12043 小豹斑鹅膏菌 <i>Amanita parvipantherina</i> 是
2. 实验方法
2.1 引物设计
从NCBI的GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）共下载33种99条鹅膏菌属物种的ITS基因序列，使用MEGA 6.0 软件进行序列比对，结合引物设计的一般原则，在ITS序列相对保守区域使用Premier primer 5.0软件进行引物设计，使用Oligo 7.0所设计引物的特性（发夹结构、引物二聚体、错配等）进行分析和评价，再使用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）检验引物的特异性，最后通过实验进行验证，经过综合分析后，最终确定了性能最佳的一对引物序列如下：
MiniITS-39F:CCGTAGGTGAACCTGYGGA，MiniITS-278R:TCGCTGYRTTCTTCATCG
表2 PCR引物及其退火温度
Figure 365474DEST_PATH_IMAGE001
2.2 静态体外消化液配制
模拟口腔液：准确称取0.05 g KCl ，0.01 g CaCl2，0.04 g KH2PO4，0.05 g NaHCO3 置于50 mL 烧杯中，加入30 mL蒸馏水使其完全溶解后，加入1.875 g α-淀粉酶，搅拌均匀后，用0.1 mol/L的HCl 溶液将pH调至7.0，用50 mL容量瓶进行定容，4℃冰箱备用。模拟胃液：准确称取0.05 g KCl。0.42 g NaCl 置于100 mL烧杯中，加入70 mL蒸馏水使其完全溶解后，加入0.32 g胃蛋白酶，搅拌均匀后，用2 mol/L的HCl 溶液将pH调至2.0，用100 mL容量瓶进行定容，4℃冰箱备用。
2.3 样本前处理及DNA提取
所有鹅膏菌DNA提取方法按照DNAsecure Plant Kit DNA新型植物试剂盒（天根）操作说明进行，提取的DNA于-20℃保存备用。前处理略有改动：将30 mg样品放于1.5 mL离心管，加入液氮使之快速冻干，冷却后加入LP1溶液；6 μL RNase酶及两粒碳化坞研磨珠，于组织研磨器中震荡两分钟，每一分钟暂停一分钟，静止放置5 min，剩余步骤按照试剂盒步骤进行。
体外消化模型具体操作如下：准确称取90 mg样品置于离心管中，加入5 mL 37℃温水泡发2 h；离心取沉淀，平均分为3份，编号1-3；加入1 mL蒸馏水，在常温下快速震荡5 s后置于100℃水浴15 min，冷却至室温；取出1号离心管，4000 rpm 离心5 min，取沉淀备用。2-3号离心管加入1 mL的模拟口腔液，充分混匀，置于37℃恒温水浴90 s，振荡速率300rpm/min。待口腔液作用完毕，将2号管离心4000 rpm离心 5 min，取沉淀。3号样品迅速加入适量的2 mol/L HCl溶液，将混合液pH调至2.0左右，加入2 mL模拟胃液，在室温下快速震荡5 s，待物液混合均匀后置于37℃恒温水浴1 h，振荡速率300 rpm/min，取出3号管离心4000rpm离心5 min，取沉淀。将1-3号样品使用DNAsecure Plant Kit DNA新型植物试剂盒（天根）进行DNA提取，所提DNA于-20℃保存备用。
2.4 DNA微条形码基因片段的PCR扩增
以43个已知有毒鹅膏菌属物种信息的有毒鹅膏菌属样品DNA为模板，进行PCR扩增，25μL PCR反应体系包含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μM上下引物各0.3 μL，10 ng/μL DNA模板 2 μL，加无菌去离子水至25 μL。PCR扩增程序为95 ℃ 5 min，（95 ℃ 45 s，62℃ 30 s，72 ℃ 2 min）30个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段电泳条带单一且明亮的PCR产物纯化回收，4℃保存备用。
2.5 PCR产物纯化
用PCR产物纯化试剂ExoSAP-IT™纯化PCR产物：每5 μL PCR产物加入2 μL ExoSAP-IT™试剂混匀，放入PCR仪，37℃15 min，80℃ 15 min。对于单一样品，纯化后直接进行测序反应。
2.6 测序
将纯化后的PCR产物进行双向测序，测序反应体系总体积共10 µL：5×Sequencingbuffer 1 µL，Big Dye Terminator V3.1 1 µL，引物0.16 µL（10 µM），Nuclease-freewater 6.84 µL，PCR纯化产物1 µL。PCR扩增反应条件为：96℃ 2 min；96℃ 15 s，54℃ 10s，60℃ 4 min，30个循环；4℃保存。采用测序产物纯化试剂盒BigDye® XTerminatorTMPurification Kit 进行纯化，每管吸取10 μL上清液于96孔板中测序。
2.7 测序数据分析
将双向测序所得序列用DNASTAR软件中的SeqMan程序对测序峰图进行校对拼接，并去除低质量序列。将拼接后的序列提交NCBI的GenBank数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列比对鉴别物种来源。利用MEGA6.0软件进行多序列比对分析，基于Kimura-2-Parameter（K2P）双模型计算种内种间遗传距离，利用邻位法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，Bootstrap 检验法进行可信度测验，自展系数为1000。3. 结果与分析如图1所示），表明该引物具有良好的通用性。
3. 结果与分析
3.1 微型DNA条形码引物的通用性分析
将鹅膏菌属样品所提取到的基因组DNA，利用所设计的通用引物对ITS38F/278R对鹅膏菌属样品进行PCR扩增，电泳结果表明，43个样品扩增成功率为100%（43/43），均扩增出长度为290 bp的目的基因片段，且条带单一明亮（如图1所示），表明该引物具有良好的通用性。
3.2 微型DNA条形码的引物适用性分析
用引物对ITS38F/278R对静态模拟消化后的鹅膏菌样品进行PCR扩增，结果表明，经过100℃水煮、模拟口腔消化和模拟胃液消化后，DNA发生降解，无法扩增出长度为650 bp的ITS序列，但可以用引物ITS38F/278R扩增出290 bp左右的目的基因条（图2），表明引物ITS38F/278R的适用性较好，当DNA发生一定降解后，也能扩增出目的基因片段。此外，部分鹅膏菌样品由于保存时间较长，DNA发生一定程度的降解，无法扩增出长度为650 bp左右的ITS序列，却能扩增出长度为290 bp的ITS基因片段（图3），表明所设计的引物对可以有效鉴定储存时间长久、DNA发生降解后的样品。
3.3 微型DNA条形码鉴定物种的准确性
将上述PCR产物纯化后，采用ABI3500基因分析仪进行双向测序，通过对序列进行拼接校对后获得43条DNA微型条形码序列，序列的测序成功率为100%，序列长度为290 bp，G+C含量介于33.33%-45.52%之间，平均G+C含量为40.62%。将引物ITS39F/278R对43份鹅膏菌样品扩增得到的DNA微型条形码序列在NCBI的GenBank数据库进行序列比对鉴别物种来源，比对结果显示，鹅膏菌序列与NCBI数据库中的参考序列相似度在99%以上（表3），即对每个物种的鉴定都能准确地达到种水平。样品编号为CAIQ12021的刻鳞鹅膏菌（Amanita sculpta）和编号为CAIQ12030园足鹅膏菌（Amanita sphaerobulbosa）的DNA微条形码序列比对相似度均小于91%，查询GenBank数据库后发现该库中没有上述两种鹅膏菌ITS序列。43份鹅膏菌样品比对结果与本实验室利用ITS全长DNA条形码鉴定的结果有很好的一致性，表明所设计的ITS微条码具有较好的鉴别能力。
表3 DNA条形码扩增序列比对结果
Figure 271113DEST_PATH_IMAGE002
Figure 367245DEST_PATH_IMAGE003
Figure 78849DEST_PATH_IMAGE004
注：“＋”代表序列在NCBI上比对结果与所给物种名称一致（相似度 ≥99%）；“N”代表NCBI上无该菌基因序列（比对相似度＜95%）。
3.4微型DNA条形码与常规条形码的遗传变异及建树分析
采用K-2-P参数模型计算所用鹅膏菌的种内和种间遗传距离，微型DNA条形码ITS序列的最小种间遗传距离为0.036，种内最大遗传距离为0.008，种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的285倍；种间最小遗传距离远大于种内最大遗传距离，存在明显的Barcodinggap，并且没有种内和种间的交叉重叠，表明ITS片段适合作为微型DNA条形码。基于33个鹅膏菌物种共43条ITS基因序列构建微型条形码（290 bp）与常规DNA条形码（650 bp）的NJ系统发育树（图4）。根据微型DNA条形码NJ树可以看出（图4A），鹅膏菌主要分为两大支，表明所选择的DNA条形码在物种鉴定中具有较高的适用性和可行性。根据常规DNA条形码的NJ树可以看出（图4B），除了致死鹅膏菌（Amanita exitialis）、灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)、白鹅膏菌（Amanita aspericeps）三种鹅膏菌聚类外，其余各鹅膏菌物种之间都能分别聚类。对比分析微型DNA条形码与常规DNA条形码的NJ树，两者在鉴别本研究所用的鹅膏菌物种上具有良好的一致性，说明该微型DNA条形码对本研究中的鹅膏菌具有较好的物种鉴别能力。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌物种鉴定方法及应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Amanita)
<400> 4
aggtgaacct gyggaagatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Amanita)
<400> 3
ttcgctgyrt tcttcatcga 20
<210> 3
<211> 290
<212> DNA
<213> 杵柄鹅膏菌(Amanita sinocitrina)
<400> 3
tgagcatgtg cacgtctttt gctgcttatt tcattcattt ttcctcctgt gcactttttg 60
tagatcgatg cgagagccaa gagatccgtt gttgaaagtt gtaatatatc atttaaaggc 120
ttaaaagcct acaatatcat tctatagaca tgcgaccgtg tttataaaaa tagcatagac 180
acccagactt ttcattgaac agttttcaat gtcaaaaggt caataacctc tcattcccaa 240
gtgtctacaa aaagtgcaca ggaggaaaaa tgaatgaaat aagcagcaaa 290
<210> 4
<211> 290
<212> DNA
<213> 小毒绳鹅膏菌(Amanita melleiceps)
<400> 4
atttcgctgc gttcttcatc gatgcgagag ccaagagatc cgttgttgaa agttgtattt 60
attttttaaa attacattct gtacaacaat tattcatgta tgtgaagaaa atcatagaca 120
gctttgagca atgccaggct gcctacaagc agtgcacaag tggagagaat gaaaaaaaac 180
aaacaaggaa gagacrgtgt gcacatgccc ctaggggacc agctacaacc acttcccccc 240
tgcctgagtt ttatttcaat aatgatcctt ccgcaggttc acctacggaa 290
<210> 5
<211> 290
<212> DNA
<213> 红托鹅膏菌(Amanita rubrovolvata)
<400> 5
ttccgtaggt gaacctgtgg aaggatcatt attgaaagaa atctcaggca aaaggggggt 60
gatggggttg tagctggcct ctaggggcat gtgcacactt tgtctctctc tttcttgctt 120
gtttttccta ttctctccac ttgtgcactg cttgtaggca gccctggcac tgttcaggtt 180
gtctatgatt ttctttacat acatgaatat tgttgtacag aatgtgatat ataatattaa 240
tacaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacaca 290
<210> 6
<211> 290
<212> DNA
<213> 假褐云斑鹅膏菌(Amanita pseudoprinceps)
<400> 6
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tattggattg aaactttggc agatggctgt 60
tgctggttcc ctctgggatg cactgtgcac gccctyttgc ttgtttcatt ctctatcacc 120
tgtgcactat tttgtagact tgttagagtc tatgttatty ttatcataaa cccaatgtta 180
aagaatgtat tgataaaaaa gttatgtata ttatacaact ttcaacaatg gatctcttgg 240
ctcttgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg 290
<210> 7
<211> 290
<212> DNA
<213> 草鸡枞鹅膏菌(Amanita caojizong)
<400> 7
ttctgcaatt cacattactt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc gagaaccaag 60
agatccattg ttgaaagttg taatattttt ttttaccaac attctacaga caatacatgt 120
gtatatataa aacacataga catacctaat aggtagccta caaattatgc acaggtggga 180
taataaacag taagagacgt gcacatgcca tcccctagga ggccagctca aatctccaac 240
catgttttta tttcaataat gatccctccc caggttcacc yacggaaaag 290
<210> 8
<211> 290
<212> DNA
<213> 袁氏鹅膏菌(Amanita yuaniana)
<400> 8
taaaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattat tggatagcaa 60
gagactgtcg ctggcccccc cccccctcct ctggggggta aagtgcacgt ctcttccttt 120
atcttcccca cctgtgcact gatgtgtaga ccccctttgg tgtctatgat atatcacata 180
caagaatgta tcagtttttg tgtattataa aacaatatta caactttcaa caatggatct 240
cttggctctt gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg 290
<210> 9
<211> 290
<212> DNA
<213> 异味鹅膏菌(Amanita kotohiraensis)
<400> 9
cattatcgag tttaaaaagc catagactgg aggctgtagc tggtcacatt tatgtggcat 60
tgtgcacgtc tctgtctaat ggaatttcca cctgtgcacg tattgtaggc acgttgaagt 120
gcctatgttt ttgtaattta aaacatgtgc gaaagtgtaa agaatgaagt gtgttatatt 180
aaatacaact ttcaacaatg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240
gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 290
<210> 10
<211> 289
<212> DNA
<213> 裂皮鹅膏菌(Amanita rimosa)
<400> 10
agccaagaga tccgttgttg aaagttgtat tttacatggt aatcatatca ttctataaac 60
atgcaactgg tgttttaaaa atggcataga cacccagaga ttggaaagtt caatttctca 120
aggggctggt taaagtctct cattcccaag tgtctacaag catgcacagg tggaattaat 180
aatgaccaga ggcgtgcaca tgcctatata tgagccagca acagcctcaa ggttcatttt 240
ctttaatgat ccttccgcag gttcacctac ggaaaccttg ttacgactt 289
<210> 11
<211> 290
<212> DNA
<213> 欧式鹅膏菌(Amanita oberwinklerana)
<400> 11
tacaaaaagg cttgaggctg ttgctggtga cattttaatt gtgacacatg tgcacgtctc 60
ttgcttattt gataactatt tccacctgtg catgatgtgt agatgcctag gatttgaggg 120
aacagaggtt tttttagtgg cttttgtttt tataaatcga ggtgtctatg ttttattaca 180
cttttatggt attggatgat ttgtgaacgt ggaataataa taaagaaata aaagtacaac 240
tttcaacaat ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 290
<210> 12
<211> 290
<212> DNA
<213> 灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)
<400> 12
aggatcatta aagaaatgaa ccttgagact gtcgctggcc cctcctgcag atggagttgg 60
catgtgcacg tctctggtca ttaccaattc cacctgtgca cacttgtaga cacttgggaa 120
tgagagacat gggctgcttg gctggtctct tgagagagag aaatggaaaa aatctgggtg 180
tctatgccat ttttattaaa cactagttgc atgtttatag aatgaatgat gatttgattg 240
aatatgaaat acaactttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 290
<210> 13
<211> 290
<212> DNA
<213> 灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)
<400> 13
aggatcatta aagaaatgaa ccttgagact gtcgctggcc cctcctgcag atggagttgg 60
catgtgcacg tctctggtca ttaccaattc cacctgtgca cacttgtaga cacttgggaa 120
tgagagacat gggctgcttg gctggtctct tgagagagag aaatggaaaa aatctgggtg 180
tctatgccat ttttattaaa cactagttgc atgtttatag aatgaatgat gatttgattg 240
aatatgaaat acaactttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 290
<210> 14
<211> 290
<212> DNA
<213> 灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)
<400> 14
aggatcatta aagaaatgaa ccttgagact gtcgctggcc cctcctgcag atggagttgg 60
catgtgcacg tctctggtca ttaccaattc cacctgtgca cacttgtaga cacttgggaa 120
tgagagacat gggctgcttg gctggtctct tgagagagag aaatggaaaa aatctgggtg 180
tctatgccat ttttattaaa cactagttgc atgtttatag aatgaatgat gatttgattg 240
aatatgaaat acaactttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 290
<210> 16
<211> 290
<212> DNA
<213> 球基鹅膏菌(Amanita subglobosa)
<400> 16
ctgcgttctt catcgatgcg agagccaaga gatccgttgt tgaaagttgt attattattt 60
ttttatcaca ttctgtacaa caatgattca tgtatgtaaa ataaaatcat agacaacccg 120
aacaatgcca ggctgcctac aagcagtgca caagtggaaa gaatgaaaaa acaaacaaga 180
gaaagagaca gtgtgcacat gcccttatta gggggccagc tacaaccaca ctcccccctg 240
cctgagtttt atttcaataa tgtccttccg caggttcacc tacggaaacc 290
<210> 16
<211> 290
<212> DNA
<213> 假黄盖鹅膏菌(Amanita pseudogemmata)
<400> 16
ttccgtagtg actgcggagg tcattaatga gtgaacttga aggctgttgc tggctccctg 60
gggagtatgt gcacgtctca agtcatcatc aatttcacct gtgcactaat gtagatgctt 120
gggaatgaga gactttgacc agtcttttgg tagttgaagt ctgggtgtct atgttttttt 180
gattaaacac ttaatgggtc atgaatggta aagatttggc tttttgacaa gcctatgtaa 240
ttataatgca caactttcaa caatggatct cttggctctt gcatcgatga 290
<210> 17
<211> 290
<212> DNA
<213> 锥鳞白鹅膏菌(Amanita virgineoides)
<400> 17
taggctttga ggctgtcgct ggtcaccttt gaaaagaggt gtcatgtgca cgtctcttgc 60
tatttggatt atttccacct gtgcacatat tgtagatgac ctaggattga gtggcattaa 120
ttggccactt gttctgtaaa tatctaggtg tgtctatgtg attttgtata tacacatacg 180
atatgaatgt ctaaagaatg taaagaaagg gaatctctgt ttaagggaaa cctgaaatat 240
tattatacca cctttcacca acgggatctc ttggctctcg catcgatgaa 290
<210> 18
<211> 290
<212> DNA
<213> 锥鳞白鹅膏菌(Amanita virgineoides)
<400> 18
taggctttga ggctgtcgct ggtcaccttt gaaaagaggt gtcatgtgca cgtctcttgc 60
tatttggatt atttccacct gtgcacatat tgtagatgac ctaggattga gtggcattaa 120
ttggccactt gttctgtaaa tatctaggtg tgtctatgtg attttgtata tacacatacg 180
atatgaatgt ctaaagaatg taaagaaagg gaatctctgt ttaagggaaa cctgaaatat 240
tattatacca cctttcacca acgggatctc ttggctctcg catcgatgaa 290
<210> 19
<211> 290
<212> DNA
<213> 拟卵盖鹅膏菌(Amanita neoovoidea)
<400> 19
cattaatgat tttttaaaaa taaatggtta gggactgtag ctggccacat cttggggcat 60
gtgcacgtct cttgctgttt agcttatccc acctgtgcat caatttgtag acttccctag 120
gatgtttgga ggctttgatc gggctcctgt ttaggatcta ggtgtctatg cggttttttt 180
taataataca ctatgtgatt ttgaatgtcc tacagaatgt gaatgtttta aacttatata 240
taactttcaa caatggatct cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc 290
<210> 20
<211> 290
<212> DNA
<213> 鹅膏一种菌(Amanita minutisquama)
<400> 20
cattattgaa taaaaacaaa actagctgtg ggaggctgtt gctggtcctt tgggggcatg 60
tgcacgtctt ttgctgttgg ttttcccccc cttccacctg tgcatgattt gtagatttcc 120
taggatttga gagactttta tcgggctctt gttgatattc tctaggtgtc tatgtatgtt 180
ttaacatata ctttgcttgt atgtctatag aatgtcaatt gttttgtttg agcattcaga 240
caaattaata taactttcaa caatggatct cttggctctc gcatcgatga 290
<210> 21
<211> 290
<212> DNA
<213> 致死鹅膏菌(Amanita exitialis)
<400> 21
gctgtgttct tcatcgatgc gagagccaag agatccgttg ttgaaagttg tactttatat 60
atatattcaa atcatcattc tataaacatg caactagtgt ttaataaaat gccatagaca 120
cccagatttc aacttctcaa gagactggtc aaagcctctc attcccaagt gtctacaagt 180
gtgcacaggt ggaattggta atgaccagag acgtgcacat gcccagatgg gccagcgaca 240
gcctcaagat tcatttcatt aatgatcctt ccrcaggttc acctacggaa 290
<210> 22
<211> 290
<212> DNA
<213> 土红鹅膏菌(Amanita rufoferruginea)
<400> 22
ggggggaagg gaaggaaaag gcagttgtag ctggttctta atgaacatgt gcacactgtt 60
gcctctcttt cttttgcttg tttcttcatt ttcttctcca cttgtgcact gtttgtagac 120
aatcctggac tactgttaca agtgtgtctt tacacagggt tttgtctatg attttcttta 180
tacactttgc atataaaaga atatagagtg tctttayaaa aagaagttaa atacaacttt 240
caacaacgga tctcttggct ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 290
<210> 23
<211> 257
<212> DNA
<213> 刻鳞鹅膏菌(Amanita sculpta)
<400> 23
tgctgyattc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgattcatt 60
tgtttgccgc aaagggccac tcagaagaaa ttccgctatg gtaaacatga gagttttggg 120
tcccccggcg ggcgcctgga tccggggcac aggtgtcccg gggcggtccc gccgaagcaa 180
cgtagaggta aggttcacag tgggtttggg agttgtataa ctcggtaatg atccctccgc 240
aggttcacct acggaag 257
<210> 24
<211> 289
<212> DNA
<213> 裂皮鹅膏菌(Amanita rimosa)
<400> 24
agccaagaga tccgttgttg aaagttgtat tttacatggt aatcatatca ttctataaac 60
atgcaactgg tgttttaaaa atggcataga cacccagaga ttggaaagtt caatttctca 120
aggggctggt taaagtctct cattcccaag tgtctacaag catgcacagg tggaattaat 180
aatgaccaga ggcgtgcaca tgcctatata tgagccagca acagcctcaa ggttcatttt 240
ctttaatgat ccttccgcag gttcacctac ggaaaccttg ttacgactt 289
<210> 25
<211> 289
<212> DNA
<213> 裂皮鹅膏菌(Amanita rimosa)
<400> 25
agccaagaga tccgttgttg aaagttgtat tttacatggt aatcatatca ttctataaac 60
atgcaactgg tgttttaaaa atggcataga cacccagaga ttggaaagtt caatttctca 120
aggggctggt taaagtctct cattcccaag tgtctacaag catgcacagg tggaattaat 180
aatgaccaga ggcgtgcaca tgcctatata tgagccagca acagcctcaa ggttcatttt 240
ctttaatgat ccttccgcag gttcacctac ggaaaccttg ttacgactt 289
<210> 26
<211> 290
<212> DNA
<213> 东方褐盖鹅膏菌(Amanita orientifulva)
<400> 26
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgaacgaaa cacttctggc tttgtgttgt 60
tgtgctggcc gtttgggcaa tgtgcacgca gctctggtcg gttgtttctt ctgttccacc 120
tgtgcactgc ctgtagacac ccagtgtcta tgatatttgt tacacacaac atgatgttag 180
ttggcatgtt aatatatgat aaatatacaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 240
tcgatgaaga acacagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaatcc 290
<210> 27
<211> 290
<212> DNA
<213> 黄柄鹅膏菌(Amanita flavipes)
<400> 27
aaggatcatt actgagcgaa atgggtggca aggctgtcgc tggctcaaac gagcatgtgc 60
acgtcttttg ctgcttgctt cattctcttt tccacctgtg cactctttgt agacactcgg 120
gatgggagag aggttggcat tgatggttga cctctcttga tattgaaaag tctgggtgtc 180
tatgtatttt ttgacataca cggttgaatg tccatagaat gaaatgtagg cttttgtcag 240
cctttaaatg ataaaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc 290
<210> 28
<211> 290
<212> DNA
<213> 假淡红鹅膏菌(Amanita vaginata)
<400> 28
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ctgaaatgaa ccttgaggct gttgctggcc 60
catctgggca tgtgcacgtc tctggtcatt accaattcca cctgtgcaca cttgtagaca 120
cttgggaatg agagactttg accagtctct tgagagaatt gaaatctggg tgtctatgcc 180
attttaccaa acactagttg catgtttata gaatgattat ttgattgaat ataaatacaa 240
ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa 290
<210> 29
<211> 290
<212> DNA
<213> 假淡红鹅膏菌(Amanita vaginata)
<400> 29
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ctgaaatgaa ccttgaggct gttgctggcc 60
catctgggca tgtgcacgtc tctggtcatt accaattcca cctgtgcaca cttgtagaca 120
cttgggaatg agagactttg accagtctct tgagagaatt gaaatctggg tgtctatgcc 180
attttaccaa acactagttg catgtttata gaatgattat ttgattgaat ataaatacaa 240
ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa 290
<210> 30
<211> 290
<212> DNA
<213> 托鹅膏菌(Amanita vaginata)
<400> 30
tttcagtagg tgaacctgcg gaaggatcat tatcgaatga aactgctggc tagatgctgt 60
tgtgctggcc ctttggggca atgtgcacac ctctggtcat ttgtttcttc tgttccacct 120
gtgcactgcc tgtagacact ctgtgtctat gataatgtta caaacacaca tgtaatatga 180
gatataataa taacgataat aaagtacaac tttcaacaat ggatctcttg gctctcgcat 240
cgatgaagaa cacagcgaaa tgtgataagt aatgtgaatt gcagaatcca 290
<210> 31
<211> 290
<212> DNA
<213> 托鹅膏菌(Amanita vaginata)
<400> 31
tttcagtagg tgaacctgcg gaaggatcat tatcgaatga aactgctggc tagatgctgt 60
tgtgctggcc ctttggggca atgtgcacac ctctggtcat ttgtttcttc tgttccacct 120
gtgcactgcc tgtagacact ctgtgtctat gataatgtta caaacacaca tgtaatatga 180
gatataataa taacgataat aaagtacaac tttcaacaat ggatctcttg gctctcgcat 240
cgatgaagaa cacagcgaaa tgtgataagt aatgtgaatt gcagaatcca 290
<210> 32
<211> 288
<212> DNA
<213> 园足鹅膏菌(Amanita sphaerobulbosa)
<400> 32
tgttgaagtg tataatattt ttttctccaa ggctaaaaac ataaaagcca aagataatta 60
atcacattct tctacacatt ccaatggata tgtttaaaaa aaaacataga catttaaata 120
ttcccaagag actaatcaaa acaaaaaaag tctccttcat ttctagatgc ctacaattca 180
tgcacagggg gaggaagaaa aataaataca acagtaagaa acgtgcacat ttctcttccc 240
tttctccccc cctttatcag aaccagtaca gtctcaaaac cagtgcat 288
<210> 33
<211> 290
<212> DNA
<213> 格纹鹅膏菌(Amanita fritillaria)
<400> 33
aaagagcatg tgcacgtctt ttgctgcttg attcattctc tttccacctg tgcactcttt 60
gtagacactt gggaatgggg tcttgatacc aaaaagttct ctgggtgtct atgtactttt 120
tttgatacac gcagttgaat gtctatagaa tgagatttgt aggctttttt taaatggcct 180
ttaaatgatg aaatacaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac 240
gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 290
<210> 34
<211> 290
<212> DNA
<213> 淡红鹅膏菌(Amanita pallidorosea)
<400> 34
ttccgtaggt gaacctgtgg aaggatcatt actgaaatga accttgaggc tgtcgctggc 60
ccatctgggc atgtgcacgt ctctggtcat taccaattcc acctgtgcac acttgtagac 120
acttgggaat gagagacttt gaccagtctc ttgagagaat tgaaatctgg gtgtctatgc 180
cattttacca aacactagtt gcatgtttat agaatgatta tttgattgaa tatataaata 240
caactttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacacagc 290
<210> 35
<211> 290
<212> DNA
<213> 淡红鹅膏菌(Amanita pallidorosea)
<400> 35
ttccgtaggt gaacctgtgg aaggatcatt actgaaatga accttgaggc tgtcgctggc 60
ccatctgggc atgtgcacgt ctctggtcat taccaattcc acctgtgcac acttgtagac 120
acttgggaat gagagacttt gaccagtctc ttgagagaat tgaaatctgg gtgtctatgc 180
cattttacca aacactagtt gcatgtttat agaatgatta tttgattgaa tatataaata 240
caactttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacacagc 290
<210> 36
<211> 290
<212> DNA
<213> 隐青花鹅膏菌(Amanita manginiana)
<400> 36
ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt attgaaataa aaacatggtt ggagatttga 60
gctggcctcc tgaggatggc atgtgcacgt ctcttactgt ttattatccc acctgtgcat 120
gatttgtagg ctacctatta ggtgtgtcta tgtgttttat atatacacat gtattgtctg 180
tagaatgttg gtgaaaaaaa aatattacaa ctttcaacaa tggatctctt ggttctcgca 240
tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc 290
<210> 37
<211> 290
<212> DNA
<213> 园足鹅膏菌(Amanita sphaerobulbosa)
<400> 37
cattattgaa taagagcctg agtagtttgg agattgttgc tggtctggtt tataaggaca 60
tgtgcacgtc tctggctatt tggttttttt cttcttctcc acctgtgcac aaaatgtaga 120
tgccttagga cttgagagac cttttaaacc agtctcttgc tttataaata tctctggggt 180
atctatgtga ttttattcat atacactttg tatgttttat agaatgattg ttattgagct 240
cattaattga gtaaaaataa aaataaaaca actttcaaca atggatctct 290
<210> 38
<211> 290
<212> DNA
<213> 中华鹅膏菌(Amanita sinensis)
<400> 38
aggtggttgt agctggtcct taggggcatg tgcacactgt ctctctttct ctcttgcttg 60
tttcttcatc ctctccactt gtgcactgtt tgtaggcagc ctggcactgt tctgggttgt 120
ctatgatttt ctttacacac atgaacaact gttgtacaga atgtgatagt aatacaatac 180
aactttcaac aacggatctc ttggctcttg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240
agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcatc 290
<210> 39
<211> 290
<212> DNA
<213> 白鹅膏菌(Amanita aspericeps)
<400> 39
atcattattg aataaatggt ggcacaaggc tgttgctggc gctctcaatg aaaggcatgt 60
gcacgtcttg tgttgctgac ttactctatt ttccacctgt gcatattttg tagacacttg 120
ggaatgagag actctgacca gtttcttggt tatgaactgg gtgtctatgt gtttttcata 180
cacacacata tgttgtatgt acatagaatg tgaatcaaaa gtaaatatac aactttcaac 240
aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 290
<210> 40
<211> 290
<212> DNA
<213> 爪哇鹅膏菌(Amanita javanica)
<400> 40
cttcgtaggt gaactgcgga aggatcatta ttggaatgaa aagaggctgt tgctattgct 60
gggcaactag ccaatgtgca cgcctttttg tctaaatttc cttctccctg tgcaccactt 120
gtagactttt ccctgtctat gattatatat cacataacct tatgaatgcc cttgtaatat 180
atatgtgttt acacattata caactttcaa caatggatct cttggctctc gcatcgatga 240
agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat 290
<210> 41
<211> 290
<212> DNA
<213> 暗盖淡鹅膏菌(Amanita sepiacea)
<400> 41
ccgttgggga acctgacgaa ggatcattat tgaacgaaaa gggtggcaag gctgtcgctg 60
gcttgaatga gcatgtgcac gtcttttgct gcttatttca ttctattttt ccacctgtgc 120
actttttgta gacacttggg aatgagrggt tgaattgaat tgattgacct cttgatattc 180
aaaagtctgg gtgtctatgc atttttatat acacacagtt gcatgtctat agaatgatgt 240
ttaggctctt tattaagcct ttaaatgata aagtacaact ttcaacaacg 290
<210> 42
<211> 290
<212> DNA
<213> 东方褐盖鹅膏菌(Amanita orientifulva)
<400> 42
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgaacgaaa cacttctggc tttgtgttgt 60
tgtgctggcc gtttgggcaa tgtgcacgca gctctggtcg gttgtttctt ctgttccacc 120
tgtgcactgc ctgtagacac ccagtgtcta tgatatttgt tacacacaac atgatgttag 180
ttggcatgtt aatatatgat aaatatacaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 240
tcgatgaaga acacagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaatcc 290
<210> 43
<211> 290
<212> DNA
<213> 东方褐盖鹅膏菌(Amanita orientifulva)
<400> 43
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgaacgaaa cacttctggc tttgtgttgt 60
tgtgctggcc gtttgggcaa tgtgcacgca gctctggtcg gttgtttctt ctgttccacc 120
tgtgcactgc ctgtagacac ccagtgtcta tgatatttgt tacacacaac atgatgttag 180
ttggcatgtt aatatatgat aaatatacaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 240
tcgatgaaga acacagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaatcc 290
<210> 44
<211> 289
<212> DNA
<213> 长柄鹅膏菌(Amanita altipes)
<400> 44
ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattat tgaaataaaa ctcaggcagg gggaggtggg 60
ttgtagctgg tccccctagg ggcatgtgca cacttgtttc tctcttgctt gtttttttca 120
ttctctccac ttgtgcactg cttgtaggca gcttggcact gttcaggctg tctatgattt 180
tctttacata catgtgttat acagaatgtg ataaattaat aaaaagagta atacaacttt 240
caacaacgga tctcttggct ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatg 289
<210> 45
<211> 290
<212> DNA
<213> 小豹斑鹅膏菌(Amanita parvipantherina)
<400> 45
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tattgaaata aaactcaggc aggggggagt 60
gtggttgtag ctggccccta atataagggc atgtgcacac tgtctctttc tcttgtttgt 120
tttttcattc tttccacttg tgcactgctt gtaggcagcc tagcattgtt tgggctgtct 180
atgattttct tttacataca tgaatcattg ttgtacagaa tgtgataaaa aataataata 240
caactttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacacagc 290

Claims (2)

1.一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取待测样品的基因组DNA；
2）以步骤1）中提取的DNA作为模板，使用自主设计的引物MiniITS-F和MiniITS-R进行PCR扩增反应，引物名称及编码序列为:
正向 MiniITS-F: AGGTGAACCTGYGGAAGATC；
反向 MiniITS-R: TTCGCTGYRTTCTTCATCGA；
3）使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将PCR产物纯化后进行测序；
4）将测序结果在NCBI数据库中与参考序列进行比对，选取序列相似度在98%以上，相似度最高的物种作为所测样品的物种信息。
2.一种如权利要求1所述的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法的应用，其特征在于，该方法用于分析鹅膏菌或误食后的呕吐物等。
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