CN114058726A

CN114058726A - 用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN114058726A
Application number: CN202111279445.4A
Authority: CN
Inventors: 张玉; 姜帆; 朱水芳; 石俊霞; 王超楠
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN114058726B

Abstract

本发明公开了一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法，所述引物组包括引物AconF、qAconR，其核苷酸序列为：AconF：GTCTCTCTTCTTGCTTGTTTC，qAconR：AAATCCAAAACACACTCAAAAAGAGC；鉴定方法包括如下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)采用所述的引物组或者试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为环鳞鹅膏，本发明建立了具有广泛适用性的有毒蘑菇环鳞鹅膏快速鉴定技术体系，革新检测手段和措施，实现有毒蘑菇快速鉴定。

Description

用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及蘑菇种质鉴定技术领域，具体涉及一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

一些有毒菌类与可食菌类外形相似、且生长季节和生长环境相同，混杂生长在一起，容易被人当成可食菌类采用。而误食野生毒蘑菇可能会造成急性肝损害、急性肾衰竭、肠胃炎等严重后果。

常见野生毒蘑菇中，鹅膏科(Amanitaceae)鹅膏属(Amanita)部分真菌因含有鹅膏肽类毒素而具有致毒性，如环鳞鹅膏(Amanita concentrica)，该真菌收录于生态环境部中国科学院发布的《中国生物多样性红色名录-大型真菌卷》名录中，并且被评估为DD等级。

在误食有毒蘑菇急救中存在事发突然、形态学鉴定难等棘手难题，且目前我国对有毒生物危害整体关注与研究较少，没有形成成熟的检测鉴定技术方法、试剂和标准，无法及时诊断出中毒原因、甚至出现误诊，给人民生命安全和健康带来了重大隐患。所以，开展有毒蘑菇快速定性检测技术研究具有重要意义。

发明内容

针对上述领域存在的空白和需求，本发明提供一种能够快速、准确鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的引物组、试剂盒，具体技术方案如下：

一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组，所述引物组包括引物AconF、qAconR，其核苷酸序列为：

AconF：GTCTCTCTTCTTGCTTGTTTC，

qAconR：AAATCCAAAACACACTCAAAAAGAGC。

在另一技术方案中，所述引物组还包括探针AconU，探针AconU的核苷酸序列为：AGGCAGCCTTGGCACTGTTCAGGT；

优选探针AconU的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；进一步优选所述荧光报告基团为VIC，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的试剂盒，包含上述的引物组，还包含PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂。

所述的试剂盒，还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。

本发明的另一方面提供一种鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用上述的引物组或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为环鳞鹅膏阳性，所述目的扩增片段的大小为341bp。

所述的方法，所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，其中，2×Taq PCRMasterMix 12.5μl、浓度为10μM的正反向引物各1μl、基因组DNA 1μl、余量为ddH2O；所述步骤2) 中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s， 35个循环。

所述的方法，所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。

本发明的再一方面提供一种鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的实时荧光PCR方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求2所述的引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒，对提取的基因组 DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否含有环鳞鹅膏，如果Ct≤30则判断为环鳞鹅膏阳性。

所述实时荧光PCR的反应体系为：总体积20μl，其中2×T5 Fast qPCR Mix 10μl、浓度为10μM的引物AconF/qAconR各1μl、浓度为10μM的探针AconU 0.5μl、基因组DNA 1μl，余量为ddH₂O：qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环。

本发明的最后一方面提供前述的引物组或者试剂盒在鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏中的应用。本发明的有益效果：

本发明基于与环鳞鹅膏在形态上不容易分辨的几十种蘑菇，建立了快速鉴定毒蘑菇环鳞鹅膏的技术，通过本发明提供的引物组、试剂盒和检测方法，能够快速准确地成功地将环鳞鹅膏与其它蘑菇品种快速区分开来，检测特异性强；检测灵敏度高达10^-5ng/μl，可以用于在包含蘑菇材料的食品中检测是否含有环鳞鹅膏材料。

附图说明

图1是用于环鳞鹅膏鉴定的引物组的特异性验证结果图，

其中，泳道1-23分别为DNA分子量标准、近短柄乳菇、大青褶伞、蓝亚齿菌、环鳞鹅膏、橙黄蜡蘑、新苦粉孢牛肝菌、考夫曼网柄牛肝菌、玫瑰红菇、长大环柄菇、栎裸柄伞、点柄黄红菇、细皮囊体红菇、密褶红菇、灰褶鹅膏、深红条孢牛肝菌、小豹斑鹅膏、爪哇鹅膏菌、锥鳞白鹅膏、假褐云斑鹅膏、芥黄鹅膏、异味鹅膏、淡红鹅膏。

图2是用于环鳞鹅膏鉴定的引物组的灵敏度检测结果图，

其中，泳道1为DNA分子量标准，泳道2-12分别为以下浓度的PCR产物稀释液的扩增产物：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、 10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl，泳道13为TE缓冲液对照PCR扩增产物。

图3是实时荧光PCR检测结果图，其中样品编号与蘑菇品种对应关系为：

A1：1-近短柄乳菇 A2：10-考夫曼网柄牛肝菌

B1：2-大青褶伞 B2：11-玫瑰红菇

C1：4-蓝亚齿菌 C2：12-长大环柄菇

D1：5-灰褶鹅膏 D2：13-栎裸柄伞

E1：6-环鳞鹅膏 E2：14-点柄黄红菇

F1：7-爪哇鹅膏菌 F2：15-细皮囊体红菇

G1：8-橙黄蜡蘑 G2：18-密褶红菇

H1：9-新苦粉孢牛肝菌 H2：Sample86-细皮囊体红菇

A3：22-淡红鹅膏

B3：24-灰褶鹅膏

C3：26-深红条孢牛肝菌 A4：33-假褐云斑鹅膏

D3：27-新苦粉孢牛肝菌 B4：34-芥黄鹅膏

E3：28-小豹斑鹅膏 C4：35-异味鹅膏

F3：29-小豹斑鹅膏 D4：36-ddH₂O

G3：31-爪哇鹅膏菌

H3：Sample87-锥鳞白鹅膏

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各实施例中所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，均可通过商购获得。

实施例1.引物和探针的设计

一、选择供试蘑菇

供试蘑菇样品：湿样-20℃保存，干样常温保存，采用的供试蘑菇样品详见表1。

表1供试蘑菇样品种类

二、有毒蘑菇环鳞鹅膏特异引物的设计

对小豹斑鹅膏、假褐云斑鹅膏、淡红鹅膏、细皮囊体红菇、密褶红菇、深红条孢牛肝菌、栎裸柄伞七种蘑菇的ITS基因进行DNA测序，序列依次如SEQ ID NO.5～NO.11所示，结合BOLD system检索得到所有供试蘑菇的基因组核糖体序列。

对所获得的序列用DNAMAN软件(美国LynnonBiosoft公司开发的高度集成化的分子生物学综合应用软件)进行多序列比对，寻找能够将有毒蘑菇环鳞鹅膏与其他蘑菇特异性区分的位点。发现在环鳞鹅膏ITS基因(SEQ ID NO.1所示，GenBank登录号:MW192487.1)的100bp-140bp区间，以及410bp-460bp区间与其它蘑菇存在特异性，适合用于设计上下游特异性引物，对候选引物进行特异性和灵敏性筛选和评估，选出的引物如下(表2)：

表2鉴定环鳞鹅膏的特异引物

实施例2.引物特异性和灵敏度验证

(1)DNA提取

利用“植物基因组DNA提取试剂盒”(购自北京索莱宝科技有限公司)对表1中的蘑菇样品进行基因组DNA提取，用于引物的特异性验证，具体操作流程参照DNA提取试剂盒说明书。

(2)引物特异性验证：

以步骤(1)提取的DNA为模板，利用表2中的引物进行PCR扩增(扩增试剂2×TaqPCR MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司，货号KT201)，通过不断调整PCR反应试剂用量以及退火温度、时间等，确定最终的反应体系。

扩增反应结束后，取5μl PCR特异的扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。

结果如图1所示，结果表明AconF/qAconR引物组在该的PCR反应体系和反应条件下，对且仅对环鳞鹅膏(图1中泳道5)发生阳性反应，产生特异性目的条带(条带大小341bp左右)，对其余蘑菇均为阴性反应(无特异性条带产生)，说明AconF/qAconR引物组具有高度特异性，能够将环鳞鹅膏与鹅膏科其它蘑菇区分开，也能将环鳞鹅膏与其它科中与环鳞鹅膏外形近似的蘑菇区分出来。图1中泳道1-23分别为DNA分子量标准、近短柄乳菇、大青褶伞、蓝亚齿菌、环鳞鹅膏、橙黄蜡蘑、新苦粉孢牛肝菌、考夫曼网柄牛肝菌、玫瑰红菇、长大环柄菇、栎裸柄伞、点柄黄红菇、细皮囊体红菇、密褶红菇、灰褶鹅膏、深红条孢牛肝菌、小豹斑鹅膏、爪哇鹅膏菌、锥鳞白鹅膏、假褐云斑鹅膏、芥黄鹅膏、异味鹅膏、淡红鹅膏。

(3)灵敏度检测：

使用“DNA凝胶回收试剂盒”(购自北京擎科生物科技有限公司)回收纯化PCR产物。用TE缓冲液进行系列稀释，得到不同稀释液，浓度为别为：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、 10^- ¹ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl。分别以每种稀释液为模板(TE缓冲液为阴性对照)，用引物组AconF/qAconR对不同浓度的模板进行PCR扩增。

PCR反应体系和扩增条件同步骤(2)。扩增反应结束后，取5ul PCR特异的扩增产物在 1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。

各个稀释液PCR扩增产物电泳结果见图2，图2中泳道1为DNA分子量标准，泳道2-12分别为以下浓度的PCR扩增产物稀释液作为模板的扩增结果：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl、10^-7ng/μl、10^-8ng/μl，泳道 13为TE缓冲液对照PCR扩增产物，从图2的结果可以得知：采用引物组AconF/qAconR可检测的模板浓度可达到10^-5ng/μl，检测灵敏度高。

实施例3.实时荧光PCR鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏

按照实施例2的方法提取环鳞鹅膏的基因组DNA作为实时荧光PCR扩增模板，并提取其它蘑菇品种的基因组DNA作为对照，以ddH₂O为阴性对照，采用Taqman荧光探针的方法进行实时荧光PCR反应。

qPCR反应体系为：总体积20μl，其中2×T5 Fast qPCR Mix(北京擎科生物科技有限公司，货号TSE301)10μl、浓度为10μM的引物AconF/qAconR各1μl、浓度为10μM的探针AconU 0.5μl、DNA模板1μl，余量为ddH₂O。qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环；最后40℃30s冷却。

结果如图3所示，对22种蘑菇的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线显示只有环鳞鹅膏有特异性扩增，CT值为15.2，即从第15个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他21种蘑菇和ddH₂O对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对环鳞鹅膏有种的特异性，如果Ct≤30则判断为环鳞鹅膏阳性，Ct>30则判断为环鳞鹅膏阴性。本发明的引物和探针适于采用实时荧光PCR鉴定环鳞鹅膏，且特异性良好。

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 环鳞鹅膏ITS基因

<400> 1

gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt attgaaagaa acctcaggca 60

aaagaggaag ggatggttgt agctggcctt tagtaggggc atgtgcacac tgtctctctt 120

cttgcttgtt tcttcattct ctccacttgt gcactgtttg taggcagcct tggcactgtt 180

caggttgtct atgaatcttc tttatataca ttgaataact gttgtaatag aatgtcatta 240

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cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 360

tcttgcgctc cttggtattc tgaggagcat gcctgtttga gtgtcattaa attctgtcaa 420

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tgacttcaaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca 700

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 环鳞鹅膏特异性上游引物

<400> 2

gtctctcttc ttgcttgttt c 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 环鳞鹅膏特异性下游引物

<400> 3

aaatccaaaa cacactcaaa aagagc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 环鳞鹅膏特异性探针序列

<400> 4

aggcagcctt ggcactgttc aggt 24

<210> 5

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小豹斑鹅膏ITS基因序列

<400> 5

tggaggtttt aaaaattgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattatt 60

gaaataaaaa ttcaggccag ggaagaggta gttgtagctg gcccctaggg gcatgtgcac 120

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aggttgcagg tgaagtgcag tgaatctctc tgctctctaa ttgacaattt gtctgataac 660

tgacctcaaa tcaggtagac gcccgc 686

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 假褐云斑鹅膏ITS基因序列

<400> 6

tattttttgg ggggtaaaag attttacaag gtttccgtag gtgaacctgc ggaaggatca 60

ttattcgaat aataaaaaac tggtggggga ctgtagctgg tcacattttg ggacatgtgc 120

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atacataaat gaatttgaat gttttgatga attatataaa gtacaacttt caacaacgga 300

tctcttggct ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca 360

gaattcagtg aatcatcgag tttttgaacg catcttgcgc tccttccgag gagtatgcct 420

gtttgagtgt catttaatta tcaaaagtgc tccaattttg ttggagtggt tttggagtgt 480

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ctggattcgg cctaattagt gtgataaaag agaaattgat cactagaaaa agggctttac 600

ctggctttgc tgattgttta tactagcttg gctagaaaat aatgacgaaa tcggacctca 660

aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatcaaaa agggggggga aaaaaagaag 720

<210> 7

<211> 679

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 淡红鹅膏ITS基因序列

<400> 7

aaattttgag gaaaaaaaaa aattacaagg tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat 60

tactgaaatg aaccttgagg ctgttgctgg cccatctggg catgtgcacg tctctggtca 120

ttaccaattc cacctgtgca cacttgtaga cacttgggaa tgagagactt tgaccagtct 180

cttgagagaa ttgaaatctg ggtgtctatg ccattttacc aaacactagt tgcatgttta 240

tagaatgatt atttgattga atataaatac aactttcaac aacggatctc ttggctctcg 300

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 360

atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct tggcattccg aggagcatgc ctgtttgagt 420

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cctaactgtc tgacccactt gacctcaaat caggtaggac tacccgctga acttaacatt 660

aaaaaacggg ggggaaaaa 679

<210> 8

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细皮囊体红菇ITS基因序列

<400> 8

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatcgtac 60

aacggaggtg ccgagggctg tcgctgacct tccaaggtcg tgcacgcccc caagccctct 120

ctcacaatcc atctcaccct ttgtgcatca ccgcgtgggt cccctttgcg ggagggctcg 180

cgttttcaca taaaactcaa tacaagtgta gaatgttcgt tttttgcggt cacacgcgat 240

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gacaacgatg gtgcttcggt caccgccatc tacattggcg ggaaggctgg acccacaaaa 660

aaaaaagaat cttgacctca aatcgggtga gactacccgc tgaacttaag catatcaata 720

agcggagga 729

<210> 9

<211> 703

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密褶红菇ITS基因序列

<400> 9

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatggtac 60

tacagaggca tgaaggttgt cgctgacctt tctgaaaggt cgtgcacgcc ggagtgctct 120

cacacacaat ccacctcacc acttgtgctt caccgcgcgg ggtcgcttcc tcttggcttg 180

ctccgagagg gggaggcttg cgtcacccac acacacacac acaatataca gtctggtagt 240

ttagaatgtc aatcaataca actttcaaca atggatctct tggctctcgc atcgatgaag 300

aacgcagcga aatgcgatac gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 360

gaacgcacct tgcacccctt ggtattccga ggggtacacc cgtttgagtg tcgtgaattt 420

ctcaaacctt cttggtttct tgatcaagaa ggctttggac ttggaggtct ttgccggctt 480

tgtgaaaaag tcggctcctc ttaaatgcat tagtgggatc ccctttgccg atctctaggc 540

gttgataata tgcttctacg tcttgggatt tgctctgttc tttgggaact cgcttctaac 600

cgtctcggtc ggagacatcg ttcgagcttg ctcgacccac gaaccttgac ctcaaatcgg 660

gtgagactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga gga 703

<210> 10

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 深红条孢牛肝菌ITS基因序列

<400> 10

gggctgtcac ctgatttgag gtcagtttca atgtgaaagc gttagatcag agatcatctg 60

ttccccgagt ctgtcccctg ccgcgcgttc gccagagttc caggattagg actccagcta 120

atagctaagc ttgactgagc aaggatcacc ttcccatccc tgtctttttt ctttctcatt 180

agaagccaat gggcttacaa tattgccatc ccagacgctc cagccacgac gatcattatc 240

acgccggagg ccgtgcacgt ccaaagactt ggccacccat tttgctaatg catttcagga 300

gagctgagcc agaaatggcc cggcagcccc catctccaag ccgcggtact cgaaaatcaa 360

tcaagacgcg gttgagaact caatgacact caaacaggca tgctcctcgg aataccaagg 420

agcgcaaggt gcgttcaaag attcgatgat tcactggaaa tctgcaattc acattactta 480

tcgcaattcg ctgcgttctt catcgatgcg agagccaaga gatccgttgc tgaaagttgt 540

attacatcat ttataacatc tatcattcta tggccatacg acgagggtga tcatgaatat 600

gatgaacata ggcccaccct ctttcgaagg cgagtctacc atggtgcaca ggtgtgagag 660

tgaacttgcg aacgagaaag gggaaagcga tggacgtgca cattgctccg tggacacaga 720

gccagcgaca gtctttttca cttcccttct tcctcgactc gcatgtttcg ataatgatcc 780

ttccgcaggt tcacctacgg aaacctgtcc attttttttt tctctctcaa acca 834

<210> 11

<211> 773

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 栎裸柄伞ITS基因序列

<400> 11

aacttctttg gaaatagtac tgttgctggc cttgtaatga ggtatgtgca cgtctattac 60

caatttattc atccacctgt gcactttttg taggagttct ttgaagttay tttgtacttg 120

tgcaatttgg ctttgaaagg cttctatgtc ttataaaccc attagtatgt ctctgaatgt 180

tttttattgg gacttgattg gccctttaaa cttgtacaac ttttagcaac ggatctcttg 240

gctctcccat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca 300

gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgccctctgg tattccggag ggcatgcctg 360

tttgagtgtc attaaattct caacttcaat agcttttact agcttattga tgcttggatg 420

tgggagcttg ctggcgtctt agatgttcgg ctctccttaa agttattagt ggaaacctct 480

ttgttggttt attccttagt gtgataatta tctacgctat gaataatcta atgttccatt 540

gagacttgag atttctcagt agaaatactg gtctgggtac tgcaattaaa tttgctgtat 600

ctgtaatctc tcagtagcaa tactggtttg ggcattgcaa ttaaatttgc tttacctgta 660

agtctcagag gaaaagaaaw gttctgcttt ctaaccgtct atgtatatag acaatttatt 720

gactatttga cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caa 773

Claims

1.一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组，其特征在于：所述引物组包括引物AconF、qAconR，其核苷酸序列为：

AconF：GTCTCTCTTCTTGCTTGTTTC，

qAconR：AAATCCAAAACACACTCAAAAAGAGC。

2.如权利要求1所述的用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组，其特征在于：还包括探针AconU，探针AconU的核苷酸序列为：AGGCAGCCTTGGCACTGTTCAGGT；

3.一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的引物组，还包含PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。

5.一种鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求1所述的引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，其中，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl、浓度为10μM的正反向引物各1μl、基因组DNA 1μl、余量为ddH₂O；

所述步骤2)中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。

8.一种鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求2所述的引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否含有环鳞鹅膏，如果Ct≤30则判断为环鳞鹅膏阳性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR的反应体系为：总体积20μl，其中2×T5 Fast qPCR Mix 10μl、浓度为10μM的引物AconF/qAconR各1μl、浓度为10μM的探针AconU 0.5μl、基因组DNA 1μl，余量为ddH₂O；qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环。

10.权利要求1或2所述的引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒在鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏中的应用。